Abstract
植物は、このような二次代謝産物および組換えタンパク質などの価値のある物質を生成することができます。植物バイオマスからの後者の精製は、熱処理（ブランチング）することによって合理化することができます。葉の熱特性を詳細、 すなわち 、特定の熱容量と熱伝導性で知られている場合、ブランチング装置は、より正確に設計することができます。これらの特性の測定には時間がかかり、労働集約的であり、通常は直接試料に接触侵襲的な方法を必要とします。これは、製品の歩留まりを低下させることができるとのGMPの文脈における封じ込めの要件、 例えば、と互換性がない可能性があります。これらの問題に対処するために、非侵襲性、非接触方法は、約1分での比熱容量と無傷植物の葉の熱伝導率を決定することを開発しました。この方法は、小領域に定義された長さおよび強度の短レーザーパルスの適用を含みます近赤外センサーを用いて測定される温度上昇を引き起こす葉サンプル。温度上昇は、比熱容量を決定するために、既知の葉の特性（厚さ及び密度）と組み合わされます。熱伝導率は、アカウントに熱放射および対流熱伝達を取って、その後の温度低下のプロファイルに基づいて算出されます。関連する計算とサンプルの取り扱いの重要な側面が議論されています。
Introduction
生物材料の大規模な処理は、しばしば、殺菌などの熱処理工程を必要とします。生物学的材料の熱的特性がよく特徴付けられている場合、そのようなプロセスのための装置は、比熱容量（C P、S）及び熱伝導率（λ）を含む、より正確に設計することができます。これらのパラメータは、熱量測定1により、液体、懸濁液およびホモジネートのために容易に決定することができます。しかし、固体試料にこのようなパラメータを測定することは、労働集約的であることができ、多くの場合、サンプルあるいはその破壊2との直接接触を必要とします。例えば、光熱技術は、サンプルと検出器3との間の直接的な接触を必要とします。このような制限は、食品加工の際に許容されるが、このような適正製造基準4の文脈における植物中のバイオ医薬品タンパク質の産生などの高度に規制プロセスと互換性がありません。私nはそのような状況では、熱的特性の繰り返し（ 例えば、毎週）監視は、品質管理ツールとして、個々の植物のための7週間の成長期間中に必要とされ得ます。このような監視が必要と各測定のための葉を消費してしまう場合は、収穫の時に処理するために残されたバイオマスはないだろう。
さらに、植物に負傷の原因となり、再度、プロセス歩留まりを減少、壊死または病原体感染の危険を増大させるだけではなく葉の部分を使用して。試料に直接接触と方法が使用される場合、病原体感染の可能性はまた、植物のバッチ全体が汚染され、センサ装置との接触によって感染することができるリスクを誘導する、増大させることができます。同様の側面は生態生理学的文脈で、 例えば 、干ばつなどの植物ストレスの監視のために考慮しなければなりません。例えば、水の損失は、多くの場合、侵襲的TREを必要とする新鮮なバイオマスの変化によって監視されます例えば 、調査5、下の植物のatment、葉を解剖。代わりに、ここで説明するように、非侵襲的に、サンプルの含水量に依存する比熱容量を決定する、植物の水和状態の代理パラメータとして使用することができます。彼らは実験データを歪曲することができますように、両方のシナリオ（医薬品製造および生態生理学）では、破壊的または侵襲的な測定技術により誘導される人工的なストレスは有害であろう。それらのいずれかがサンプルに直接接触することを必要とするか、または破壊的であるため、そのため、以前に報告されたフラッシュ・メソッド6または銀のプレート7との間のサンプルの配置は、このようなプロセスや実験に適していません。パラメータCはP、S及びλは、生成物の精製を単純化し、製造コスト8-10を低減することができるブランチング工程のための処理装置を設計するために決定されなければなりません。どちらもCP、S及びλは、現在急速に一貫して再現可能な方法11でプロービング非接触、非破壊近赤外（NIR）レーザーによって決定することができ、この新しい方法は、以下に詳細に説明します。この方法で得られた結果を正常タバコにおける熱伝達は、適切な処理装置の設計や、ブランチング温度、対応するパラメータの選択を可能にする、12を出るシミュレートするために使用されました。
この方法は、（ 図1）を設定することが容易であり、2つの主要な工程を含む、それぞれが2段階、測定、解析を、持っています。測定段階では、葉のサンプルを、最初に局所的に短いレーザーパルスによって加熱され、最大試料温度が記録されます。試料の温度プロファイルは、その後、50秒の持続時間のために記録されています。分析フェーズでは、密度など葉特性が（容易にかつ正確にpycnometric measuremによって決定しますENT）、Sを C pを計算するために、最大試料温度と組み合わされます。第2のステップでは、葉の温度プロファイルは、λを計算するために、アカウントに伝導、対流および放射しながら、エネルギー平衡方程式の入力として使用されます。
