Abstract
I biofilm sono considerati come uno dei temi più impegnativi della moderna biomedicina, e sono potenzialmente responsabili di oltre l'80% delle infezioni antibiotico-tolerant. I biofilm hanno mostrato un livello eccezionalmente alto di tolleranza per la chemioterapia, che è pensato per essere multifattoriale. Per esempio, la matrice fornisce una barriera fisica che diminuisce la penetrazione di antibiotici nel biofilm. Inoltre, le cellule all'interno dei biofilm sono fenotipicamente diverse. Probabilmente, biofilm resilienza deriva da una combinazione di questi e altri, ancora sconosciute, meccanismi. Tutti gli antibiotici attualmente esistenti sono stati sviluppati contro singole cellule-batteri (planctonici). Pertanto, finora, un repertorio molto limitato di molecole esiste che può selettivamente agire su biofilm maturi. Questa situazione ha portato un cambiamento di paradigma progressiva scoperta di nuovi farmaci, in cui la ricerca di anti-biofilm è stata invitata ad occupare un posto più prominente. Una sfida ulteriore è che ci sono unnumero di metodi standardizzati per la ricerca biofilm, in particolare quelli che possono essere utilizzati per lo screening su larga rendimento di librerie chimiche molto limitato. Qui, una piattaforma anti-biofilm sperimentale per lo screening chimico è presentato. Colorazione Esso utilizza tre metodi per misurare la vitalità del biofilm (con resazurina colorazione), biomassa totale (con colorazione cristallo viola), e la matrice del biofilm (utilizzando un agglutinine di germe di grano, WGA-fluorescenza a base di poli-N acetil-glucosamina, PNAG , frazione). Tutti i saggi sono stati sviluppati usando Staphylococcus aureus come i batteri modello. Esempi di come la piattaforma può essere utilizzata per lo screening primario e per la caratterizzazione funzionale identificati risultati anti-biofilm sono presentati. Questa sequenza sperimentale inoltre consentito la classificazione dei risultati basati sui punti finali misurati. Esso fornisce anche informazioni sulle loro modalità di azione, in particolare sul lungo termine rispetto agli effetti chemioterapici a breve termine. Pertanto, è molto advantageous per la rapida identificazione di composti di successo di alta qualità che possono servire come punto di partenza per varie applicazioni biomediche.
Introduction
I batteri possono passare tra due diversi stili di vita, planctonici e sessili, di cui un biofilm è l'esempio più comune. In biofilm, batteri formano comunità strutturate annegate in una matrice di auto-prodotto 1. Questa matrice autoprodotto è una barriera tra i batteri e l'ambiente esterno, e protegge le cellule microbiche, mantenendoli in prossimità. La composizione della matrice biofilm varia tra e persino all'interno delle specie, ma consiste principalmente di una fitta rete di lipopolisaccaridi, DNA extracellulare e proteine. La matrice serve come barriera fisica inibendo l'ingresso di agenti nocivi, ma protegge anche il biofilm dalla disidratazione e impedisce la fuoriuscita nutrienti cella 2.
