Introduction
Fenotypisk karakterisering av systematiske muterte samlinger av modellorganismer er en anerkjent metode for å dissekere celle kompleksitet. Den haploid encellede grønnalger Chlamydomonas reinhardtii har en plante-lignende gen set, men det splittet fra landplanter før flere genom duplikasjoner i landanlegget avstamning 2. I prinsippet, mangel på genduplikasjon og et hovedsakelig haploid livssyklus i stor grad forenkler tap-av-funksjon genetiske tilnærminger. Imidlertid er målrettet avbrytelse av gener som er av interesse nesten umulig på grunn av mangel på effektive homologe genomiske integrasjons. En tilfeldig insertional avbrudd biblioteket er under bygging, kombinert med identifikasjon av forstyrret området, så langt som gir en Arrayed sett av 1,935 kartlagt forstyrrelser som representerer 1.562 gener 3. Imidlertid er denne tilnærmingen (forventet generelt å produsere null mutasjoner) gjelder ikke for viktige gener. Temperaturfølsom (TS) mutasjoner kan recovered på essensielle gener, og nyere metoder tillater effektiv identifikasjon av det muterte genet og utløsende lesjon. Fenotypisk analyse ved høy temperatur gir deretter øyeblikkelig informasjon om funksjonen av det muterte genet. Vi rapporterte på isolering og karakterisering av ts dødelige mutasjoner i ~ 70 essensielle gener i Chlamydomonas, med fokus spesielt på gener som er involvert i cellesyklusprogresjon og kontrollere 1,4.
Ts dødelige skjermer har vært en bærebjelke i genetisk analyse i mikroorganismer i flere tiår 5,6. I prinsippet er en ønskelig egenskap for å nærme seg "metning", som betyr at alle gener i stand til å mutere til ts dødelighet er identifisert ved hjelp av minst en mutant, slik at en fullstendig analyse. Men i praksis, flere faktorer begrenser tilnærming til metning. Først, mens nesten alle genene kan bli mutert til tap av aktivitet ved høy temperatur, effektiviteten av utvinningen av slike mutanter, varierer over i det minsteen størrelsesorden 7,8. Derfor begynner en tilfeldig skjermen for å plukke opp gjentatte treff i "hyppige flyers" lenge før metning er kontaktet. For det andre, mens ts mutasjoner som oftest resultere i reduksjon av funksjon, de kan ikke være sanne nullverdier ved en restriktiv temperatur (og omvendt, er ofte ikke fullt ut funksjonell på en ettergivende temperatur). Dette problemet kan bli behandlet til en viss grad ved å sammenligne flere alleler; hvis de alle deler en felles fenotype, er det større sannsynlighet for å reflektere et resultat av enkle inaktivering av genet. Flere lene er også svært nyttig for definitive molekylær identifisering av utløsende lesjon en. Men den "frequent flyer" problemet betyr at flere alleler i sjelden treffer gener kan være vanskelig å gjenopprette.
Av disse grunner, har vi utviklet en forbedret rørledning for å isolere og fenotypisk karakter ts mutanter. Vi har samlet over 3000 ts mutanter så langt, jegncluding ca 200 nye kandidat cellesyklus mutasjoner. Molekylær og fenotypisk analyse av denne samlingen, som allerede sannsynlig inneholder mutasjoner i de fleste eller alle celle-essensielle trasé, bør gi ny innsikt og hypoteser i plantecellebiologi. Viktigere, kan denne rørledningen brukes på alle mikroorganismer som vokser på agar for å effektivt bygge ts mutant samlinger.
En kommentar om utstyr: to roboter er svært viktig for effektiviteten i denne prosedyren (en koloni velgeren og en kombinasjon kopi plater / cherry picker). Pickers vanligvis har metall pinner. Plukket kolonier holdes i luften på disse pinnene for en viss periode (sekunder til minutter, avhengig av modell). Chlamydomonas dør i ca 20 sek på en metallpinne i luften. Dette begrenser valget modell for organismen. Nøyaktighet saker. Vår koloni picker er rimelig nøyaktig; men det er noe voldelig i sin handling, og har noen mulighet for spray-baserte krysskontaminering. Det er ikke brukt ved høyEr enn 384 tetthet (4,5 mm senter-senteravstand); ved denne tetthet, er fullstendig akseptabel nøyaktighet. Den kopiplate / kirsebær plukke robot (ulike vedlegg som brukes for disse programmene) er mye tregere ved plukking, men er nøyaktig nok for 1536 tetthet (6144 er en utfordring, selv for denne svært nøyaktig robot, vi har vurdert dette tetthet men valgt ikke å bruke det på grunn av sine ulike problemer). Roboten vil ikke fungere bra hvis platene er lastet ujevnt, osv. Det er viktig å få øye-sjekk for å være sikker på at de riktige tingene skjer; selvfølgelig, vil roboten kjøre uten tilsyn og generelt alt vil gå bra hvis de første platene var riktige.
