हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा Murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी
Summary
An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.
Abstract
Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.
Introduction
हाइब्रिडोमा इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्रौद्योगिकी पहले कोहलर और 1975 में Milstein 1 से वर्णित किया गया था और कुछ तकनीकी सुधार के अलावा, मुख्य प्रक्रिया नहीं नाटकीय रूप से पिछले 40 वर्षों के दौरान 2 बदल गया है। इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए एक अधिक उचित टीकाकरण रणनीति, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए एक मानक तरीका है, और एक सत्यापन विधि (एलिसा) के लिए एक उदाहरण समझाने के लिए है।
एंटीबॉडी अविश्वसनीय उपकरण हैं और रोग निगरानी और उपचार 3 के लिए नैदानिक और चिकित्सीय विकल्प के रूप में, इस तरह से फ्लो, चुंबकीय सेल छँटाई, या immunofluorescence के रूप में तकनीकी दृष्टिकोण, की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए योगदान के रूप में अच्छी तरह से। वांछित लक्ष्यों के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की वाणिज्यिक उपलब्धता एंटीबॉडी या एंटीबॉडी से संबंधित उत्पादों 4 के लगभग अनगिनत मात्रा के साथ 24 से अधिक विभिन्न वेब डेटाबेस की मौजूदगी से प्रदर्शन किया है। 2015 में, एकntibody अणुओं उचित सत्यापन और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन में गंभीर समस्याओं के कारण एक अंतरराष्ट्रीय चर्चा 5-7 का हिस्सा थे।
यह एक लक्षित प्रतिजन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी खोजने के लिए मुश्किल और महंगा हो सकता है, और अक्सर, वे समानता या विशिष्टता की जरूरत नहीं है। हालांकि एक एंटीबॉडी पैदा अभी भी समय लेने वाली है और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है विकसित करने और एंटीबॉडी मान्य करने के लिए, अलग-अलग हो सकता है एक खरीदने की तुलना में बेहतर है एक एंटीबॉडी का निर्माण किया।
तथ्य यह है कि एंटीबॉडी उत्पादन समय लेने वाली है और अनुभव की आवश्यकता के कारण, बाध्यकारी अणुओं के उत्पादन के लिए वैकल्पिक तरीकों इन समस्याओं को दूर करने के लिए विकसित किए गए। सबसे अधिक इस्तेमाल किया वैकल्पिक विधि फेज प्रदर्शन के माध्यम से एकल श्रृंखला एंटीबॉडी की पुनः संयोजक उत्पादन होता है। चर बाध्यकारी क्षेत्र के लिए जीन कोशिकाओं से निकाले और एक फेज की कोटिंग प्रोटीन के साथ संयुक्त कर रहे हैं। रोंचिमनी श्रृंखला फिर एक जीवाणुभोजी की सतह पर व्यक्त की है और कई पैनिंग कदम 8 में जांच की है। एकल श्रृंखला एंटीबॉडी के उत्पादन थोड़ा तेज है, लेकिन यह भी एक कुशल experimentalist की आवश्यकता है। कुछ पुनः संयोजक एकल श्रृंखला एंटीबॉडी का नुकसान गरीब स्थिरता और इन विट्रो निदान के लिए उपयुक्तता की कमी कर रहे हैं। सबसे नैदानिक परीक्षणों में, पता लगाने के लिए एक एफसी रिसेप्टर जो बाद में एक पुनः संयोजक एकल श्रृंखला एंटीबॉडी को जोड़ा जाना चाहिए आवश्यक है। फिर, यह समय लेने वाली और हाइब्रिडोमा तकनीक की तुलना में भी अधिक जटिल है। इन विट्रो निदान में, पूर्ण लंबाई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी माउस और खरगोश सबसे अच्छा विकल्प हो करने के लिए प्रदर्शन किया गया है।
immunoconjugate के डिजाइन: इससे पहले कि प्रयोगशाला में काम शुरू होता है मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पैदा करने में प्रमुख कदमों में से एक किया जाना चाहिए। सवालों को संबोधित किए जाने की जरूरत है कि कर रहे हैं: अंतिम अनुप्रयोगों में लक्ष्य की शारीरिक संरचना क्या हैआयन, और जो matrices मौजूद हैं? जो एकाग्रता लक्ष्य आवेदन में होगा? क्या अंतिम आवेदन है, और आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए कि एंटीबॉडी क्या कर रहे हैं?