I biofilm sono considerati come uno dei temi più impegnativi della moderna biomedicina, e sono presumibilmente responsabili di oltre l'80% delle infezioni antibiotico-tolerant 3. essi DISPgettare un intrinsecamente un'elevata tolleranza contro le minacce esterne: umidità, pressione osmotica, stress meccanico 4, calore, radiazioni UV 5, disinfettanti, agenti antimicrobici, e l'host del sistema immunitario 1. Ad esempio, la concentrazione dell'agente antimicrobico richiesto richiesto per uccidere un biofilm ha dimostrato di essere fino a 1000 volte superiore rispetto a quella richiesta per uccidere i batteri planctonici. La spiegazione di questa tolleranza superiore sembra essere multifattoriale. La matrice fornisce una barriera fisica che diminuisce la penetrazione di antibiotici nel biofilm. Inoltre, le cellule all'interno dei biofilm sono fenotipicamente diversi; la fase di transizione tra stati metabolici causa di un gradiente esistente di ossigeno, nutrienti e metaboliti tra le parti interne ed esterne del biofilm 6. Pertanto, in alcune regioni biofilm, come il nucleo, i batteri sono privati di ossigeno e nutrienti e vivono in un metabolicamente meno attivo o uno stato completamente dormiente
Da un methodologprospettiva iCal, esistono ulteriori sfide, come solo un numero limitato di metodi di biofilm sono stati sviluppati da organismi di normazione, in particolare quelle applicabili al high-throughput screening di librerie chimiche. Tutti i test standardizzati (con una sola eccezione) sono basate su reattori a biofilm, e questi metodi richiedono grandi volumi di lavoro e di grandi quantità di composti da testare, che di solito sono disponibili durante la fase iniziale di sperimentazione 9-12. Il test di screening-applicabile standardizzato solo esistente è il cosiddetto dispositivo Calgary Biofilm, da cui il sistema commercialmente disponibile minimo biofilm eliminando concentrazione (MBEC) è stato sviluppato 13-15. Tuttavia, la limitazione di questo saggio è che il biofilm sono coltivate su pioli, e non tutte le specie batteriche o anche ceppi della stessa specie sono in grado di formare biofilm su questo dispositivo. Inoltre, metodi che possono essere particolarmente applicati all'esplorazione di composti naturali sononecessario. Prodotti naturali sono stati la fonte principale per l'innovazione nella scoperta di farmaci antimicrobici nel corso dell'ultimo secolo 16. Essi possono fornire composti anti-biofilm nuovi meccanismi d'azione unici che possono anche essere efficaci contro le cellule persister. Così, l'esplorazione di librerie naturali e naturalmente ispirati ha alte probabilità di produrre cavi anti-biofilm promettenti e uniche.
Qui, presentiamo i dettagli sperimentali di una piattaforma di test che è stato sviluppato per la proiezione chimica dei composti anti-biofilm utilizzando tre metodi per misurare gli effetti sulla vitalità, biomassa totale, e la matrice di biofilm Staphylococcus aureus. Il primo test misura biofilm vitalità, e si basa su resazurina colorazione. Resazurina è una macchia redox che è blu e non fluorescente nel suo stato ossidato e si trasforma in rosa resorufina, altamente fluorescenti quando ridotto l'attività metabolica dei batteri. E 'molto semplice e veloce metodo adatto per proiezioni primari 17-20. Il secondo test, basato su cristalli colorazione violetta, misura massa totale biofilm. Cristallo viola è una macchia ampiamente utilizzato per lo studio di batteri e batteri nel biofilm 19,21-23. Il test è basato su reagenti poco costosi e ha una lettura semplice assorbanza finale. Infine, il terzo test rivolge la sostanza polimerica extracellulare (EPS) -matrix del biofilm tramite germe di grano agglutinina (WGA), che si lega specificamente alla poli- N residui acetil-glucosammina (PNAG) presenti nella matrice del biofilm stafilococciche 24. Il WGA è coniugato con un fluoroforo che può essere rilevato con i lettori intensità di fluorescenza 25. Vi presentiamo qui le motivazioni e dettagli della piattaforma abbiamo sviluppato, con esempi di applicazioni.
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Protocol
1. Crescere i batteri
- Pre-cultura i batteri durante la notte in un brodo di soia trittico (TSB) a 37 ° C con 220 giri al minuto scuotendo (16-18 ore).
- Diluire il pre-coltura 100-1.000 volte (a seconda del tasso di crescita dei batteri, qui, 1000 volte viene utilizzato per S. aureus) in fresco TSB e lasciate crescere a 37 ° C e 200 rpm per raggiungere crescita esponenziale (ottica densità a 595 nm (OD 595) tra 0,2 e 0,6).
NOTA: Questo passaggio richiede l'ottimizzazione specifica per ceppo.
2. formazione di biofilm: Pre e post-esposizione
- Diluire le esponenzialmente cresciute cultura 100 volte (questo equivale a circa 10 6 unità formanti colonia per millilitro (CFU / ml)).
