Abstract
Las biopelículas son considerados como uno de los temas más desafiantes de la biomedicina moderna, y son potencialmente responsables de más del 80% de las infecciones con antibióticos tolerantes. Biofilms han mostrado una tolerancia excepcionalmente alta para la quimioterapia, que se cree que es multifactorial. Por ejemplo, la matriz proporciona una barrera física que disminuye la penetración de los antibióticos en el biofilm. Además, las células dentro de los biofilms son fenotípicamente diversa. Probablemente, la capacidad de recuperación de biopelícula surge de una combinación de estos y otros, todavía desconocidos, mecanismos. Todos los antibióticos existentes en la actualidad se han desarrollado contra-unicelulares (bacterias planctónicas). Por lo tanto, hasta el momento, un repertorio muy limitado de moléculas existe que pueden actuar selectivamente sobre biofilms maduros. Esta situación ha llevado a un cambio de paradigma progresivo en el descubrimiento de fármacos, en la que se ha instado a la búsqueda de anti-biopelículas a ocupar un lugar más prominente. Un reto adicional es que hay unanúmero de métodos estandarizados para la investigación de biopelículas, especialmente aquellos que pueden ser utilizados para el cribado a gran rendimiento de bibliotecas químicas muy limitado. Aquí, se presenta una plataforma anti-biofilm experimental para la detección química. Utiliza tres ensayos para medir la viabilidad biofilm (con la tinción de la resazurina), la biomasa total (con tinción con violeta cristal), y la matriz de la biopelícula (usando una aglutinina de germen de trigo, basado-WGA-fluorescencia de tinción de la poli- N -acetil-glucosamina, PNAG , fracción). Todos los ensayos se desarrollaron utilizando Staphylococcus aureus como bacteria modelo. Se presentan ejemplos de cómo la plataforma puede ser utilizado para el cribado primario, así como para la caracterización funcional de los accesos identificados anti-biopelícula. Esta secuencia experimental permite además para la clasificación de los golpes sobre la base de los puntos finales medidos. También proporciona información sobre su modo de acción, especialmente en el largo plazo frente a los efectos de quimioterapia a corto plazo. Por lo tanto, es muy Advantageous para la identificación rápida de los compuestos de golpe de alta calidad que pueden servir como puntos de partida para diversas aplicaciones biomédicas.
Introduction
Las bacterias pueden cambiar entre dos estilos de vida muy diferentes, planctónicas y sésiles, de los cuales un biofilm es el ejemplo más común. En biofilms, las bacterias forman comunidades estructuradas embebidas en una matriz de producción propia 1. Esta matriz de producción propia es una barrera entre las bacterias y su entorno exterior, y protege las células microbianas, manteniéndolos en las proximidades. La composición de la matriz del biofilm varía entre, e incluso dentro de cada especie, pero en su mayoría se compone de una estrecha red de lipopolisacáridos, ADN extracelular y proteínas. La matriz sirve como una barrera física la inhibición de la entrada de agentes nocivos, sino que también protege la biopelícula de la deshidratación y evita que los nutrientes se escape de la célula 2.