हमेशा खाते में लेने के लिए अगर एक रेखीय पेप्टाइड टुकड़ा प्रयोग किया जाता है, यह भी पसंद का लक्ष्य फाइनल में मिलान में रैखिक हो गया है कि; अन्यथा, एंटीबॉडी के लिए बाध्य नहीं होंगे। बेशक, स्क्रीनिंग विधि के स्वतंत्र, एंटीबॉडी विभिन्न अनुप्रयोगों में विभिन्न स्वरूपों प्रतिजनी पहचान करने के लिए चयनित किया जा सकता है, लेकिन यह बहुत ठीक मान्य किया जाना चाहिए। इन वजहों से एंटीबॉडी विकास और सत्यापन ऐसी महत्वाकांक्षी प्रक्रियाओं कर रहे हैं।
टीकाकरण के लिए प्रतिजनी प्रारूप के चुनाव एंटीबॉडी के विकास के लिए मौलिक है और सफलता या इस प्रक्रिया की विफलता निर्धारित करता है। एक बार जब चूहों एक प्रासंगिक एंटीबॉडी अनुमापांक एक्सप्रेस, तिल्ली कोशिकाओं को अलग और मायलोमा कोशिकाओं के साथ जुड़े हुए हैं। के लिए सबसे आम मायलोमा सेल लाइनोंmurine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विकास X63-एजी 8.653 9 और SP2 / एक / Balb ग माउस तनाव से 0-एजी 14 10 हैं। कोशिकाओं को एक घातक बी सेल लिंफोमा से उतरना और क्योंकि वे अपने ही भारी या हल्के चेन के किसी भी छिपाना नहीं है चयन किया गया था। 1 (मायलोमा कोशिकाओं बनाम splenocytes): कोशिकाओं 1:10 और 10 के बीच एक अनुपात करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। Stoicheva और हुई 11 के अनुसार 1 और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और Electrofusion से इनकार,: इस प्रोटोकॉल में, 3 कोशिकाओं का एक अनुपात करने के लिए अनुकूलित किया गया।
बी कोशिकाओं और मायलोमा कोशिकाओं के संलयन एक यादृच्छिक प्रक्रिया है। इसलिए, दो बी लिम्फोसाइट या दो मायलोमा कोशिकाओं की संकर उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन उन संकर संस्कृति में एक लंबे समय के लिए जीवित करने में सक्षम नहीं होगा। कोशिकाओं को एक hypoxanthine, aminopterin, और thymidine (टोपी) चयन, जिसके द्वारा ही जुड़े हुए हाइब्रिडोमा कोशिकाओं pyrimidine संश्लेषण की नए सिरे से मार्ग के उपयोग की संभावना के कारण जीवित रह सकते हैं गुज़रना पड़ता है। सोम की पीढ़ी के लिएoclonal एंटीबॉडी, यह एक सेल लाइन एक मां सेल से होने वाले प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। monoclonality कमजोर पड़ने तकनीकों और सेल के विकास के सूक्ष्म विश्लेषण के सीमित द्वारा सुनिश्चित किया जाता है। हाइब्रिडोमा संस्कृति supernatants, विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए जांच कर रहे हैं ज्यादातर एलिसा द्वारा या प्रवाह cytometry, और सबसे अच्छा बाँधने चुने गए हैं। जन संस्कृति और शुद्धि के बाद, एंटीबॉडी अणु अंत में विशेषता है और वांछित आवेदन के लिए मान्य किया जा सकता।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से अंतिम आवेदन के संबंध में, एक गहन और विस्तृत मिलान विश्लेषण की आवश्यकता है, जब एंटीबॉडी लक्ष्य की पहचान करनी चाहिए। यह …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, “Artificial immune reactions,” “Camelid antibodies,” and “Antibody technologies.” We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.
Materials
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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