Protocol
1. UV Mutagenese
- Forbered en bunke med 100 - 200 rektangulære agarskåler med Tris-acetat-Phosphate (TAP) mellom 9,10. Forbered disse platene et par dager fremover og holde dem på benken til tørk for å sikre rask absorpsjon av suspendert celler i de neste trinnene.
- Kultur Chlamydomonas celler opp til 0,2 til 0,5 optisk tetthet (OD 750; ~ 2 dager) i 100 ml flytende TAP henhold lys, ved 25 ° C og rysting ved 100 rpm.
MERK: UV mutagenese utføres uavhengig i to genetiske bakgrunn: Mat- Hygro r (gir resistens mot Hygromycin B) og Mat + Paro r (gir resistens mot paromomycin). Antibiotika valget er vilkårlig, forutsatt at de to koplingstypene har komplementære narkotika motstander. - Sjekk en prøve av hver av kulturene under mikroskopet for å sikre at cellene er levedyktige, sunn (svømming og intakt), og uten forurensning.
MERK: gjengrodde kulturer "crash" ogmiste levedyktighet, som vises som "spøkelser" i fasekontrastmikroskop. Ikke holde shaker kulturer kommer når de når metning. "Spøkelse" fenomenet er lett synlig i trinn 1.3. - Fortynn kulturen til 0,003 OD 750. Vikle flasken med aluminiumsfolie for å sikre homogen tetthet, da stammen er motile og svømmer retnings som reaksjon på lys.
- Justere tettheten til suspensjonen basert på den planlagte UV-dose, slik at regnskap for celledreping, 200 - 600 vil overlevende kolonier dannes på platene (figur 1). Se tabell 1 for informasjon om UV eksponeringstider.
- Fest en liten tube kassett som passer en flytende dispenser og utføre en rekke vasker for sterilisering, i henhold til produsentens instruksjoner, for å hindre forurensning.
- Ved hjelp av en 8 x 12 flytende dispenser, dispensere 4 x 96 dråper 2 mL hver på rektangulære plater (figur 1
- For å sikre en meget jevn enkelt celle spredning, bruker tørre plater, som nevnt ovenfor, og raskt dekke platene for å hindre at cellene fra svømming som reaksjon på lys. Hold dekket platene nivå og i mørket inntil all væsken er absorbert.
- For å sikre maksimal styrke av UV-bestråling uten tilbakevending på grunn av lys-avhengig DNA-reparasjon 11,12, arbeid i mørke ved dette trinnet og umiddelbart pakkeplatene i en mørk boks etter bestråling.
MERK: Grunnen til denne sekundære plettering er det ts dødelige mutanter kan i noen tilfeller akkumulere betydelige biomasse, selv om cellene blir arrestert i den første cellesyklusen etter utplating. Den sekundære replica eliminerer dette signal og i stor grad øker følsomheten.
MERK: Ulike inkubasjonstider brukes til å utjevne vekst siden villtype vokser betydeligraskere ved 33 ° C enn ved 21 ° C.
2. Identifisering av ts Mutant Kandidater: Første Screen
- Behandle de sammenkoblede 21/33 plate bilder med et tilpasset Matlab bildeanalyse programvare for å fjerne bakgrunnen og å segmentere bildene inn i en 1536-array. Programmet vil bestemme det detekterte biomasse (total pikselintensiteten) i hver posisjon (figur 5).