詳細な手順は、添付のビデオの内容に拡大し、プロトコルのセクションで提供されています。典型的な測定は、結果セクションに表示されます。最後に、この方法の利点と制限は、潜在的な改良と、さらにアプリケーションと一緒にディスカッションセクションで強調表示されます。
図1：葉の熱的特性を決定するために使用される装置。 。比熱容量ルの熱伝導率を決定するために使用される測定装置の写真鳥類。周辺機器（コンピュータ、オシロスコープ）が示されていません。 B。測定装置の概略図。レーザーおよび接続された機器は赤色で強調表示され、温度測定用のNIR検出器は紫色で示されている、葉のサンプルは緑であり、フォトダイオードパワーセンサは青です。 C。 B.と同じカラーコード付き測定セットアップの要素の描画サイズのバーが0.1メートルを示しています。 D。レーザ制御ソフトウェアの典型的な要素を示すスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
1.植物栽培とサンプル調製
- 1-2の脱イオン水L、続いて0.1％の1 Lの[M / V]肥料溶液で各ミネラルウールブロックをフラッシュ。 1タバコ（ タバコやベンサミアナタバコ ）各ブロックのシードとシードを洗い流すことなく、肥料溶液の0.25 Lと優しくフラッシュを配置します。
- そして22分の25°Cの明/暗温度、相対湿度70％、16時間の光周期（λ= 400〜700 nmの- - 1メートル 2 180マイクロモル類）と温室やファイトトロンで7週間の植物を栽培政権。
- 測定装置に植物を移動します。植物が不動である場合は、熱特性を測定するための単一の葉を収穫します。
2.葉の厚さと密度を決定
- 葉の厚さを決定
- リン酸緩衝生理食塩水中の2％[M / V]アガロース溶液（PBS）を調製し、それをオートクレーブ。溶液をダウン40℃まで冷却し、ペトリ皿に入れ、葉試料を埋め込むしよう。 4℃で30分間冷蔵庫でペトリ皿を置くことによって、アガロースを固めます。
- 15°のカミソリ刃の切断角度でビブラトームを用いて200μmのスライスにアガロースブロックをカット。 1.0ミリメートル秒-1と0.5ミリメートルの振幅の切削速度を使用してください。
- マウント固定剤としてのシアノアクリレートを使用してスライドガラス上の5つの横方向の葉の切片。製造元の指示に従って顕微鏡ソフトウェアに組み込まれた測定ツールを使用して、対物レンズ20×、10×倍率の接眼レンズと顕微鏡下葉の厚さを決定します。
- 静脈なしサンプル領域内のリーフの厚さを決定します。
- また、葉身の静脈のない区域で、ダイヤルゲージと葉の厚さを決定します。ダイヤルゲージは、葉身の面に対して垂直に保持されていることを確認してください。
CAUTION：瞬間接着剤は、皮膚刺激性であり、取り扱いに注意されていない場合も一緒に指を接着することができます。
- 葉の密度を決定
- 水でそれを記入し、再び質量（M 1）を決定、その後、乾燥比重瓶の空の質量（M 0）を決定します 。完全に比重瓶を乾燥させ、内側の葉を配置し、一回以上の質量（m 2に）を決定。内側の葉で、慎重に水で比重瓶を埋めると質量（m 3の）を決定します 。
- 式1を用いて、葉の密度（PS）を計算します。
式1：
3.葉の分光透過と反射を決定
- サンプルホールドクランプの間に固定することにより、UV / VIS分光光度計の試料室に葉を置きます。伝送測定の場合、DETの前に葉を置きエクター。反射測定では検出室の後部に葉を配置します。
- 分光光度計の制御ソフトウェアを起動します。 900nmのから1600 nmのスペクトルを選択します。スペクトル曲線に基づいて、UV / VIS分光光度計のソフトウェアによって表示される（μR）新しいスキャンを開始し、送信（μT）の値を記録し、反射。
- 少なくとも3つの生物学的複製物ですべての測定を実行。不均質なサンプルの品質が期待できる場合には5つ以上に生物学的反復の数を増やし、 すなわち、葉の表面形態及び厚さのばらつき。
- 式2および3に従って測定レーザパワーPのレーザーにより測定されたμのTまたはμRの値を乗じて送信（P T）および反射光（P R）の電力を計算します。
式2：ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
式3：
注：送信は、測定時に、フォトダイオードセンサを用いて決定することができる（6.3を参照）。
4.測定装置を設定します
- ステンレス製のホルダーに25.4 mmの直径のコーンにファイバ結合されたシングルバーNIRダイオードレーザー（波長= 1550 nm）をマウントします。 4-6 WにNIRレーザーの出力電力（P レーザー）を設定するようにコントローラを接続します
- 13ミリメートルにビーム幅を調整するためにコーンの終わりに25.4ミリメートルの焦点距離と両凸レンズを配置します。