- Protocollo di pre-esposizione
- Per i campioni di controllo non trattati, aggiungere 200 microlitri della coltura batterica diluito per pozzetto di una piastra da 96 micropozzetti sterile.
- Aggiungere 4 ml di un composto di prova o un controlloantibiotici (soluzione 50x magazzino) e 196 ml di coltura batterica diluito per pozzetto.
- Incubare a 37 ° C su un agitatore a 200 rpm per 18 ore.
Nota: Qui usiamo uno shaker con un'orbita 2 mm.
- Protocollo post-esposizione
- Per tutti i campioni, aggiungere 200 microlitri della coltura batterica diluito per pozzetto di una piastra da 96 micropozzetti sterile.
- Incubare a 37 ° C su un agitatore a 200 rpm per 18 ore.
Nota: Qui usiamo uno shaker con un'orbita 2 mm. - Rimuovere l'intera soluzione planctonici con attenzione, senza toccare il biofilm, usando una pipetta multicanale.
- Aggiungere 4 ml di un composto in esame o di un antibiotico di controllo (50x soluzione stock) e 196 ml di TSB per bene.
- Incubare a 37 ° C su un agitatore a 200 rpm per altre 24 ore.
Nota: Qui usiamo uno shaker con un'orbita 2 mm.
3. resazurina colorazione Protocol per la valutazione vitalità dei biofilm
- Preparare una soluzione stock di 0,1 mg / ml resazurina (0,4 mm) in PBS sterile. Mantenere questo stock sterili, al riparo dalla esposizione alla luce, e a 4 ° C.
- Diluire il resazurina magazzino 1:50 in sterile PBS (PBS) per ottenere una concentrazione finale di 20 micron.
- Trasferire l'intera soluzione planctonici (lasciando i biofilm nei pozzetti) con attenzione, senza toccare i biofilm o la creazione di bolle d'aria, ad una, pulire la piastra a 96 pozzetti separati con una pipetta multicanale.
- Lavare i biofilm una volta con PBS sterile con l'aggiunta di 200 pl per pozzetto, e rimuoverlo con cura utilizzando una pipetta multicanale.
- Aggiungere 200 microlitri della resazurina diluito per pozzetto della piastra di biofilm con una pipetta multicanale.
- Incubare al buio, a temperatura ambiente (RT), e 200 giri al minuto, l'agitazione per circa 20 minuti fino a quando i controlli non trattati biofilm sono uniformemente rosa.
- Misurare la fluorescenza aλ = exc 560 nm e λ em = 590 nm con un lettore di piastre (in alto lettura).
4. cristallo viola Protocollo di colorazione per la biomassa Quantificazione dei biofilm Utilizzando la stessa piastra come al punto 3
- Rimuovere la macchia resazurina con attenzione dai pozzi usando una pipetta multicanale.
- Fissare i biofilm con 200 ml di metanolo per 15 min.
- Lasciare la piastra aria secca per 10 minuti.
- Aggiungere 190 ml di 0,02% (vol / vol, diluito in acqua deionizzata) soluzione di cristallo viola, con cura usando una pipetta multicanale. Evitare di toccare i lati dei pozzetti con la macchia mentre pipettaggio e prevenire la formazione di bolle d'aria non premendo la pipetta per completare blow-out.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la macchia con attenzione, usando una pipetta multicanale.
- Lavare due volte con acqua deionizzata (200 ml ogni volta).
- Lasciate che i pozzi asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente e si dissolvono la macchia rimanentein 96% di etanolo o acido acetico 33%.
- Incubare per 1 ora a RT e leggere l'assorbanza a 595 nm.
5. Valutare l'effetto battericida sui batteri planctonici Utilizzando il piatto del campione Come per i biofilm
- Misurare la torbidità a 595 nm della piastra con la soluzione planctonici da 3.3.
- Colorare i batteri planctonici con resazurina con l'aggiunta di 10 ml di resazurina magazzino per pozzetto. Mescolare bene pipettando.
- Incubare è al buio a temperatura ambiente per circa 5 minuti, fino a quando i controlli non trattati sono uniformemente rosa.