MERK: Programvaren (gitt i SI sammen med instruksjoner) vil bruke grid-plate image for å bestemme plasseringen av celler (enkeltoppføringer) i en 1536-matrise på forstørrelse og plate innretting brukt og beregne total pikselintensiteten i hver celle . Disse verdier for hver mutant blir deretter sammenlignet mot justerbare parametere for å bestemme ønsket vekst ved 21 ° C i forhold til en ts + standard og graden av temperatur-følsomhet, definert som: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), hvor S er signalet (piksel itensity etter bakgrunn subtraksjon), er Mut et individ mutant, og "WT" er en tilfeldig valgt ikke-temperaturfølsom koloni (mutagenisert stamme som hadde ts + fenotype). Vekst ved 21 ° C er definert som S (Mut 21) / S (WT 21). I denne første skjermen, gjelder avslappet utvelgelseskriterier (som tillater forholdsvis lav vekst ved 21 ° C og en forholdsvis lav grad av temperatursensitivitet) for å holde den feilaktig negative klassifiseringen lav. - Last listen over utvalgte kolonier generert av programvaren som en instruksjon fil for enkelt-kolonien plukke robotikk (typisk i en 384-array). Forbered kilde- og målt plater i henhold til robotikk instruksjonene og plukke kolonier til matrise (figur 6).
MERK: Konvensjonelle plukkere krever en instruksjon fil i noen format, for eksempel CSV, TXT, eller .xls. Alle plukkerne vil ha kapasitet til å være fil-drevet; ulike formater vil kreve mindre redigering av MATLAB kode (kildekode følger med). Plasser målet platene i 21 ° C inkubator for ~ 5 dager å vokse et lager plate.
3. Identifisere ts Mutants: Second Screen
- Gjenta trinn 2.1 for å teste plukket kolonier. Typisk 30 - 50% av koloniene vil re-test som klare ts lethals, for et utbytte på 2% - 5% TS lethals i forhold til innledende kolonier som overlever UV mutagenese.
- Gjenta trinn 2.2 for å plukke ut de dobbelt-screenet TS lethals, men med en modifisert instruksjon fil utformet for å matrise kolonier i blokker på 100 kolonier på rektangulære plater på en 384-tetthet. Dette er for praktisk mikroskopisk undersøkelse i neste trinn. Instruksjonen filformatet er angitt under kjøring av MATLAB kode.
- Sørg for å inkludere flere WT kolonier som en kontroll og plasserer platene ved 21 ° C i ~ 5 dager.
4. Første Phenotype Fastsettelse
- Replikere 100-blokk plater kledd i trinn 3,2 og plassere dem i 21 ° C incuBator for ~ 2 dager å få fersk voksende kolonier.
- Replikere ny kopi av de 100-blokk plater (4,1) til tre eksemplarer. Plasser en kopi i 21 ° C inkubator og en i 33 ° C inkubator som kontroller.
- Plasser den tredje eksemplar ( "screening plater") i en robot oppsett, og spot koloniene med lange pinner rørt med sterilisert vann.
MERK: Chlamydomonas celler festet til agar robot tendens til å lande først som en ganske tett flekk av celler, med noen få enkeltceller tilgjengelige for mikroskopisk undersøkelse. For å optimalisere koloniene for mikroskopisk undersøkelse, spot opprinnelig overførte cellene med en dråpe vann (volumet av vann som overføres ved robot lange pinnene er ~ 100 nl). Dette resulterer i dispergering av cellene i en liten radius (~ 1 mm) over den første pinning senter, med mange isolerte enkle celler. - Ta mikrofotografier av en region av hver flekk av innretningen ved tid 0 (mens fortsatt singel, udelte celler) (Figur 7) og legg platene på 33 ° C for inkubasjon. Bestemme bildeplassering av den manuelle trinnstyringen av en modifisert tetrad disseksjon mikroskop innstilt for å gi stopper på 4,5 mm senter-til-senter avstand på en matrise 384-tetthet.
- Fjern avskjermingsplatene fra 33 ° C inkubatoren og ta mikrofotografier, som i trinn 4.4, ved forskjellige tidspunkter (10 timer, 20 timer, 48 timer). Pass på scenen, plateholder, og scenen kontrolleren er nøyaktig kalibrert for å få bilder av de samme cellene i hvert tidspunkt. Utfør rask mikrofotografi oppkjøp (~ 10 min).
- Bruk den andre kopien i 33 ° C inkubator for å verifisere ts fenotype og å sørge for at temperatursvingninger under bildet oppkjøpet har ingen stor effekt på ts fenotype.
- Analyser mikroskopiske bilder og selektere for mutanter basert på de ønskede kriterier (figur 8). Spot endelig valgt sett i en 96-kledd agar plate. Sørg for at hverplate har mutanter av det samme paringstypen og medikamentresistens.