Las biopelículas son considerados como uno de los temas más desafiantes de la biomedicina moderna, y son supuestamente responsables de más del 80% de las infecciones con antibióticos tolerantes a 3. ellos DISPestablecer una tolerancia inherentemente alta contra las amenazas externas: humedad, presión osmótica, el estrés mecánico 4, calor, radiación UV 5, desinfectantes, agentes antimicrobianos, y el sistema inmune del huésped 1. Por ejemplo, la concentración de agente antimicrobiano necesaria requerida para matar un biofilm ha demostrado ser hasta 1.000 veces mayor en comparación con la requerida para matar a las bacterias planctónicas. La explicación de esta mayor tolerancia parece ser multifactorial. La matriz proporciona una barrera física que disminuye la penetración de los antibióticos en el biofilm. Además, las células dentro de los biofilms son fenotípicamente diversa; su transición entre los diferentes estados metabólicos debido a un gradiente existente de oxígeno, nutrientes y metabolitos entre las partes interior y exterior de la biopelícula 6. Por lo tanto, en algunas regiones del biofilm, como el núcleo, las bacterias son privadas de oxígeno y nutrientes y viven en un metabólicamente menos activo o un estado completamente inactivos
Desde un METODOLOGÍAical perspectiva, existen retos adicionales, ya que sólo un número limitado de métodos de biopelícula han sido desarrollados por organizaciones de normalización, en especial los aplicables a la selección de alto rendimiento de bibliotecas químicas. Todos los ensayos estandarizados (con una sola excepción) se basan en los reactores de biopelícula, y estos métodos requieren grandes volúmenes de trabajo y grandes cantidades de compuestos a ensayar, que son por lo general no está disponible durante la fase de investigación temprana 9-12. El ensayo de cribado-aplicable estandarizado única existente es el llamado dispositivo de Calgary Biofilm, de la que el sistema disponible en el mercado mínimo biofilm eliminación de concentración (MBEC) se desarrolló 13-15. Sin embargo, la limitación de este ensayo es que los biofilms se cultivan en las clavijas, y no todas las especies bacterianas o incluso cepas de la misma especie son capaces de formar biopelículas en este dispositivo. Además, los métodos que se pueden aplicar en particular a la exploración de compuestos naturales sonnecesario. Los productos naturales han sido la principal fuente de innovación en el descubrimiento de fármacos antimicrobianos en el último siglo 16. Ellos pueden proporcionar nuevos compuestos anti-biopelícula con mecanismos de acción únicos que también pueden ser eficaces contra las células persister. Por lo tanto, la exploración de bibliotecas naturales y naturalmente inspirados tiene grandes posibilidades de producir cables anti-biopelícula prometedores y únicos.
A continuación, presentamos los detalles experimentales de una plataforma de ensayos que fue desarrollado para la detección química de los compuestos anti-biopelículas utilizando tres pruebas para medir los efectos sobre la viabilidad, la biomasa total, y la matriz del biofilm de Staphylococcus aureus. La primera ensayo mide la viabilidad biofilm, y se basa en la tinción resazurina. La resazurina es una mancha redox que es azul y no fluorescente en su estado oxidado y se convierte en resorufina rosa, altamente fluorescente cuando se reduce por la actividad metabólica de las bacterias. Es un m muy simple y rápidoétodo adecuado para pruebas de detección primaria 17-20. El segundo ensayo, basado en la tinción de cristal violeta, mide la masa total de biofilm. El cristal violeta es una mancha muy utilizado para el estudio de las bacterias y las bacterias en las biopelículas 19,21-23. El ensayo se basa en reactivos baratos y tiene un simple lectura de la absorbancia de punto final. Por último, la tercera ensayo se dirige a la -matrix extracelular sustancia polimérica (EPS) de la biopelícula a través de aglutinina de germen de trigo (WGA), que se une específicamente a poli- N -acetil residuos-glucosamina (PNAG) presentes en la matriz de las biopelículas estafilocócicas 24. El WGA está conjugado con un fluoróforo que puede ser detectada mediante lectores de intensidad de fluorescencia 25. Presentamos aquí los razonamientos y detalles de la plataforma que hemos desarrollado, incluyendo ejemplos de aplicaciones.
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Protocol
1. crecer la bacteria
- Precultivo las bacterias durante la noche en un caldo de soja tríptico (TSB) a 37 ° C con 220 rpm de agitación (16-18 h).
- Diluir el precultivo 100-1.000 veces (dependiendo de la tasa de crecimiento de las bacterias; aquí, 1.000 veces se utiliza para S. aureus) en TSB fresco y se deja crecer a 37 ° C y 200 rpm para llegar a un crecimiento exponencial (óptico densidad a 595 nm (OD 595) entre 0,2 y 0,6).
NOTA: Este paso requiere la optimización específica de la cepa.
2. La formación de biopelículas: pre y post-exposición
- Diluir las exponencial cultivadas cultivo de 100 veces (esto es igual a aproximadamente 10 6 unidades formadoras de colonias por mililitro (CFU / ml)).