- Misurare la fluorescenza a λ = exc 560 nm e λ em = 590 nm.
6. Germe di Grano Agglutinin colorazione per Matrix quantificazione e microscopia a fluorescenza Imaging di biofilm
- Matrix quantificazione
- Preparare una soluzione / ml 5 mcg della sonda WGA in PBS sterile.
- Utilizzare un pla campione paralleloTE per questa colorazione. Rimuovere la soluzione planctonici dai pozzetti e lavare una volta con PBS sterile (200 pl per pozzetto), con cura utilizzando una pipetta multicanale senza toccare i biofilm.
- Aggiungere 200 ml di soluzione di WGA per bene da colorare.
- Incubare è al buio a 4 ° C per 2 ore.
- Rimuovere la macchia non legato lavando i pozzetti con 200 ml di PBS per tre volte.
- Lasciare la piastra a secco per 15 minuti a RT.
- Sciogliere la macchia rilegato in acido acetico 33%, con 200 ul per pozzetto.
- Sigillare i pozzetti con tappi di strip e sonicare utilizzando un sonicatore bagnomaria per 30 secondi a temperatura ambiente e 40 kHz.
- Incubare la piastra per 1 ora a RT.
- Ripetere il passaggio sonicazione. I pozzi possono rimanere sigillato tra i gradini sonicazione.
- Misurare la fluorescenza a λ ex = 495 nm e λ em = 520 nm con un lettore di piastre (in alto lettura).
- Visualizzare la matrice conmicroscopia a fluorescenza
- Utilizzare lo stesso protocollo di cui sopra fino al punto 6.1.6.
- Dopo la fase di essiccazione, visualizzare i campioni con un microscopio a fluorescenza, utilizzando un filtro FITC (o altro idoneo filtro di eccitazione verde).
7. colorazione cellule vitali e morti all'interno del biofilm di Imaging con microscopia a fluorescenza e quantificazione del segnale per il Green-to-rosso-ratio (G / R)
- Imaging con microscopia a fluorescenza
- Preparare una soluzione di ogni sonda (cellule vitali uno di colorazione e le altre cellule morte una colorazione), secondo le linee guida del produttore.
- Rimuovere la soluzione planctonici dai pozzetti e lavare una volta con PBS sterile (200 ml per pozzetto) usando una pipetta multicanale.
- Aggiungere 6 ml di soluzione colorante per pozzetto.
- Incubare la piastra al buio per 15 minuti.
- Prima del microscopio, rimuovere il liquido in eccesso manually usando una pipetta multicanale.
- Catturare le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza, utilizzando ad esempio un filtro FITC (per fluorescenza verde, cellule vitali) o un filtro TRITC (fluorescenza rossa, cellule morte).
- Quantificazione del segnale come verde a rosso-fluorescenza ratio (G / R)
- Seguire lo stesso protocollo in passi 7.1.1 e 7.1.2.
- Aggiungere 200 microlitri della soluzione colorante per bene e incubare per 15 minuti al buio.
- Misurare la fluorescenza con un lettore di piastre a eccitazione lunghezza d'onda / emissione 485/535 nm e 485/635 per la fluorescenza verde e rosso, rispettivamente (Reading).
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Representative Results
Nella piattaforma proposta, gli effetti sulla vitalità, la biomassa, e la matrice del biofilm sono quantificati. Nella sequenza di lavoro (figura 1), una piastra campione viene trattata con resazurin e successivamente con cristalvioletto per valutare contemporaneamente gli effetti sulla vitalità batterica biofilm e sulla biomassa totale biofilm. Entrambi i saggi possono essere eseguite consecutivamente nella stessa piastra perché è stato dimostrato in precedenza che una prima colorazione con resazurin avuto alcun impatto statisticamente significativo sul risultato cristalvioletto colorazione (p = 0,4149 per il confronto di unità segnale di assorbanza massime tra piastre cristallo viola tinto separatamente o dopo resazurina-colorazione, n = 20) 26. L'effetto sui batteri planctonici possibile valutare contemporaneamente.