- For hver plate, innlemme de to siste kolonnene en positiv (spørring mutasjon) og en negativ (WT) kontroll for komplemente analysen.
5. Komplemente og Heis testing av nye mutanter til «Frequent Flyer"
- Overføre store mengder av de arrangerte koloniene til nitrogen-fri kjønnscelle-induksjon medium 10 i 96-brønners mikroplater (densitet fra hver koloni bør være rundt 0,2 OD). Inkuber platene under lett (13-20 W kvikksølv pærer) for ~ 5 timer for å tillate gametogenesis.
MERK: Dette trinnet kan utføres enten med en reproduserende robot oppsett eller manuelt med et enkelt plating enhet. - Suspendere spørsmål med motsatt parring typer skjuler de alternative motstands kassetter til rør med nitrogen-free kjønnscelle-induksjon medium 10 for gametogenesis.
- Bland prøvene i en sikteplate i en parring mixture volum på 20 ul (figur 9). Etter ~ 10 min under lys, stikk 5 ul fra hver brønn to ganger: én gang på en TAP plate for kobling testing og en gang på TAP + 5 mikrometer Paro + 9 mikrometer Hygro for komplemente testing.
- Inkuber ledd platene i 21 ° C inkubator over natten, og deretter pakke dem i folie. Holde dem i mørket i 5 dager for å tillate zygospore formasjonen.
- Inkuber complementation-testing plater for ~ 10 dager i lyset ved 21 ° C.
MERK: Stoffet beløpene er kalibrert for å tillate overlevelsen av dobbelt heterozygote diploider, men de er likevel nok til å eliminere parring haploids. Disse beløpene ble kalibrert for standard motstand kassettintegrasjoner brukt i dette konkrete prosjektet; med nye integrasjoner, bør dosen rekalibrert. Mest av biomasse er bekreftet å være diploider ved flowcytometri (figur 9), selv om en variabel grad av haploids (sannsynligvis fra meiose og vekst av dobbelt motstandsdyktigsegregants) er vanligvis observert i tillegg. - Replikere komplemente-testing plater i to eksemplarer for TS- fenotype identifikasjon. Plasser ett eksemplar ved 21 ° C og en kopi ved 33 ° C i ~ 5 dager.
- Test kolonier for TS- fenotype, som beskrevet i kapittel 2.1 (figur 5). Kolonier som ikke er sammenfallende med søket sannsynlig representerer alleler av det samme genet som spørre (diploider hetero-allele for mutasjoner i det samme genet).
- For kobling testing, neste trinn 5.4, skifte platene tilbake til lyset slik at meiose og utvekst av haploide segregants for ~ 7 dager.
- Replikere kobling testing platene til TAP + 10 mm Paro og 10 mikrometer Hygro å velge for dobbel-resistente progenies (anslått til å være 25% av den haploide avkom, siden kassettene er opphevet) og inkuberes ved 21 ° C i en uke.
MERK: Øk narkotika dosering for dobbelt resistente haploids. - Test kolonier for TS- fenotype, som jegn trinn 2.1.
MERK: En TS- fenotype er ventet (og observert) for mutanter i samme complementation gruppe som spørringen. I tillegg er et TS- fenotype i leddforbindelsen assay for en mutant som utfyller spørring, kan reflektere tett binding mellom spørringen og den ny mutasjon. Mutanter som utfyller de testede spørsmål er sannsynlige nye gener som skal gå inn i rørledningen for bioinformatiske identifikasjon av utløsende lesjon, og i siste instans for videre fenotypeanalyser.
Representative Results
Vi viser en akselerert rørledning for å isolere ts mutanter i Chlamydomonas. Celler blir dispensert på agarplater, og kort tid etter at hurtig validering under mikroskop for enkeltcelletetthet, platene er UV-bestrålt (figur 1). Typiske bestrålte kolonier blir identifisert og tatt inn i en oppstilt format etter 10 dagers vekst ved en permissive temperaturen (figur 2). De resulterende plater i 384 format er slått sammen til en 1536-array (figur 3). Fra disse første skritt for å samle bestrålt kolonier, har vi kledd ~ 200.000 kolonier så langt. Tettheten av suspensjonen justeres basert på den planlagte UV dose slik at regnskap for død, 200 - vil 600 overlevende kolonier dannes på platene. Tre eksponeringstider UV (1,5 min, 1 min, og 0,5 min) og tre tettheter ble testet tilsvarende (tabell 1). Empirisk 1,5 min eksponeringstiden ga det meste av ts- mutanter (~ 50%); imidlertid langt, 1 min, ga de fleste av cellesyklus kandidater. Derfor fremtidige UV mutagenese runder var ferdig med 1 min bare. Et viktig anliggende er sprut under innledende plukking og krysskontaminering (spesielt i formater high-density). Dette kan resultere i duplisering og ytterligere fenotyping av den samme mutant to ganger. For å minimere sannsynligheten for et slikt scenario, ta vare å samle kolonier på optimal størrelse, og sørg for at tilstøtende kolonier ikke blir plukket i den første analysen.