- Protocolo de Pre-exposición
- Para las muestras de control sin tratar, añadir 200 l de cultivo bacteriano diluido por pocillo de una placa de 96 micropocillos estéril.
- Añadir 4 l de un compuesto de ensayo o un control deantibióticos (50x solución de valores) y 196 l de cultivo bacteriano diluido por pocillo.
- Incubar a 37 ° C en un agitador de placas a 200 rpm durante 18 horas.
Nota: Aquí se utiliza un agitador con una órbita de 2 mm.
- Protocolo post-exposición
- Para todas las muestras, añadir 200 l de cultivo bacteriano diluido por pocillo de una placa de 96 micropocillos estéril.
- Incubar a 37 ° C en un agitador de placas a 200 rpm durante 18 horas.
Nota: Aquí se utiliza un agitador con una órbita de 2 mm. - Retire toda la solución planctónicas con cuidado, sin tocar la biopelícula, usando una pipeta multicanal.
- Añadir 4 l de un compuesto de ensayo o un antibiótico de control (50x solución madre) y 196 l de TSB por pocillo.
- Incubar a 37 ° C en un agitador de placas a 200 rpm durante 24 horas más.
Nota: Aquí se utiliza un agitador con una órbita de 2 mm.
3. La resazurina tinción protocol para la Evaluación de Viabilidad de biopelículas
- Preparar una solución madre de 0,1 mg / ml de resazurina (0,4 mM) en PBS estéril. Mantener esta población estéril, protegido de la luz, y a 4 ° C.
- Diluir la resazurina de la 1:50 en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) para conseguir una concentración final de 20 mM.
- Transferir la totalidad de la solución planctónicas (dejando las biopelículas en los pozos) con cuidado, sin tocar los biofilms o la creación de burbujas de aire, a una limpia placa separada, de 96 pocillos usando una pipeta multicanal.
- Se lavan las biopelículas una vez con PBS estéril mediante la adición de 200 l por pocillo, y retirarlo con cuidado usando una pipeta multicanal.
- Añadir 200 l de la resazurina diluida por pocillo de la placa de biofilm usando una pipeta multicanal.
- Incubar en la oscuridad, a temperatura ambiente (RT), y 200 rpm, agitando durante aproximadamente 20 min hasta que los controles no tratados biofilm son uniformemente de color rosa.
- Medir la fluorescencia aλ exc = 560 nm y λ em = 590 nm con un lector de placas (arriba a la lectura).
4. Cristal Violeta protocolo de tinción de Biomasa La cuantificación de biopelículas Usando el mismo plato como en el paso 3
- Quitar la mancha resazurina cuidadosamente de los pozos utilizando una pipeta multicanal.
- Fijar los biofilms con 200 l de metanol durante 15 min.
- Deje que la placa de aire seco durante 10 minutos.
- Añadir 190 l de 0,02% (vol / vol, se diluyó en agua desionizada) solución de cristal violeta, con cuidado usando una pipeta multicanal. Evitar tocar los lados de los pocillos con la mancha mientras pipeteado y evitar la formación de burbujas de aire no presionando la pipeta para completar de soplado.
- Incubar durante 5 min a TA.
- Quitar la mancha con cuidado, usando una pipeta multicanal.
- Lavar dos veces con agua desionizada (200 l cada vez).
- Deje que los pozos se secan durante 5 minutos a temperatura ambiente y se disuelven la mancha restanteen 96% de etanol o ácido acético 33%.
- Incubar durante 1 hora a RT y leer la absorbancia a 595 nm.
5. Evaluar el efecto bactericida sobre las bacterias planctónicas utilizando la placa misma muestra que para las biopelículas
- Medir la turbidez a 595 nm de la placa con la solución de 3,3 planctónicas.
- Teñir las bacterias planctónicas con resazurina mediante la adición de 10 l de la población de resazurina por pocillo. Mezclar bien con la pipeta.
- Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 min, hasta que los controles no tratados son uniformemente de color rosa.
- Medir la fluorescencia a λ exc = 560 nm y λ em = 590 nm.
