Abstract
Planten kunnen waardevolle stoffen zoals secundaire metabolieten en recombinante eiwitten. De zuivering van deze uit plantaardige biomassa op elkaar afstemt door warmtebehandeling (blancheren). Een blancheren inrichting kan nader worden ontworpen als het thermische eigenschappen van de bladeren in detail, dat wil zeggen, de soortelijke warmte en thermische geleidbaarheid bekend. Het meten van deze eigenschappen is tijdrovend en arbeidsintensief, en meestal vereist invasieve methoden die rechtstreeks contact opnemen met het monster. Dit kan het product opbrengst te verminderen en kunnen onverenigbaar zijn met insluiting eisen zijn, bijvoorbeeld in het kader van de goede praktijken bij het vervaardigen. Om deze problemen aan te pakken, werd een niet-invasieve, contactloze methode ontwikkeld die de specifieke warmtecapaciteit en thermische geleidbaarheid van een plant blad intact in ongeveer één minuut bepaalt. De werkwijze omvat de toepassing van een korte laserpuls van gedefinieerde lengte en intensiteit tot een klein gebied van debladmonster, waardoor een temperatuurstijging die wordt gemeten met een nabij-infrarood sensor. De temperatuurstijging wordt gecombineerd met bekende eigenschappen blad (dikte en dichtheid) aan de specifieke warmtecapaciteit bepalen. De thermische geleidbaarheid wordt dan berekend op basis van het profiel van de daaropvolgende daling temperatuur, waarbij thermische straling en convectie warmteoverdracht rekening. De bijbehorende berekeningen en kritische aspecten van het monster handling worden besproken.
Introduction
De grootschalige verwerking van biologische materialen vereist vaak warmte-behandelingsstappen, zoals pasteurisatie. Apparatuur voor dergelijke processen kan nauwkeuriger worden ontworpen indien de thermische eigenschappen van het biologisch materiaal goed gekarakteriseerd, inclusief de specifieke warmtecapaciteit (c p, s) en warmtegeleidingsvermogen (λ). Deze parameters kunnen gemakkelijk worden bepaald voor vloeistoffen, suspensies en homogenaten door calorimetrie 1. Echter, het meten van deze parameters in vaste stoffen arbeidsintensief en vereist vaak direct contact met het monster of de vernietiging 2. Bijvoorbeeld, fotothermische technieken vereisen direct contact tussen het monster en de detector 3. Dergelijke beperkingen zijn tijdens de verwerking van levensmiddelen acceptabel, maar niet verenigbaar zijn met sterk gereguleerde processen zoals de productie van biofarmaceutische eiwitten in planten in het kader van de goede praktijken bij het vervaardigen 4. ikn dergelijke context herhaald (bijvoorbeeld wekelijks) bewaking thermische eigenschappen worden gedurende zeven weken groeiperiode individuele bedrijven als kwaliteitscontrole gereedschap nodig. Indien een dergelijke controle vergt en verbruiken blad voor elke meting, zou er geen biomassa links te verwerken bij de oogst.
Bovendien zou het gebruik alleen bladdelen plaats zou veroorzaken verwonding aan de plant en het risico van necrose of pathogeen infectie opnieuw verminderen het proces opbrengst. De kans pathogeen infectie kan ook toenemen indien een methode met rechtstreeks contact met het monster worden gebruikt, induceren het risico dat een gehele partij planten kunnen worden geïnfecteerd door contact met besmette sensorinrichting. Vergelijkbare aspecten moeten worden overwogen voor de bewaking van installaties benadrukt, zoals droogte, bijvoorbeeld in een ecofysiologische context. Zo wordt waterverlies vaak gevolgd door een verandering in de verse biomassa, die een invasieve tre vereistatment van de planten in het kader van het onderzoek 5, bijvoorbeeld, het ontleden van een blad. In plaats daarvan bepalen van de soortelijke warmte, die afhangt van het watergehalte van een monster op een niet-invasieve manier zoals hier beschreven, kan worden gebruikt als een surrogaat parameter voor vochtstatus planten. In beide scenario's (farmaceutische productie en ecofysiologie), zou kunstmatige spanningen veroorzaakt door destructieve of invasieve meettechnieken schadelijk zijn als ze de experimentele gegevens kunnen verstoren. Daarom eerder beschreven flitsmethoden 6 of het plaatsen van monsters tussen zilver platen 7 zijn geschikt voor dergelijke processen en experimenten omdat ze ofwel direct contact met het monster nodig hebben of destructief. De parameters c p, s en λ moeten worden bepaald om de procesapparatuur te ontwerpen voor een blancheerstap die productzuivering kan vereenvoudigen en dus vermindering productiekosten 8-10. beide cp, s en λ kunnen nu snel worden bepaald door contactvrije non-destructieve nabij infrarood (NIR) laser sonderen op consistente en reproduceerbare wijze 11 en deze nieuwe methode wordt hieronder in detail toegelicht. De met deze werkwijze verkregen resultaten werden met succes gebruikt voor warmteoverdracht simuleren tabaksbladeren 12, waardoor het ontwerp van geschikte apparatuur en de selectie van overeenkomstige parameters zoals de temperatuur blancheren.