Deretter ble to sekvensielle TS- fenotype analyser (figur 5) utført, og rundt 3000 TS- mutanter ble isolert og fenotypisk preget av time-lapse mikroskopi (Figur 8). På grunn av den biologiske fokus på å studere cellesyklus av interesse i fenotyper som oppfyller visse kriterier, er vi ikke interessert i å samle mer enn to alleler i hvert mål gene. Derfor utførte vi complementation og kobling testing med allerede preget gener med mer enn to alleler (Query) mot nylig innsamlede kandidater til å fjerne svært tilbakevendende gener fra nedstrøms rørledningen (figur 9).
Figur 1: Uniform Spredning av Unmutagenized celler og UV mutagenese. (a) 384 x 2 pl dråper blir dispensert på en agar plate ved hjelp av et reagens dispenser. (b) tilfeldige plater blir testet under mikroskop for å kontrollere enkeltcelletetthet og er UV-bestrålt med en 1-min eksponering. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. UV-mutageniserte Colonies Plukket for 384-arrays. (a) UV-bestrålte enkeltceller blir dyrket for ~ 10 dager inn synlige kolonier. Scale bar = 2 cm. (b) Bildeanalyse programmet gjenkjenner separable kolonier i henhold til visse parametre og robot Arrays dem inn 384 plater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenslåing av 1536-array. Fire 384-format platene er slått sammen til en 1536-plate; når dyrket, blir de replikert igjen for å teste for TS- fenotype. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.
Figur 4. Imaging for kvantifisering. (a) Plater blir holdt i en ramme i henhold til et dokument fotografering stå slik at alle platene i en serie blir fotografert på samme forstørrelse og posisjonering. (b) Det første bildet er av en 1536-brønners mikrotiterplate med røde prikker plassert i hjørner og midtpunkt. Denne "grid-plate" image definerer posisjonen i matrisen. (c) Eksempel på en 1536-matrise etter inkubasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Identifisering av TS- fenotype ved Semi-automated Bildeanalyse. Plate bildene er analysert av tilpasset MATLAB programvare (gitt i SI). Bildet blir automatisk segmentert i cellearrangementer (96, 384 eller 1536), og signalet i hver celle blir kvantifisert. Vekst ved 21 ° C er merket i blått, og vekst ved 33 ° C er markert med gult. Kolonier stiller betydelig høyere vekst ved 21 ° C i forhold til 33 ° C (standardisert til ts +) er valgt og merket i svarte firkanter med en grønn prikk. Disse valgene kan redigeres manuelt. Endelige valg overføres til en fil som brukes av kolonien-roboten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Robotic Plukking av første runde ts Lethal kandidater. Kirsebær-picking roboten følger instruksjoner fra en fil som er generert som beskrevet i trinn 2.1 til å plukke kandidater for en ny matrise. Den øverste panelet viser lasting av en sterilisert tapp. Det nederste panel viser den nøyaktige plukking fra en viss koloni i kilden plate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Time-lapse Screening for Initial Sortering av ts Lethal fenotyper. Kloner som ble sendt to runder med screening-protokollen vist i figur 5 blir replikert til plater ved en celletetthet slik at de enkelte celler kan løses mikroskopisk. En modifisert tetrad disseksjon mikroskop blir brukt til å identifisere posisjonene ved hvilken mikrofotografier er tatt etter 0 timer, 10 timer og 20 timer inkubasjoner en t 33 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: De Chlamydomonas Cell Cycle Mutants identifisert av Time-Lapse mikroskopi. (a) Illustrasjon av Chlamydomonas unike cellesyklusen beskriver den lange G1 fase preget av cellevekst, fulgt av fisjons SM sykluser, som ender opp med klekking av nyfødte datter celler. (b) Mikroskopisk bilde demonstrere WT-celler i løpet av cellesyklusen, og identifisering av typiske cellesyklus mutanter som ikke klarer å fullføre mitose. Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Komplemente og Linkage Test. (a) Et antibiotikum-resistente (f.eks Hygro) spørring med en hyppig gjentatt mutert gen er krysset i en 96-brønns plate med et sett av mutanter av motsatt parringstype som bærer på en annen antibiotisk resistens kassett (f.eks Paro). Komplemente platene gir høy fraksjon av diploider som vist ved den nukleinsyre farging og analyse i flowcytometri (nederst til venstre panel i a). (b) mating Blandingen ble testet både med hensyn komplementering i diploider og for kobling i dobbel-resistente meiotisk avkom. Den positive kontrollen er spørringen i seg selv i den motsatte paringstypen, og, som ventet, viser TS- fenotype ved 33 ° C, mens den negative kontroll er WT og viser ts + fenotype. De sirklet kolonier viser ingen komplemente med spørringen, og er derfor new TS- alleler for søket genet. Disse er vanligvis ekskludert fra videre karakterisering, siden bare "hyppige flyers" er i komplementetestsett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tid | OD | Kolonier plukkes (#) | TS- fenotype | Cell-syklus kandidater |
| 1,5 ' | 0,012 | 6000 (Avg = ~ 200) | 200 (3,3%) | 7 (3,5%) |
| 1' | 0.003 | 11000 | 131 (1,19%) | 15 (11,4%) |
| (Avg = ~ 360) | ||||
| 6E-04 | 9000 | 40 (0,45%) | 1 (2,5%) | |
| (Avg = ~ 300) |
Tabell 1: Kalibrering av bestrålingstider for å maksimere utbyttet av cellesyklusen Mutant kandidater. Tre bestrålingstider ble testet (30 plater hver) med tilsvarende OD for å sikre overlevende kolonier tall (200 - 600).
Discussion
Rørledningen er beskrevet her for high yield isolering av ts dødelige mutanter sikrer at formodentlig alle mobiltelefon-essensielle pathways av Chlamydomonas genomet er representert. De to mest kritiske trinn for effektiv innsamling av potensielle cellesyklus gener og for eliminering av repeterende "frequent flyer" alleler er: 1) sammenhengende definisjon av arrest fenotype karakteristika for ufullstendige cellesykluser og 2) parallellkomplemente analysen mot allerede identifisert spørring gener for å forstørre samlingen med nylig isolerte seg.
Når synkronisert med lys-mørk sykluser, vokser Chlamydomonas photosynthetically dagtid og økning i cellestørrelse> 10x uten DNA replikasjon eller celledeling 13. Omtrent samtidig med utbruddet av natten, ble celler deretter gjennomgår gjentatte behandlinger med vekslende DNA-replikasjon, mitose, og celledeling (figur 8). Dette forskrifts scheme gir en naturlig skille mellom gener som primært er nødvendig for cellevekst og integritet og gener som kreves spesielt for celledeling syklus. Vi fant at 10-timers og 20-timers tidspunkter er veldig informative for en innledende grov fenotypiske kuttet en. Den brede klasser av ts dødelige mutanter som vi kjenner i dag, basert på disse bildene (se SI i Tulin og Cross, 2014) 1, er: Notch, Popcorn, Round, Small, Medium, tidlig lyse, og flere syklus (Figur 8 ).
De tre mest relevante kategoriene vi fokuserer på er Notch, Popcorn, og Round. De "hakk" og "Popcorn" fenotyper ble vist tidligere å være karakteristisk for de fleste cellesyklus-spesifikke lesjoner (f.eks mitotisk cyklin-avhengig kinase, DNA-replikasjon maskineri, og topoisomerase II) 1. Utseendet til en (Notch) eller flere (Popcorn) tilsynelatende flyene av begynnende men mislykket celledeling er en praktisk morphological indikator på cellesyklus innvielse. Disse mutantene generelt utviser liten eller ingen vekst defekter, med økninger i celle volum lik WT på 10-timers mark. Hakket og popcorn fenotyper er tydelig på 10 timer og er fullt utviklet (ofte assosiert med cellelyse) med 20 hr. "Round" celler vokse på samme måte som WT, men med mye redusert produksjon av tilsynelatende begynnende deleflatene, noe som gir store, runde arrestert celler. Tidligere mutanter i denne kategorien har falt i komponenter i anaphase fremmende komplekse 14 eller i gener som kreves for microtubule funksjon (tubulin-folding kofaktorer, gamma-tubulin ring kompleks) 1. På senere tidspunkt, disse cellene ofte oppviser utpreget cellelyse.