6. trigo aglutinina de germen de tinción para la matriz de cuantificación y la fluorescencia de imágenes de microscopía de biopelículas
- la cuantificación de la matriz
- Preparar una solución / ml 5 g de la sonda WGA en PBS estéril.
- Use un pla muestra paralelaET para esta tinción. Eliminar la solución de planctónicas de los pocillos y lavar una vez con PBS estéril (200 l por pocillo), utilizando una pipeta multicanal cuidadosamente sin tocar las biopelículas.
- Añadir 200 l de solución de WGA por pozo se manche.
- Incubar en la oscuridad a 4 ° C durante 2 horas.
- Retire el exceso de colorante lavando los pocillos con 200 l de PBS tres veces.
- Deje que la placa seca durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Disolver la mancha unido en ácido acético 33%, utilizando 200 l por pocillo.
- Sellar los pozos con tapas de tira y someter a ultrasonidos utilizando un aparato de ultrasonidos baño de agua durante 30 segundos a temperatura ambiente y 40 kHz.
- Incubar la placa durante 1 hora a RT.
- Repetir la etapa de sonicación. Los pozos pueden permanecer sellados entre las etapas de sonicación.
- Medir la fluorescencia a λ ex = 495 nm y λ em = 520 nm con un lector de placas (arriba a la lectura).
- La visualización de la matriz conmicroscopio fluorescente
- Utilizar el mismo protocolo que el anterior hasta el paso 6.1.6.
- Después de la etapa de secado, visualizar las muestras con un microscopio de fluorescencia, usando un filtro FITC (u otro filtro de excitación verde adecuado).
7. tinción de las células viables y muertas dentro de las biopelículas de Imagen con microscopía de fluorescencia y la cuantificación de la señal para la relación-verde-rojo-a (V / R)
- Imaging con microscopía de fluorescencia
- Se prepara una solución de cada sonda (células viables uno de tinción y las otras células muertas uno de tinción), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Eliminar la solución de planctónicas de los pocillos y lavar una vez con PBS estéril (200 l por pocillo) usando una pipeta multicanal.
- Añadir 6 l de la solución de tinción por pozo.
- Se incuba la placa en la oscuridad durante 15 min.
- Antes de la microscopia, retirar el exceso de líquido manualmente usando una pipeta multicanal.
- Capturar las imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia, utilizando, por ejemplo un filtro FITC (para fluorescencia verde, células viables) o un filtro TRITC (fluorescencia roja, las células muertas).
- La cuantificación de la señal como una proporción de verde a rojo en la fluorescencia (G / R)
- Seguir el mismo protocolo que en los pasos 7.1.1 y 7.1.2.
- Añadir 200 l de la solución de tinción por pozo y se incuba durante 15 min en la oscuridad.
- Medir la fluorescencia con un lector de placas a longitudes de onda / emisión de excitación 485/535 nm y 485/635 de la fluorescencia verde y roja, respectivamente (lectura superior).
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Representative Results
En la plataforma propuesta, se cuantifican los efectos sobre la biomasa, y la matriz del biofilm viabilidad. En la secuencia de trabajo (Figura 1), una placa de la muestra se tiñe con resazurina y posteriormente con cristal violeta para evaluar simultáneamente los efectos sobre la viabilidad biofilm bacteriano y en la biomasa total biofilm. Ambos ensayos se pueden realizar de forma consecutiva en la misma placa, ya que se ha demostrado anteriormente que una primera tinción con resazurina no tuvo un impacto estadísticamente significativo sobre el resultado de la tinción de cristal violeta (p = 0,4149 para la comparación de las unidades de la señal de absorbancia máxima entre las placas de cristal violeta manchado por separado o después de resazurina-tinción, n = 20) 26. El efecto sobre las bacterias planctónicas puede evaluarse de forma simultánea.
Cuando los accesos se identifican ya sea de la viabilidad o el ensayo basado en la biomasa, una segunda placa es st ained con la sonda de WGA para cuantificar el efecto de los compuestos sobre el componente polisacárido (PNAG) de la matriz de la biopelícula. Este flujo de trabajo se puede aplicar a la selección de bibliotecas químicas, así como para los estudios de seguimiento funcionales para las mediciones de potencia de los compuestos de golpe, como se ejemplifica a continuación.