Quando colpi sono identificate sia dalla vitalità o il test basata sulla biomassa, un secondo piatto è st ained con la sonda WGA di quantificare l'effetto dei composti sulla componente polisaccaride (PNAG) della matrice biofilm. Questo flusso può essere applicata alla proiezione di librerie chimiche, nonché a studi di follow-up funzionali per misurazioni di potenza di composti hit, come esemplificato sotto.
Figura 1: Flusso di lavoro della piattaforma tre test. Rappresentazione schematica del flusso di lavoro combinando tre prove su campioni biofilm. La piattaforma include colorazione per un effetto sulla vitalità, la biomassa, e lo strato di EPS; immagini usando la microscopia a fluorescenza; e valutare l'effetto sulla fase planctonici. "A" e "NA" stand per, rispettivamente, "attivo" e "non attivo". Modificato da Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le prestazioni della piattaforma a tre test a fini di screening
Qui, due piste di screening sono mostrati come risultati rappresentativi delle prestazioni della piattaforma. Nella prima campagna (Figura 2A), una piccola biblioteca di derivati alcaloidi Cinchona è stato proiettato per l'attività anti-biofilm contro S. aureus biofilm 27, mentre nel secondo esempio (Figura 2B), una biblioteca naturale e naturalmente ispirata di abietano-tipo diterpenoidi e derivati è stata esplorata 28,29. I colpi attivi sono stati determinati utilizzando i limiti di successo calcolati (soglie; Equazione 6, tabella 1). In ciascuno studio di screening, i risultati dei primi due saggi correlati molto bene; i risultati erano in grado di ridurre la vitalità e la biomassa biofilm, wentre i composti inattivi non ha mostrato alcun effetto su entrambi i test. Tutti i colpi sono stati identificati poi testato sul terzo saggio (WGA), ma non ha avuto effetti matrice-smontaggio (o matrice-degradanti) (risultati non mostrati).
Figura 2: I risultati rappresentativi delle campagne di screening che utilizzano la piattaforma con biofilm S. aureus. Due esempi di schermate di validazione proof-of-concept eseguite utilizzando la piattaforma di test. I risultati sono presentati come percentuale del controllo non trattato biofilm, i composti hit sono indicati in rosso, e le linee rappresentano i limiti hit calcolati. (A) La proiezione di una libreria derivato china-alcaloide identificato un composto attivo. (B) La proiezione di una libreria di diterpenoidi abietano tipo e derivati identificato cinque atticomposti Ive. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le prestazioni della piattaforma a tre test per il follow-up Studies
Risultati rappresentativi può essere visto in Figura 3, dove due antibiotici noti sono stati provati ad una gamma molto ampia di concentrazioni (0,5 nM-5 mM) contro biofilm S. aureus. Minimi valori di concentrazione inibente (MIC) di composti di riferimento contro batteri planctonici (sia dalla letteratura o eseguite in laboratorio) servono come linee guida per la scelta delle concentrazioni di testare contro biofilm della stessa specie. Inoltre, la conoscenza dei valori di concentrazione in cui viene rilevata alcuna citotossicità in cellule di mammifero può anche aiutare nella scelta della concentrazione per verificare anti-biofilm di follow-up. Idealmente,se sono disponibili sia dati antimicrobici e citotossicità di un determinato composto, un parametro noto come "biocompatibilità Index" (BI) può essere calcolato, come definito da Müller e Kramer 30. Qui, valori di MIC contro planctonici S. aureus per la penicillina G e la ciprofloxacina sono stati determinati per essere 0,04 micron e 6 micron, rispettivamente (risultati non mostrati). Così, l'intervallo di concentrazione varia da circa 10 x 5 MIC a 10 -2 x MIC e 10 3 x MIC per 10 -4 x MIC rispettivamente penicillina e ciprofloxacina,. Entrambi gli antibiotici potrebbero ridurre in modo significativo la vitalità, la biomassa, e la matrice del biofilm contenuti PNAG quando sono stati esposti ai batteri monocellulari prima dell'inizio del processo di formazione del biofilm (Figura 3a). Tuttavia, nonostante l'elevata concentrazione di antibiotici testati su preformati (18 hr) biofilm, la vitalità e la biomassa sono stati ridotti solo a circa il 50% di tTubo di biofilm non trattati (figura 3b). Il risultato più importante qui è stato l'incremento della matrice biofilm (a oltre 200%) quando biofilm preformati sono state trattate con concentrazioni elevate di penicillina G non sono stati rilevati cambiamenti nel contenuto della matrice biofilm quando biofilm preformati sono stati trattati con ciprofloxacina.