- 354ミリメートルレンズの下部に以下のフォトダイオードパワーセンサを配置します。その後、1.0の光学濃度とセンサ上記22 mmのセラミック層と減光フィルタを配置することにより、フォトダイオードを減衰させます。
- 同軸ケーブルを使用して、オシロスコープにフォトダイオードパワーセンサを接続します。
- 接続しますレンズ下の308ミリメートル（ 図1）の高さで測定セットアップの足場と6×6センチ試料露出面積を有する10×10cmの枠。 10×10cmの枠にそれを装着することによって空間内の葉の位置を固定します。
- ユニバーサルシリアルバス（USB）ケーブルを使用してパソコンにNIR検出器を接続し、検出器のためのインタフェースソフトウェアをインストールします。
- 135ミリメートルセラミック層の上にレーザー光に対して45°の角度で検出器を配置します。最高温度信号が観察されるまで、センサの位置と角度を変化させることによって、試料上のレーザスポットの検出器の測定領域の位置を合わせます。
- 5 Wの出力レーザパワーと0.5秒のレーザーパルスの持続時間を調整するレーザ制御インターフェースソフトウェアを使用します。レーザパワーのグラフィカルな表現以下の制御オプションウィンドウで、「電流制御」コマンドを選択し、＆＃に「5」と入力してレーザーパワーを調整34;電力[W]時間[s]「フィールド」に「0.5」。フィールド入力することによって、レーザパルス持続時間を調整します」。
- 実験の各セットのための絶対的なレーザパワーを決定するために、実験の各セットの終わりに熱面吸収力センサとフォトダイオードパワーセンサを交換し、サンプルなしで20秒間のレーザ出力パワーを測定します。
5.葉のサンプルを準備します
- 測定のために無傷で損傷していない葉を使用してください。
- 調査に関連する場合は、火気または2-3のためのレーザービームに葉を暴露するか、他のをシミュレートするために他の技術を使用し、ゴム手袋の間葉をこすり、メスで葉を突き刺すことにより、典型的な葉の損傷の種類を模倣します損傷の種類。
- 試料保持クランプ間葉のサンプルを慎重が、すぐにマウントします。
6.温度測定を取ります
- 葉とセラミックとの間の直接的な接触を避けます（第9章を参照）は、C P、S及びλの計算を妨害する人工的な熱伝達を防止するために、フォトダイオードセンサの上方に配置減衰器。
- NIR検出器を経由して60秒の合計葉のサンプルの温度プロファイルを収集するために、温度測定ソフトウェアを使用してください。まず、10秒間の温度ベースラインを記録し、その後0.5秒のためのレーザーをアクティブにし、49.5秒のデータ収集を継続します。
- その後、「測定」と「新計量」をクリックすることで、測定を開始します。その後、熱プロファイルのグラフ表示の上にある緑色の矢印をクリックします。プロファイルのグラフ表示の上に「保存」アイコン（様式化されたディスク）をクリックすることで、温度プロファイルを保存します。
- し、接続されたオシロスコープを用いて葉試料なしで測定のための信号の差を計算することにより、フォトダイオードパワーセンサを使用して送信レーザパワーを確認同軸ケーブルを介してフォトダイオードパワーセンサ（ 図2）へ。
- オシロスコープで取得した電圧プロファイルに2つの側面（F 1、S及びf 2、S）の高さを決定します。
- （1,0およびf 2,0 f）を基準として、葉のサンプルなしで測定を繰り返します。 （ 図2も参照）は式4に従って、これらの測定値の比として送信μTを計算します。
式4：
図2：フォトダイオードパワーセンサを使用して、葉の透過を測定します。 。葉のサンプルのない参照実験のための典型的な電圧プロファイルは、オシロスコープを使用して可視化しました。 B。電圧プロフィール装置に搭載葉サンプルと。両方の場合において、透過したレーザパワーは、二つの側面のそれぞれに比例します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
7.葉のサンプルの比熱を計算します
- 最大葉温T ミリアンペア のx [K]（式5）から室温T 0 [K]を減算することにより、レーザーパルスの間の最大温度差ΔT[K]を計算します。
式5：
- P R [W]は反射されたレーザパワーとP T [W]が透過したレーザである効果的なレーザパワー及びレーザパルス持続時間（数6）に基づいて葉（E S [J]）によって吸収されるエネルギーを計算しますパワー。
EQUAン6：
- dはS [m]は2.1に従ってリーフ厚さである式7）を用いて加熱された葉の面積（ メートルS [キログラム]）の質量を計算し、R レーザー [m]は、レーザスポット、V Sの半径です[メートル3]は加熱された葉の量であり、ρS [キロメートル-3]）が2.2に応じて葉密度です。
式7：
- C pを計算し、S [Jキログラム-1 K -1]加熱葉面積質量m S及び最大温度差ΔTとの積によって吸収エネルギーE Sを分割することにより、式8に記載の方法。
式8：