"Small" og "Medium" celler vokse enten ubetydelig (Small) eller betydelig mindre enn WT (Medium). Mange av disse mutantene er identifisert til å ha skader i genene hvis merknader foreslår roller i grunnleggende Cellular vekstprosesser (oversettelse eller membran BIOGENESIS). Hoved mikroskopiske diskriminering mellom Medium og Round hviler på mengden av veksten på 10 timer (Round: som WT, Medium: redusert). Fordi de små og mellom kategoriene er ganske stor og trolig gjenspeile lesjoner i et stort utvalg av mobilnettet veier, er vi ikke forsøker å mette disse kategoriene; Men vi ønsker å molekylært identifisere representanter for klassen å forstå fenotyper av tap i ulike veier. To unstudied kategoriene er: 1) den tidlige-lysering av mutanter som taper integritet (tap av grønn farge, tap av refractility) ved 10-timers mark, med lite bevis for forhåndscellevekst og 2) flere sykluser. Celler proliferere på samme måte som WT ved 10 og 20 timer, selv om de utviser en fullstendig manglende evne til å utføre mer langsiktig proliferasjon.
Vi har for det meste karakteriserer "hakk", "popcorn" og "rund" og inkluderer små og mellomstore runde celler, så velsom lekk mutanter at fullstendig noen celledelinger. Dette er først og fremst å sikre at grunnleggende cellulære funksjoner, for eksempel vekst og membran integritet, er funksjonelle og berike sannsynligheten for divisjonens relaterte gener. Denne fremgangsmåten er funnet å være empirisk effektiv; Det kan imidlertid være at en cellesyklus gen er pleiotropisk og har flere roller tidligere i G1, før selve delingen. Slike saker, som vi forventer å være sjelden, er savnet. Mer generelt har vi som mål for homogen arrest, som i stor sannsynlighet skyldes en utløsende mutasjon som er en helt dysfunksjonell protein. Imidlertid, av samme grunn som nettopp beskrevet, kan det være flere arrest punkter, og derfor er tilrådelig å velge kandidater viss fleksibilitet.
For å berike samlingen med nylig identifiserte gener, blir de valgte kandidatene analysert for komplemente. Vi krever TS- i den positive kontroll (spørring mot spørring mutasjon) og ts + i den negative kontroll (query mot WT). Nye mutanter i samme complementation gruppe som spørringen er TS-. Medlemskap i samme komplemente konsernet reflekterer nesten alltid en molekylær lesjon i det samme genet (dette har vært tilfelle for hvert slikt gen vi har testet). Derfor, for "hyppige flyers," dette kriteriet er ekskluderende for videre karakterisering. Mutanter som ikke var på samme komplemente grupper som de testede søk er kandidater til nye gener og er videre preget av bioinformatikk og eksperimentelle verktøy. Sterkt variable utvinning av TS- alleler i ulike komplemente grupper er et velkjent fenomen, det vil si, er variabiliteten markert større enn Poisson støy, på grunn av den store iboende variabilitet mutability til TS- mellom forskjellige gener. Årsaker kan inkludere iboende thermolability forskjeller; ulike protein størrelser; tilstedeværelsen av et protein som en monomer versus som en stor, stabilisert kompleks; og mutagene hot spots. Dette er nesten en ren nuisaNCE. Men en resulterende gunstig utfall at "frequent flyer" listen er ikke lang (med bare noen få mål som opptar mesteparten av listen), så arbeidskrevende komplemente testing er ikke en massiv oppgave før de senere stadier av prosjektet.