Figura 3: esempio di uno studio di follow-up di effetti anti-biofilm utilizzando due antibiotici modello contro i biofilm S. aureus. Gli effetti della penicillina G e la ciprofloxacina sono presentati qui: (A) prima di biofilm formazione (pre-esposizione) e (B) la formazione post-biofilm (post-esposizione). Per la figura di chiarezza, solo sono mostrati il più basso e più alte concentrazioni testate. Le deviazioni standard non superano il 20%. *** Equals p <0.01. Modificato da Skogman et al. 26 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Imaging microscopia a fluorescenza a base di
Il risultato che la penicillina G a 400 pM (così come concentrazioni più elevate, come mostrato in Figura 3b) uccide circa il 50% della popolazione batterica biofilm S. aureus preformato è stato confermato con un altro test di vitalità colorazione. La media dei (G / R) rapporti di fluorescenza verde-to-rosso per i pozzi di biofilm non trattati è stato 2,75, indicando una predominanza di cellule vive (verde-macchiato), su cellule morte (rosso-macchiato). Tuttavia, in cellule penicillina trattato il / rapporto G R diminuito a 1,54, corrispondente al 56% dei pozzetti di controllo. Le cellule rimanenti vivo dopo il trattamento di penicillina prodotto significativamente maggiore quantità di EPS, come giudicato dal aumento nella verde (WGA) fluorescenza rispetto a biofilm non trattate (Figura 4b). Si consiglia, quando possibile, di effettuare questi esperimenti di imaging-based per confermare ulteriormente i risultati della piattaforma, in particolare durante la fase di caratterizzazione dei candidati di successo.
Figura 4: microscopia a fluorescenza. L'effetto della penicillina aggiunta (400 micron) sulla vitalità e EPS di produzione sono riportati qui. Le immagini superiore (A) corrispondono a biofilm non trattati e biofilm penicillina-trattati, in cui le cellule vitali sono colorate le cellule verdi e morti sono macchiate di rosso. Il grafico inserito illustra i calcoli dei rapporti di fluorescenza G / R. Le immagini inferiore (B) corrispondono a biofilm non trattati e la penicillinacellule -treated colorate con la sonda WGA. Il grafico inserito presenta la quantificazione dei segnali WGA per campioni biofilm trattati e non trattati, e barre di errore rappresentano le deviazioni standard. Modificato da Skogman et al. 26 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Elaborazione dati e analisi statistiche
parametri statistici sono calcolati per caratterizzare la qualità dei saggi e di seguire le loro prestazioni durante le esecuzioni di screening. Le equazioni dei parametri più importanti utilizzati, nonché i valori ottenuti e di destinazione, sono elencati in Tabella 1. In tutte le equazioni, min SD, μ min, max SD, e μ max rappresentano le deviazioni standard e gli strumenti del minimo(Min) e segnali massimo (max), rispettivamente. Nei risultati qui riportati, accoppiati confronti dei valori originali sono state fatte con una t-test spaiato con la correzione di Welch, dove p <0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
Tabella 1: Parametri statistici utilizzati per valutare le prestazioni dei dosaggi. In tutte le equazioni, min SD, μ min, max SD, e μ max rappresentano le deviazioni standard e gli strumenti del minimo (min) e segnali massimo (max), rispettivamente. I RES metodi di colorazione, resazurina, viola cristallo, e germe di grano agglutinin, sono abbreviati, CrV, e WGA, rispettivamente. RFU: unità di fluorescenza relativi; RAU: unità di assorbanza relativi. Clicca qui per scaricare il file.