8.サームのための温度プロファイルデータの準備アル導電率の計算
- * .datファイルとして時間と温度の生データをエクスポートして、スプレッドシートプロセッサでファイルを開くためにNIRセンサー制御ソフトウェアの「書き出し」コマンドを使用します。
- 1適用：使用し、例えば、100個のデータの減少を、「IF（MOD（値; 100）= 0、 "X"、 "0"）」コマンド、0.1秒ごとにデータ点のデータ密度が得られます。
- レーザーがオフにまだあった時の測定の初期10秒以上の各温度プロファイルのための[℃]平均ベースライン温度T Bを計算します。そして、T Bと実際の周囲温度T 0 [°C]との間の差を計算します。
- T 0 = 2.0 K、その後PR温度で、各温度値から2.0 Kを引く- T Bがあれば、例えば 、個別にT 0（Y-正規化）に向けてシフトすることにより、各プロファイルを正規化するために、この違いを使用して、OFILE（ 図3A）。
- 最大試料温度（T max）は前にすべてのデータポイントを削除することにより、各温度プロファイル（X-正規化）の座標およびT maxは （ 図3B） のためのT = 0から始まる新しい時間値を割り当てる時間を正規化します。
- 彼らはアーティファクト（ 図3Cを測定するために対応するので、画面典型的には3×0.31 Kで急激な温度変化のための各プロファイル3倍以上のベースラインのノイズレベルであり、すなわち、温度差、≈1.0 K.は、データセットからこれらの領域を削除します）。
- [S] T T [K]は、時刻tにおけるフィット葉試料温度であり、スプレッドシート・プロセッサを使用して、データに指数関数的減衰関数（式9）を取り付け、T 0は周囲温度であり、A [K]は振幅そして、t 1 [s]は崩壊定数（ 図3D）。
式9：
- レーザーパルスの後0-80秒から葉のサンプルの温度低下を計算するために取り付けられた関数を使用します。
- 各温度データ点（ 図3E）に273.15の値を加算することにより、[K]スケール[℃]で測定した温度データを変換します。
図3：λの計算のためのデータ処理方式。 。データ整理した後、温度プロフィルは、周囲温度に正規化されます。 B。次に、最大試料温度（T max）は前のすべてのデータ点が除去されます。 C。 （「不整合」データセットに示されている）の測定アーチファクトがTHよりも大きい温度変化に基づいて同定されREE回のベースラインノイズや指数関数の前にフィッティングをデータセットから削除しました。 D。摂氏温度スケールはケルビンスケールに変換されます。各時間間隔について、Eは、λは、温度プロファイルに基づいて算出されます。 F。 20秒のウィンドウは、関連する温度変化を観察することができる定義されています。 G。選択された時間ウィンドウに基づいて、平均値と標準偏差がλについて計算されます。 H。二つの異なるタバコ（N. tabacum）の葉試料のための代表的な結果。オレンジ色の矢印や線は、提示されたデータに対応する処理ステップの効果を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
葉のサンプルの熱伝導率の9計算
- 温度differeを計算葉のサンプルとΔTxは [K]は温度差である式10に従って、各0.1秒間隔の環境との間のNCEは、T T [°C]はフィット葉の試料温度であり、T 0 [°C]周囲温度（ 図3E）。
式10：
- 温度の低下は対流熱伝達、熱放射と熱伝導の複合効果によるものであることを前提としています。 ΔEの温度 [J]は二つの連続する時点における試料の熱エネルギーの差であり、ΔE ラジアン [J]は、エネルギー差であるλを計算するための基礎として、対応するエネルギーバランス（式11）を使用し熱放射に、ΔEがCONV [j]が原因で対流熱伝達にエネルギー差であり、Δ; E 指揮 [J]は熱伝導へのエネルギー差です。
式11：
- ΔTtは [K]がフィット葉の試料温度の差である式12、単位のない放射率ε、σ[キログラム秒-3 K -4]ステファンを得た実際の物理的性質とエネルギーバランスの一般的な用語に置き換えて-Boltzmann定数、 ラジアン [M 2]熱放射の面積、H [J秒-1 M -2 K -1]対流熱伝達係数、CONV [m 2]と対流熱伝達面積は、cond [m 2]と熱伝導とlの面積[m]の特性長。
式12：
- キャラを計算相関関係に基づいてcteristic長さl： リットル= V / A。
- [M 2]を算出するために加熱されたサンプルの容積V Sと葉のサンプルの断面積を使用してください。断葉面積は、condが伝導R レーザは、レーザスポットの半径であり、d sは葉の厚さで、発生する領域である式13に記載CONDに相当します。
式13：
- レーザーは、レーザースポットの面積である式14に従ってラジアンとコンバージョンを計算します。
式14：