Figura 1: Flujo de trabajo de la plataforma de tres ensayo. Representación esquemática del flujo de trabajo la combinación de los tres ensayos en muestras de biofilm. La plataforma incluye tinción para un efecto sobre la viabilidad, la biomasa, y la capa de EPS; de formación de imágenes usando microscopía de fluorescencia; y evaluar el efecto sobre la fase planctónica. "A" y "ND" significa "activo" y "no activo", respectivamente. Modificado de Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Rendimiento de la Plataforma de tres ensayo para fines de selección
Aquí, dos carreras de detección se muestran como resultados representativos del rendimiento de la plataforma. En la primera campaña (Figura 2A), una pequeña biblioteca de derivados de alcaloides de la cinchona se proyectó para la actividad anti-biopelícula frente a S. aureus biopelículas de 27 años, mientras que en el segundo ejemplo (Figura 2B), una biblioteca natural y naturalmente inspirada de tipo abietano diterpenos y derivados se exploró 28,29. Los accesos activos se determinaron según los límites calculados de golpe (umbrales; la ecuación 6, Tabla 1). En cada estudio de cribado, los resultados de los dos primeros ensayos se correlacionaron muy bien; los golpes eran todos capaces de reducir la viabilidad y la biomasa de biopelícula, while los compuestos inactivos no mostró ningún efecto en ninguno de los ensayos. Todos los accesos identificados se ensayaron después en el tercer ensayo (WGA), pero no tenían efectos de matriz-desmontaje (o degradante de la matriz) (resultados no mostrados).
Figura 2: Los resultados representativos de las campañas de cribado que utilizan la plataforma con las biopelículas de S. aureus. Dos ejemplos de pantallas de validación de prueba de concepto realizaron utilizando la plataforma de ensayo. Los resultados se presentan como un porcentaje del control no tratado biofilm, los compuestos de golpe se indican en rojo, y las líneas representan los límites de golpe calculados. (A) El cribado de una biblioteca derivado cinchona-alcaloide identificado un compuesto activo. (B) El análisis de una biblioteca de diterpenos de tipo abietano y derivados identificado cinco actoscompuestos IVE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Rendimiento de la Plataforma de tres ensayo para estudios de seguimiento
Los resultados representativos se pueden ver en la figura 3, donde se ensayaron dos antibióticos conocidos en un muy amplio intervalo de concentraciones (0,5 nM-5 mM) contra las biopelículas de S. aureus. Los valores mínimos de concentración inhibitoria (CMI) de los compuestos de referencia contra las bacterias planctónicas (ya sea por la literatura o realizados en el laboratorio) sirven como directrices para la elección de las concentraciones que se prueba contra las biopelículas de la misma especie. Además, el conocimiento de los valores de concentración en el que se detecta ninguna citotoxicidad en células de mamífero también puede ayudar en la selección de la concentración para la prueba de anti-biopelícula seguimientos. Idealmente,si están disponibles tanto los datos antimicrobianos y la citotoxicidad de un compuesto determinado, un parámetro conocido como el "índice de Biocompatibilidad" (BI) se puede calcular, como se define por Müller y Kramer 30. Aquí, se determinaron los valores MIC contra planctónicas S. aureus para la penicilina G y ciprofloxacina a 0,04 M y 6 M, respectivamente (resultados no mostrados). Por lo tanto, el intervalo de concentración varió de aproximadamente 10 5 x MIC a 10 -2 x MIC y 10 3 x MIC a 10 -4 x MIC para la penicilina y la ciprofloxacina, respectivamente. Ambos antibióticos podrían disminuir significativamente el contenido de PNAG viabilidad, la biomasa, y la matriz de la biopelícula cuando fueron expuestos a las bacterias unicelulares antes de la iniciación del proceso de la formación de biopelículas (Figura 3a). Sin embargo, a pesar de la muy alta concentración de antibióticos probados en biofilms (18 hr) preformadas, la viabilidad y la biomasa fueron sólo redujeron a aproximadamente 50% de tmanguera de biopelículas no tratados (figura 3b). El resultado más importante aquí fue el aumento de la matriz de la biopelícula (a más de 200%) cuando biofilms preformados fueron tratados con altas concentraciones de penicilina G. No se detectaron cambios en el contenido de la matriz de la biopelícula cuando biofilms preformados fueron tratados con ciprofloxacina.