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Discussion
Non esiste un unico metodo che può misurare simultaneamente l'effetto di un composto sulla viabilità, biomassa e matrice di biofilm. Pertanto, vi è la necessità per combinare saggi per rilevare un effetto sui tre endpoint, preferibilmente in una fase screening primario.
Resazurina è molto semplice protocollo di colorazione costituito solo l'aggiunta della sonda redox. Tuttavia, stabilire il tempo di incubazione ottimale dei biofilm con il resazurina è cruciale per il successo di questo test. In alcuni ceppi batterici, la riduzione della sonda resazurina al resorufina rosa, fluorescente avviene molto rapidamente, mentre in altri può durare diverse ore 19. Inoltre, all'interno dello stesso ceppo batterico, ci possono essere anche differenze significative tra i batteri planctonici e biofilm. I batteri planctonici sono in genere più facilmente raggiungibili, soprattutto perché la densità batterica è più bassa nelle popolazioni planctoniche che nel biofilm Populations, che promuove il fatturato più veloce della reazione. In un confronto pubblicato di sonde di colorazione biofilm vitalità, resazurina è concluso per essere uno dei più precisi, semplici da usare e meno costosi test 19. Inoltre, è stato dimostrato di essere applicabile ad una gamma di organismi batterici e fungini 19. D'altra parte, il saggio cristalvioletto è il più ampiamente usato per la quantificazione di massa biofilm 19,32,33. Le fasi più critiche di questo protocollo sono l'aggiunta e la rimozione della soluzione di cristal violetto macchia. Questi passaggi devono essere condotte con molta attenzione per evitare colorazione non specifica (ad esempio, a causa di gocce di macchie sulle pareti dei pozzetti). Uno dei principali vantaggi di utilizzare resazurina come il test di colorazione iniziale è il fatto che esso non è tossico per le cellule, che consente l'utilizzo della stessa piastra per la colorazione cristalvioletto. La combinazione di entrambi i saggi semplifica notevolmente il flusso di lavoro, riduce i costi, risparmiare Consumables, e minimizza l'uso dei composti in esame, che è particolarmente utile in un ambiente di screening.
Come indicato in precedenza, la matrice extracellulare polisaccaride autoprodotto è una componente essenziale di biofilm. Per misurare il contenuto di matrice (in particolare polisaccaridi essenziali), un terzo saggio è stato incluso qui, sulla base di fluorescenza etichettati WGA. Originariamente la quantificazione WGA è stato descritto come un saggio lectina-assorbente enzimatico (ELLA) 24. Un test simile sulla base di glicosaminoglicani (GAG) colorazione nella matrice del biofilm di S. aureus con blu metilmetilene (DMMB) è stato utilizzato anche 31,34. GAG sono simili alle adesine intercellulari polisaccaridiche (PIA) in matrice di Staphylococcus spp. biofilm 35. Il WGA-test analogamente obiettivi Pias, ma WGA più specificamente si lega alla poli- N residui acetil-glucosamina, che svolgono un ruolo essenziale nella matrice biofilm 36 </ Sup>. Targeting la matrice è di grande importanza per il fatto che biofilm possono facilmente ricrescere se la matrice viene lasciato dopo un trattamento chimico o antibiotici. I batteri possono anche più facilmente collegare ad una superficie che è di matrice pre-rivestite 35. E 'stato dimostrato che alcuni antibiotici possono ridurre efficacemente la vitalità e biofilm biomassa, ma senza alcun effetto sulla matrice. Nei nostri esperimenti, questo è esemplificato dal caso di ciprofloxacina 31. Alcuni antibiotici possono anche aumentare la produzione di matrice, come dimostrato qui con penicillina G 26. Sulla base di questi cambiamenti, gli antibiotici possono essere classificati in categorie elencate nella tabella 2. Tutti i successi nei nostri studi di screening (Figura 2) possono essere classificati, insieme con la ciprofloxacina, come composti che uccidono i batteri nel biofilm e riducono la biomassa, ma non smontare o disturbare la matrice del biofilm.