- 式（11）に代わり、式9、図12、図13 およびt レーザが Tである式15が得られ、λ後者の解決彼は、レーザーパルスの持続時間[秒]。
式15：
- εのための0.94の値を想定し、温度プロファイルの最初の20秒にわたる各0.1秒の時間間隔でλを計算します。このようにして得られたλのための200の値を平均値と標準偏差（ 図3F - H）を計算します。
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Representative Results
葉特性の測定
上記の顕微鏡法を用いて、0.22から0.29×10の葉の厚さ-とN.ベンタミアナ （0.26±0.02×10 - - 3メートルはN.タバカム （3メートルはn = 33 0.25±0.04×10）の両方について測定しました以前に、様々な植物種3の葉について報告さ3メートルの範囲- 0.20から0.33×10の範囲内である3メートル 、N = 24）、。顕微鏡測定からの結果の1標準偏差内であった3メートル （N = 10）、 -ダイヤルゲージで厚みを決定することは、〜0.28×10の値が得られました。適用が容易であったようにこのように、ダイヤルゲージの測定は、日常用途で厚決意のために顕微鏡法よりも好ましいですCのP、Sおよびʎの結果は、より労働集約的な技術から10％未満を外れました。 631〜918キロmを一致する3（N = 20）、 - - 3範囲以前に他の種3で葉のために報告されたタバコ（N. tabacum）とベンサミアナタバコの葉の密度が750±10キロのmでした。
比熱の計算
最高温度（T 最大）が 1秒未満以内に到達するまで、 ニコチアナ種について収集した温度プロファイルは、レーザーパルスの時間急速な増加を示しました。パルスの後、温度は、周囲温度（T 0）（ - E 図3A）に達するまで指数関数的に減少しました。比熱容量（c pは、よ N.タバカムのために-1 K -1を kgおよび2252±285 Jはkgで-1 K -1を ベンサミアナタバコのために323±3661の8降伏値を算出しました。二つの栽培の設定と持続時間は、それぞれのために使用されました 種（セクション1.2を参照）が、これは、C pの影響を及ぼさなかった、S（ 図4）。しかし、C pは、値がGG -1 [水分含有量に相関N.タバカム （ 図4A）の場合には、古い（下）から若い（上）葉（R 2 = 0.85）まで直線的に減少しました。■収穫時の湿潤バイオマスの差及び60°C 11で72時間のインキュベーション後の質量として測定されたバイオマス]。含水量と比熱容量との間のこの相関関係は、他の著者13による以前の観察と一致しました。逆相関はN. benthamiaのために観察されましたタバコ（N. tabacum）のための21％に比べわずか13％であった;（R 2 = 0.79）、成熟度の異なる葉の比熱の差（トップ=若いボトム=古いが）ナ。この差は、 ベンサミアナタバコの葉の水分含有量は葉の成熟11の異なる程度にわたってほぼ一定であるという事実に由来してもよいです。感度分析は、C Pの差は、sは 、式8に測定パラメータの変動の影響比例したことを明らかに反映し、これらのパラメータは、式7の個々の要素は、従ってなかったため、透過したレーザパワーは、サブ比例し、これら2つのパラメータの誤差の影響は、レーザパワーまたは周囲温度の変動によるものよりも小さかったです。 C pの計算に関与するすべてのパラメータは、sは係数を有しているため、一般的に、測定は、堅牢であると考えられました10％未満の変化（ 図4CおよびD）。
図4：比熱と熱伝導率の値は、 タバコ（N. tabacum）とベンサミアナタバコのために決定します。 。比熱容量や植物の葉上の葉の位置に応じてタバコ（N. tabacum）の熱伝導率（底=古い葉;真ん中=成熟した葉;トップ=若葉）。星と三角形はそれぞれ、49および56日齢の植物を示しています。 B。比熱容量とN.ベンタミアナの熱伝導率は、植物上の葉の位置に応じて残します。星と三角形はそれぞれ、ファイトトロンまたは温室で栽培した植物を示します。 C。入力パラメータの変化に比熱容量値の感度。 Trのianglesは比熱容量（上、赤色）10％の増加に起因する値または単一のモデルパラメータの減少（下、青色）を示します。 D。入力パラメータの変化への熱伝導率値の感度。三角形は、単一のモデルパラメータの10％（上向き赤、）増減（青、下方向）から得られた靴の熱伝導率の値をマーク。 CとDで、彼らは10％の変動感度分析中に得られた値の完全な範囲を表しているAとBにおけるエラーバーは、標準偏差（≧3）を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
熱伝導率の計算