Figura 3: Ejemplo de un estudio de seguimiento de los efectos anti-biopelículas utilizando dos antibióticos modelo contra las biopelículas de S. aureus. Los efectos de la penicilina G y ciprofloxacina se presentan aquí: (A) antes de la formación del biofilm (pre-exposición) y (B) la formación post-biofilm (post-exposición). Para cifra mayor claridad, sólo se muestran las más bajas y las más altas concentraciones ensayadas. Las desviaciones estándar no superen el 20%. *** ecuacionesls p <0,01. Modificado de Skogman et al. 26 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Imagen basada en microscopía de fluorescencia
El resultado de que la penicilina G a 400 M (así como concentraciones más altas, como se muestra en la Figura 3b) mata a cerca de 50% de la biopelícula población bacteriana preformado S. aureus se confirmó con otro ensayo de tinción de viabilidad. La media de los coeficientes de fluorescencia de color verde a rojo (V / R) para los pozos de biopelícula no tratados fue de 2,75, lo que indica un predominio de células vivas (verdes manchados), sobre las células muertas (teñidos de rojo). Sin embargo, en las células tratadas con penicilina la relación G / R se redujo a 1,54, que corresponde a 56% de los pocillos de control. Las células que quedan con vida después del tratamiento con penicilina Proprodujo una cantidad significativamente mayor de EPS, a juzgar por el incremento detectado en la fluorescencia verde (WGA) en comparación con las biopelículas no tratados (Figura 4b). Recomendamos, siempre que sea posible, para llevar a cabo estos experimentos basados en la imagen para confirmar aún más los resultados de la plataforma, especialmente durante la etapa de caracterización de golpe candidatos.
Figura 4: La microscopia de fluorescencia. El efecto de la adición de penicilina (400 M) sobre la viabilidad y la producción de EPS se muestran aquí. Las imágenes superior (A) corresponden a las biopelículas no tratados y tratados con biofilms penicilina, donde las células viables son células verdes y muertas teñidas se tiñen de color rojo. La gráfica insertada ilustra los cálculos de los coeficientes de fluorescencia G / R. Las imágenes de fondo (B) corresponden a las biopelículas no tratados y penicilinacélulas tratadas manchadas con la sonda WGA. El gráfico insertado presenta la cuantificación de las señales de WGA para muestras de biofilm tratados y no tratados, y las barras de error representan las desviaciones estándar. Modificado de Skogman et al. 26 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Procesamiento de datos y análisis estadístico
Parámetros estadísticos se calculan para caracterizar la calidad de los ensayos y a seguir su desempeño durante los recorridos de detección. Las ecuaciones de los parámetros más importantes que se utilizan, así como los valores obtenidos y de destino, se enumeran en la Tabla 1. En todas las ecuaciones, SD min, μ min, max SD, y Mu máx representan las desviaciones estándar y los medios del mínimo(Min) y las señales máximas (max), respectivamente. En los resultados que se muestran aquí, emparejados comparaciones de los valores originales se realizaron con un ensayo t no apareado con corrección de Welch, donde se consideró p <0,05 como estadísticamente significativo.
Tabla 1: Parámetros estadísticos utilizados para evaluar el rendimiento de los ensayos. En todas las ecuaciones, SD min, μ min, max SD, y Mu máx representan las desviaciones estándar y los medios del mínimo (MIN) y las señales máximas (max), respectivamente. Los métodos de tinción RES, resazurina, violeta cristal, y aglutinina de germen de trigo, se abrevian, cromo-vanadio, y WGA, respectivamente. RFU: unidades de fluorescencia relativa; RAU: unidades de absorbancia relativos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
No hay ningún método único que puede medir simultáneamente el efecto de un compuesto sobre el, la biomasa, y la matriz de la biopelícula viabilidad. Por lo tanto, hay una necesidad de combinar los ensayos con el fin de detectar un efecto sobre los tres puntos finales, preferiblemente en una etapa de detección primaria.