| Categoria | Effetto sui batteri | Effetto su matrice | Esempio antibiotico (target biofilm) | Riferimento |
| 1 | nessuna | nessuna | ampicillina (SA) | (Tote et al. 2009) |
| 2 | nessuna | - | cefalotina (SA) | (Tote et al. 2009) |
| 3 | - | nessuna | polimixina (SA) | (Tote et al. 2009) |
| 4 | - | - | kanamicina (PA) | (Tote et al. 2009) |
| ciprofloxacina (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doxiciclina (PA) | (Tote et al. 2009) |
| 6 | - | + | penicillina G (SA, CE) | (Skogman et al. 2012) |
Tabella 2: Classificazione degli antibiotici. Gli antibiotici sono suddivisi in categorie in base al loro effetto sulla vitalità dei batteri biofilm (utilizzando resazurina colorazione) e la matrice (utilizzando WGA o metilmetilene blu () colorazione DMMB). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; CE: Escherichia coli. Modificato da tote et al. 31
Inoltre, questa piattaforma è ideale per l'esecuzione di campagne di screening primario. La strategia più in termini di costi e di tempo-efficace è quello di applicare saggi viola a base di resazurina e cristalline come una strategia di primo livello e di passare al test WGA-matrice di secondo livello (follow-up) di studi. Ciò è dovuto al fatto che la sonda WGA è piuttosto costoso e che questo test comprende diverse fasi, che rende più laboriosa e che richiede tempo.
Una caratteristica rilevante di questa piattaforma è la possibilità di valutare gli effetti a lungo termine degli antimicrobici identificati. effetti chemioterapici a lungo termine possono essere raggiunti solo se la matrice del biofilm è smontato. E 'stato dimostrato che il rischio di rianimazione dell'infezione biofilm è molto più alto se la matrice è lasciato dietro. Con questa piattaforma, è possibile valutare prima se la biomassa complessiva biofilm è influenzata usando colorazione cristallo violetto. Un altro dla valutazione Nell'odontoiatria dei polisaccaridi della matrice del biofilm, usando il saggio WGA, può seguire. Da segnalare la probabilità di identificare una singola molecola che può sia smontare la matrice ed esercitare antibatterico (biocidi) effetti possono essere considerati partire. Infatti, finora, gli unici composti di questo tipo che abbiamo identificato sono peptidi antimicrobici 37. Per far fronte a questo, il follow-up vengono eseguite in questa piattaforma sia con colpi resazurin- o cristallo viola-attiva, dal momento che questa strategia consente l'identificazione di composti con biocida separata o attività matrice degradante. Tali cavi possono essere potenzialmente interessanti per le strategie multicomponente. Una combinazione di molecole della matrice-degradare con composti biocidi o antibiotico-tipo dovrebbe fornire eradicazione biofilm più efficiente.
In sintesi, la piattaforma qui presentata costituisce una buona base per lo screening anti-biofilm utilizzando misure di vitalità e biomasse con matrice di quantificazionecazione e visualizzazione. Entrambi i saggi di colorazione resazurina e viola cristallo può essere utilizzato anche per altri tipi di microrganismi che formano biofilm-. Tuttavia, questi test richiedono ottimizzazione separato per entrambe le condizioni di crescita e di colorazione. L'applicabilità del test di colorazione WGA è limitata a quei batteri in cui il poli N-acetil-glucosamina è un componente principale della matrice biofilm. Altri saggi matrice di quantificazione (come quello basato su dimetil-metilene colorazione blu) possono essere applicati in altri casi. Complessivamente, i saggi di questa piattaforma sono abbastanza facili da eseguire, e tutti i reagenti sono facilmente disponibili così come in genere a prezzi accessibili. Questa piattaforma è adatto per lo screening bassa medio-throughput anti-biofilm, senza la necessità di costosi investimenti in apparecchiature.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano il professor Paul Cos e LMPH, Università di Anversa, in Belgio per il suo supporto durante il processo di ripresa nel suo laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dalla Academy of Finland progetti (progetti 272.266 e 282.981) e Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandia. I contributi tecnici del Master Janni Kujala sono riconosciuti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
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