熱伝導率（ʎ）は指数関数によって温度プロファイルから算出しました導電性および対流熱伝達だけでなく、熱放射のための方程式と組み合わせたフィッティング（ 図3）。 1秒- - 1 K - 1（N = 19） タバコ（N. tabacum）および0.41±0.20 J mの- 1秒- 1 K - 1（N = 25）N.のための式（15）は、0.49±0.13 J mの平均値が得られましたベンタミアナ 。葉の年齢とʎ間の相関が、他の植物種14で以前に報告された年齢依存性の違いと一致する、 ベンサミアナタバコ （ 図4B）のために観察されたがʎと植物の年齢や栽培の設定の間には相関関係は、ありませんでした。上述したように、それは、 ベンサミアナタバコのための成熟度を変化させるのリーフを横切る均質であることが見出されたように、水の含有量は、この違いのためにそうな理由でした。その代わりに、我々はリットルでその変化を推測しますEAF組織、 例えば 、細胞壁組成物、葉の熱伝達特性を変化させるので、ʎの値に影響を与えることによって、この観察を担当しました。 ʎの決意は、周囲温度の変化に敏感でした。感度分析は、±2.3 Kの変動は64から125%によってʎの値を変更したことを明らかにしました。式15によれば、周囲温度が熱放射上の4の力で効果があり、したがって、直接ʎの値に影響します。
測定装置の評価
3時間以内に測定アセンブリを設定することが可能でした。これが完了したら、システムの起動時間を計測系列当たり約15分でした。単一の測定は、試料調製及び全測定サイクルを含め、以下3分を要しました。レーザ露光時間の分析はことを明らかにしました0.5秒の加熱時間は、19.9±4.3°C（N = 55）の温度上昇をもたらし、良好な信号対雑音比（SNR）のために必要な（長いレーザパルスによって達成される）高いΔTの間で最良の妥協点であったと（短レーザーパルスによって達成される）低ΔTは、組織の損傷を回避するために必要。 0.5秒より長いパルス持続時間は、42.9±4.2°C（Nに対し、おそらく70℃に到達した試料温度と水の蒸発および/または葉組織への損傷を反映して、試料からの質量損失をもたらし= 55）を0.5秒レーザパルスを観察しました。 0.5秒未満、温度±0.31 Kのノイズ（標準偏差、N = 25）の持続時間ΔTの5％以上を占め、従ってΔTの重要な部分でした。これとは対照的に、0.5秒でのノイズは、信号の2.5％のみを占め、したがって、重要でないとみなされました。また、サンプルがある以上〜45℃に加熱しませんでしたそのタバコ植物は、サブ熱帯の生息地に自然の熱帯ににさらさことができ、温度がツンドラの生息地15に見られる植物種にのみ有害です。自然太陽放射は1.0〜1.4キロワットM -2 16,17の範囲であるのに対し、レーザーのパワー密度は、170キロワットメートル-2でした。最近発表された顕微鏡分析11によって示されるようにしかし、パルスの非常に短い時間のために、この高いエネルギー量は、おそらく葉組織を損傷しませんでした。唯一のこの期間中に、サンプルの温度信号の5％未満を占める（0.31 K±）ノイズをしたので、重要でないと見なされたためʎを計算するために使用される温度データは、レーザーパルスの後、最初の20秒に制限されていました。 20秒の時間枠を超えてからの温度データを用いた場合、ʎのために計算された値は、（ 図3F）減少しました。可能な説明は仮定のものもありましたΔTの低い値には適用されませんでしたʎの計算のために作られました。それは温度の前後力に影響されるので、特に、式（15）に熱放射を表す用語は、影響を受けている可能性があります。また、レーザーで露光サンプルスポットを囲む葉面積は、わずかに加熱している可能性がありますので、効果的なΔTxと最終的に計算されたʎを削減するモデルで想定している理想的なヒートシンクされていない可能性があります。
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Discussion
上述した非接触、非破壊測定方法は、同時かつ再現可能な方法でのC、P、S及びʎを決定することができます。特にʎの計算はエラーに敏感であるいくつかのパラメータに依存します。それにもかかわらず、これらの誤差の影響は、線形またはサブ比例のいずれかであり、すべてのパラメータの変動係数は10％未満であることが見出されました。この方法は、このようにロバストと見なすことができるにもかかわらず、いくつかの技術的な改善が誤差の残りの原因を低減させることができます。
アセンブリ内に試料をマウントすると、平らな葉の表面は、測定のために好適であるため、技術的に困難であったが、サンプルは自然の起伏面を有しています。この問題は、好みにサンプルをクランプ、正確葉のサンプル、 例えば 、葉の厚さ及び幅に調整ジオメトリを持つ専用の試料ホルダを設計することによって克服することができでき向き。このアプローチは、測定がより再現になるだろうが、サンプルとホルダとの間しっかり接触は、葉の表面を平坦に引っ張るために必要とされるため、測定の非接触の性質を損なうことになります。ホルダーのこの種を使用することの利点は、従って、測定の精度や非接触の性質が最も重要であるかどうか、すなわち 、測定の状況に依存します。これとは対照的に、このような考慮は、本質的に平坦な表面、 例えば、イネおよび関連種で、葉のために全く必要ではないかもしれません。