La resazurina es un protocolo de tinción muy simple que consiste solamente en la adición de la sonda redox. Sin embargo, establecer el tiempo de incubación óptimo de los biofilms con la resazurina es crucial para el éxito de este ensayo. En algunas cepas bacterianas, la reducción de la sonda de la resazurina a resorufina la rosa, fluorescente se produce muy rápidamente, mientras que en otros puede durar varias horas 19. Además, dentro de la misma cepa bacteriana, puede también haber diferencias significativas entre bacterias y biofilms planctónicos. Las bacterias planctónicas se alcanzan típicamente más fácil, sobre todo porque la densidad bacteriana es menor en poblaciones planctónicas que en po biopelículapoblacio-, que promueve la rotación más rápida de la reacción. En una comparación publicada de sondas de tinción de viabilidad biofilm, resazurina se concluyó a ser uno de los ensayos más precisos, simples de usar y menos caros 19. Por otra parte, se ha demostrado que es aplicable a una variedad de microorganismos bacterianos y fúngicos 19. Por otra parte, el ensayo de cristal violeta es el más ampliamente utilizado para la cuantificación masa biofilm 19,32,33. Los pasos más críticos de este protocolo son la adición y la eliminación de la solución de cristal violeta mancha. Estos pasos tienen que ser llevado a cabo con mucho cuidado para evitar la tinción no específica (por ejemplo, debido a las gotas de las manchas en las paredes de los pozos). Una de las principales ventajas de utilizar la resazurina como el ensayo de tinción inicial es el hecho de que es no tóxico para las células, lo que permite el uso de la misma placa para tinción con violeta cristal. La combinación de ambos ensayos simplifica significativamente el flujo de trabajo, reduce los costes, ahorra consumables, y reduce al mínimo el uso de los compuestos de ensayo, que es particularmente valiosa en un entorno de proyección.
Como se indicó anteriormente, la matriz de polisacárido extracelular de producción propia es un componente esencial de las biopelículas. Para medir el contenido de matriz (en particular polisacáridos esenciales), se incluye aquí un tercio de ensayo, basado en WGA marcado con fluorescencia. Originalmente la cuantificación WGA se describió como un ensayo de lectina-sorbente ligado a enzimas (ELLA) 24. Un ensayo similar sobre la base de los glicosaminoglicanos (GAG) de tinción de la matriz de biopelículas de S. aureus con azul de dimetilmetileno (DMMB) también se ha utilizado 31,34. GAGs son similares a las adhesinas intercelulares de polisacáridos (PIA) que se encuentran en la matriz de Staphylococcus spp. Las biopelículas 35. El WGA-ensayo de manera similar objetivos PIA, pero WGA más específicamente se une a poli- N-acetil-glucosamina residuos, los cuales juegan un papel esencial en la matriz del biofilm 36 </ Sup>. Orientación de la matriz es de gran importancia debido al hecho de que las biopelículas pueden crecer fácilmente si la matriz se deja después de un tratamiento con antibióticos o química. Las bacterias también pueden adherirse más fácilmente a una superficie que se matriz pre-recubierto 35. Se ha demostrado que algunos antibióticos pueden reducir eficazmente la biomasa viabilidad y biofilm, pero sin ningún efecto sobre la matriz. En nuestros experimentos, esto es ejemplificado por el caso de la ciprofloxacina 31. Algunos antibióticos pueden incluso aumentar la producción de matriz, como se ha demostrado aquí con penicilina G 26. Sobre la base de estos cambios, los antibióticos pueden clasificarse en las categorías enumeradas en la Tabla 2. Todos los hits en nuestros estudios de detección (Figura 2) se pueden clasificar, junto con ciprofloxacino, como compuestos que matan las bacterias en el biofilm y reducen la biomasa, pero no desarme o interrumpen la matriz del biofilm.