Som en komplementær måte, utførte vi en binding assay. I denne analysen blir dobbelt-resistente progenies valgt ut og testet for en TS- fenotype. En TS- fenotype er ventet (og observert) for mutanter i samme komplemente gruppe som spørringen eller for tett knyttet mutasjoner. For hver av de testede gener, er et WT avkom forventes å dukke (ts + fenotype) i en viss sannsynlighet, avhengig av den genetiske avstand. Vi anslår at det er rundt 100 zygosporer for hver parring i disse plassene. Forutsatt 100% meiotisk effektivitet, vil dette resultere i rundt 100 dobbel resistent avkom fra den frakoblede narkotika motstand kassetter (25% av meiotisk avkom, fire per meiose, på grunn av Mendelian arv). Dette vil også være tilfelle for TS- mutasjoner, hvor 25% av progenies vil være dobbelt-mutant, og 25% vil være WT om søket og test mutasjoner er opphevet. Derfor ut av dobbel resistent avkom, vil 25% være WT (rundt 25 celler). Dette er tilfellet for helt ukoblet mutasjoner; imidlertid, moderat binding (i ~ 20 cm, omtrent 2 Mb, eller 2% av genomet 115) vil sterkt redusere eller eliminere ts + signalet. I tilfellet med binding av de testede mutasjonen overfor antibiotika kassetten, ts + haploids som er dobbelt resistent er til stede i svært små mengder. Dette manifesterer seg som tilsynelatende manglende rekombinerer med alle mutanter testet, til tross utfyller alle mutanter testet, et avvikende resultat som er lett bemerket; I slike tilfeller vil tilbakekryssing løse problemet.
Både fra forkunnskaper og fra sekvensanalyse, forventer vi cellesykluskinaser gener i Chlamydomonas å være rundt 500 gener 2, selv om most, men sannsynligvis ikke alle, er avgjørende. Vi vil vurdere behovet for ytterligere runder mutagenese som flere mutanter blir samlet og metningsnivået stiger.
Denne prosedyren er unikt utformet for å studere viktige biologiske prosesser og gener og proteiner som bærer dem ut. Andre metoder for å generere forstyrrelser i viktige gener eksisterer (for eksempel transformasjon av tilfeldig mutageniserte alleler 16, betinget transkribert alleler 17 eller hypomorphic alleler 18). Men de alle krever homolog rekombinasjon, som er sterkt undertrykket i vegetative Chlamydomonas. Den gruppert regelmessig interspaced kort palindromisk repeat (CRISPR) / Cas9 system er etablert som et kraftig verktøy for genmodifisering 19; imidlertid, er det likevel å arbeide effektivt i Chlamydomonas 20. Kritisk, alle disse metodene krever forkunnskaper i målet. Dette er en alvorlig begrensningdersom man ønsker å ha muligheten til å lære noe nytt! Vår tilnærming vil gi mutasjoner identifisere viktige gener, uavhengig av noen forkunnskaper. Derfor på det nåværende nivå av teknologi, isolering av tilfeldige ts mutasjoner fulgt av genet identifikasjon av dyp sekvensering kan være den mest effektive metoden for å få rask inntreden i mikrobiell cellebiologi i anlegget superkingdom.
Identifisering av årsaks mutasjoner (blant ~ 100 kodesekvens skiftende mutasjoner i hver klone) er utenfor omfanget av denne artikkelen. Deep sekvensering av bulked segregant bassenger 1 er effektiv, men arbeidskrevende. Et kombinatorisk basseng strategi for bestemmelse av alle mutasjoner i et stort antall stammer, etter sekvensering av et lite antall av bassenger, er meget kostnads- og arbeidsbesparende. En ny strategi for kombinatorisk bulked segregant sekvensering er under utvikling som vil tillate identifisering av årsaks mutasjoner i dusinvis av mutanter simultaneously i et enkelt sekvense kjøre (under forberedelse). Disse effektivitet er svært viktig for å tillate den kritiske genet identifikasjonstrinn for å holde tritt med den meget hurtige akkumulering av mutanter som er gjort mulig ved fremgangsmåtene beskrevet her.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen vesentlige økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Cross lab medlemmer for råd og nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av PHS 5RO1-GM078153 og etter en Junior Fellow pris fra Simons Foundation til Michal Breker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
| MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
| Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |
References
- Tulin, F., Cross, F. R. A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom. Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).
- Cross, F. R., Umen, J. G. The Chlamydomonas cell cycle. Plant J. 82, 370-392 (2015).
- Li, X., et al. An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 28, 367-387 (2016).
- Tulin, F., Cross, F. R. Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas. Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).
- Simchen, G. Cell cycle mutants. Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).
- Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 30, 248-258 (2008).
- Harris, E. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Dutcher, S. K. Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).
- Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations. Sci World J. 2015, 250158 (2015).
- Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).
- Francis, D. Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32. Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).
- Zachariae, W., Nasmyth, K. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).
- Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318, 245-250 (2007).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).
- Mnaimneh, S., et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).