これは強く両方のC P、Sの計算に影響を与え、18を ʎので、サンプルの環境における空気の動きに起因する対流熱伝達は、測定中に最小限に抑える必要があります。装置は、したがって、このようなとコンピュータなどの空調システム、ラジエータや他の機器によって発生する空気流から離れて配置する必要があります一体型の冷却ファン。空気の動き20によって増加させることができる前に、または蒸発による測定中に発生する可能性がある葉19、の相対的な水分含有量の変化は、モデルにおいて考慮されていなかったので、これもまた重要です。プロトコルセクションに記載したようにこのように、測定値は、特に切り離さ葉で、データ取得中にエラーを回避するために迅速に行われるべきです。測定が実施湿度制御を有する少なくとも部分的に囲まれた測定室で行われた場合、将来的に、測定上の蒸発の影響を低減または回避することができます。
CのP、S及びʎ値の精度は、より正確に対応する式で使用するパラメータを測定することによって増加させることができます。 C pの場合には、これらのパラメータは、レーザパワー、最大周囲温度と試料体積、 すなわち 、ラスの生成物です。■ERスポット面積と厚さ、およびサンプル密度（式8）。後者の2つのパラメータは、実際の測定に付随する実験で決定されなければならない、いくつかの代表的な生物学的複製が試験される場合、それらの信頼性を向上することができます。しかし、単純なダイヤルゲージの測定を使用した場合でも、顕微鏡分析と比較して、葉の厚さの差が同程度によってCのP、S及びʎために計算された値に影響を与えただけでは11％でした。対照的に、温度とレーザパワーを測定を通して監視することができます。これらのオンラインデータは、レーザパワー、周囲温度のために固定値の代わりに使用されている場合、C pの精度は、Sを向上させることができ、データが十分に較正センサを使用して収集されます。これらの考察はまたʎに適用されますが、両方は4の力で計算値に影響するため、周囲と試料温度が最も重要なパラメータです。
ʎの現在の計算は、対流熱伝達と熱放射に関するいくつかの仮定に基づいていました。例えば、放射率（ε）と対流熱伝達係数（h）は測定されなかったか、上記の方法で明示的に計算されたが、以前の刊行物18,21-に由来しました。 ʎの精度は、従って、実際の測定条件で、これら2つのパラメータを決定することによって改善することができます。しかし、計算のために文献データを使用して、それにもかかわらず、実験的に同様の特性が原因タバコ種およびそれらの生理機能、 すなわち、草本植物3への系統発生を期待することができるため、他の植物種のために定められた範囲内であったʎ値が得られました。 εおよびhの値は、 例えば 、以前に植物において、これらの値に対して報告範囲全体にわたってεのための0.93から0.98に変化させた場合でも、 21、ʎの最終値に及ぼす影響は、ここで観察された自然変動の範囲内したがって、<10％であったと。
上記の方法だけでなく、完全な無傷の葉及び取り外し葉の熱的特性を決定することができたが、それはまた正確に測定する前に意図的に導入され、より重大な損傷の種類を同定しました。したがって、葉のサンプルの異なるタイプが、分析前に、低品質のデータを生じる任意の悪いサンプルを除去するためのツールを提供し、容易に区別することができます。サンプルは、C、P、Sの点で仕様を満たしていないとʎはさらなる処理から除外することができ、例えば、生物学的物質を監視する場合、この機能は、品質管理のために使用することができます。これは、このような分子農業4のように高度に制御プロセスのコンテキストでの資産となるでしょう。
で、他と比較して、この新しい方法の利点文献には、迅速なサンプルの取り扱い、最小限の準備、CのP、Sおよびʎの非接触かつ非破壊同時測定、及び多くの光学研究所で見つけることができる一般的な機器の使用を含みます。これは、示差走査熱量計などの専門と高価な機器を必要とするものに比べて方法のより広範なアプリケーションを容易にします。また、熱量測定は、サンプル22との直接接触を必要とするので、損傷の危険性があり、この方法は、通常、比熱容量22の測定に限定されます。これとは対照的に、熱画像のに対し、壊死または非接触様式23で葉や植物全体の物理的変化を検出することができ、それはまた、より安く、より強力なIRカメラが、将来的に克服される可能性があり、複雑な画像解析と専用の特殊な装置24を必要としますそして、周辺機器を伴います。スペクトル分析は、他のコンタクト-FRでありますEEの含水量とクロロフィルレベル25の分析のための方法であって、まだ固有の熱容量および/または熱伝導率を決定するために使用されていません。