| Categoría | Efecto sobre las bacterias | Efecto sobre la matriz | Ejemplo antibiótico (biofilm objetivo) | Referencia |
| 1 | ninguna | ninguna | ampicilina (SA) | (Totes et al. 2009) |
| 2 | ninguna | - | cefalotina (SA) | (Totes et al. 2009) |
| 3 | - | ninguna | polimixina (SA) | (Totes et al. 2009) |
| 4 | - | - | kanamicina (PA) | (Totes et al. 2009) |
| ciprofloxacina (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doxiciclina (PA) | (Totes et al. 2009) |
| 6 | - | + | penicilina G (SA, CE) | (Skogman et al. 2012) |
Tabla 2: Clasificación de los antibióticos. Los antibióticos se dividen en categorías en función de su efecto sobre la viabilidad de las bacterias de biopelícula (usando resazurina tinción) y la matriz (utilizando WGA o azul (tinción dimetilmetileno DMMB)). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; CE: Escherichia coli. Modificado de Toté et al. 31
Además, esta plataforma es ideal para la realización de campañas de cribado primario. La estrategia más económica y de tiempo eficaz es aplicar ensayos basados en violeta cristal y resazurina como una estrategia de primer nivel y para seguir adelante con el ensayo WGA-matriz en los estudios de segundo nivel (seguimiento). Esto es debido al hecho de que la sonda de WGA es bastante caro y que este ensayo consiste en varios pasos, que hace que sea más laboriosa y consume mucho tiempo.
Una característica relevante de esta plataforma es la posibilidad de evaluar los efectos a largo plazo de los antimicrobianos identificados. efectos quimioterapéuticos a largo plazo sólo puede lograrse si se desmonta la matriz del biofilm. Se ha demostrado que el riesgo de la resucitación de la infección biofilm es mucho más alta si la matriz es dejado atrás. Con esta plataforma, es posible evaluar primero si la biomasa total de biopelículas se ve afectada usando tinción con cristal violeta. Una más detailed evaluación de los polisacáridos de la matriz del biofilm, usando el ensayo WGA, puede seguir. Es de destacar que la probabilidad de identificar una única molécula que puede tanto desmontar la matriz y ejercer antibacteriano (biocida) efectos pueden considerarse como baja. De hecho, hasta el momento, los únicos compuestos de este tipo que hemos identificado son péptidos antimicrobianos 37. Para hacer frente a esto, los seguimientos se realizan en esta plataforma, ya sea con golpes resazurin- o cristal violeta-activa, ya que esta estrategia permite la identificación de compuestos con actividad biocida separado o degradante de la matriz. Tales cables pueden ser potencialmente interesante para estrategias de múltiples componentes. Se espera que una combinación de moléculas que degradan la matriz con compuestos biocidas o de tipo antibiótico para proporcionar la erradicación de biofilm más eficiente.
En resumen, la plataforma que aquí se presenta constituye una buena base para la detección de anti-biopelícula mediante mediciones de la viabilidad y de biomasa junto con cuantifi matrizcación y visualización. Tanto los ensayos de tinción resazurina y violeta cristal también se pueden utilizar para otros tipos de microorganismos que forman biopelículas. Sin embargo, estos ensayos requieren optimización separada para ambos de cultivo y tinción condiciones. La aplicabilidad del ensayo de tinción WGA se limita a las bacterias en la que el poli- N -acetil-glucosamina es un componente principal de la matriz de la biopelícula. Otros ensayos de la matriz de cuantificación (tales como el basado en la tinción con azul dimetil-metileno) se pueden aplicar en otros casos. En conjunto, los ensayos en esta plataforma son bastante fácil de realizar, y todos los reactivos son fácilmente disponibles, así como por lo general asequible. Esta plataforma es adecuada para la detección de bajos a anti-biofilm rendimiento medio sin la necesidad de costosas inversiones en equipos.
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Acknowledgments
Los autores agradecen al profesor Paul Cos y LMPH, Universidad de Amberes, Bélgica, por su apoyo durante el proceso de filmación en su laboratorio. Este trabajo fue financiado por la Academia de Finlandia proyectos (proyectos 272266 y 282981) y Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finlandia. Las contribuciones técnicas de Maestría Janni Kujala son reconocidas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
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