本明細書で報告された測定手法は、プラントの熱的性質を決定するためのロバストな方法は、低投資コスト及び短い測定時間での葉です。それは成功し、 タバコ（N. tabacum）とベンサミアナタバコ 内のC P、Sおよびʎを決定するために、分子農業4の領域に関連する2種を使用しました。葉の温度プロファイルに基づいて、両方のパラメータに計算された値は、以前に他の植物種3について報告されたものとよく一致しました。この方法は、非破壊、非接触で、かつ熱的特性の解析のために、現在のすべての代替方法に勝る利点を提供し、複雑な試料調製を必要としません。シンプルなデザインも手-HELの開発を容易にすることができますD装置は、柔軟性を増加させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" tube | Thorlabs | SM1L10E | Tube for fiber holder |
| Agarose | Sigma Aldrich | A0701 | Agarose |
| Bi-Convex lense f=25.4 | Thorlabs | LB1761 | Lense |
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | Thorlabs | PM100D | Console for thermal surface absorber sensor |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO7104 | Oscilloscope |
| DMR light microscope | Leica | n.a. | Light microscope |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-2 | Pycnometer |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Fiber holder | Thorlabs | Fiber holder | |
| Forma -86 °C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Infrared Detector Optris CT | Optris | OPTCTLT15 | Infrared detector |
| Infrared Detector Software Compact Connect | Optris | n.a. | Control software for infrared detector |
| Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer | PerkinElmer | L1050 | UV/VIS Spectrophotometer |
| Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module | DILAS | M1F-SS2.1 | Laser |
| Laser cover | Amtron | LM200 | Laser Cover |
| Laser Driver | Amtron | CS 408 | Laser Driver |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Photodiode sensor | Thorlabs | PDA20H-EC | Power sensor for transmission measurements |
| Precision weight Ohaus Analytical Plus | Ohaus | 80251552 | Precision weight |
| Sample frame | Fraunhofer ILT | n.a. | Fixation of the leaf sample |
| Software Pyro Control | Amtron | n.a. | Laser Power Control Software |
| Stainless-steel-holder | n.a. | n.a. | Holder for measurement set-up |
| Teflon plates 2 cm | Fraunhofer ILT | n.a. | Teflon attenuation |
| Thermal surface absorber Power sensor | Thorlabs | S314C | Sensor for laser power measurements |
| Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome |
| Zoc/Pro 6.51 | EmTec Innovative Software | n.a. | Laser Control Software |
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