De methode is eenvoudig op te zetten (figuur 1) en heeft twee fasen, meting en analyse, die elk twee belangrijke stappen. In de meting fase wordt een blad monster eerste lokaal verwarmd door een korte laserpuls en de maximale temperatuur van het monster wordt vastgelegd. Het temperatuurprofiel van het monster wordt vervolgens geregistreerd voor een periode van 50 s. In de analysefase, blad zoals densiteit (gemakkelijk en nauwkeurig bepaald pyknometrische measurement) worden met de maximale monstertemperatuur te cp berekenen, s. In de tweede stap wordt het blad temperatuurprofiel gebruikt als input voor een energiebalans vergelijking, waarbij geleiding, convectie en straling, houdt, λ berekenen.
Uitvoerige stap-voor-stap instructies vindt u in de sectie protocol, dieper ingaan op de inhoud van de bijbehorende video. Typische metingen worden vervolgens getoond in de sectie resultaten. Tenslotte, de voordelen en beperkingen van de werkwijze worden toegelicht in de bespreking doorsnede met potentiële verbeteringen en verdere toepassingen.
Figuur 1: apparatuur die wordt gebruikt om blad thermische eigenschappen te bepalen. A. Foto van de meetinrichting gebruikt om de specifieke warmtecapaciteit en warmtegeleidingsvermogen van le bepalenAves. Randapparatuur (computers, oscilloscoop) niet getoond. B. Schematische weergave van de meetinrichting. De laser en de aangesloten apparatuur zijn rood gemarkeerd, wordt de NIR detector voor temperatuurmeting getoond in paars, het blad monster is groen en de fotodiode stroom sensor is blauw. C. Tekening van de elementen van de meetopstelling met dezelfde kleurcode als in B. De maat balk geeft 0,1 m. D. Screenshot illustreert de typische elementen van de laser besturingssoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plantenteelt en Monstervoorbereiding
- Spoel elke minerale wol blok met 1-2 liter gedeïoniseerd water en vervolgens met 1 liter 0,1% [m / v] kunstmestoplossing. Plaats een tabak (Nicotiana tabacum of N. benthamiana) zaad in elk blok en voorzichtig spoelen met 0,25 L van kunstmest oplossing zonder wegwassen van het zaad.
- Cultiveren van de planten gedurende 7 weken in een kas of phytotron met 70% relatieve vochtigheid, een 16-h fotoperiode (180 umol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) en een 25/22 ° C licht / donker temperatuur regime.
- Verplaats de planten aan de meetapparatuur. Wanneer deze planten onvoldoende bewegen oogst single verlaat voor het meten van thermische eigenschappen.
2. Bepaal Leaf dikte en de dichtheid
- Bepaal het blad dikte
- Bereid een 2% [m / v] agarose oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) enautoclaaf het. Laat de oplossing afkoelen tot 40 ° C en insluiten bladmonster geplaatst in een petrischaal. Stollen de agarose door het plaatsen van de petrischaal in een koelkast bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Snijd de agarose blok in 200 pm plakjes met behulp van een vibratoom met een scheermesje snijhoek van 15 °. Gebruik een snijsnelheid van 1,0 mm s-1 en een amplitude van 0,5 mm.
- Mount vijf transversale paneeldelen op een glasplaatje behulp cyanoacrylaat als fixeermiddel. Bepaal vleugeldikte onder een microscoop met een 20 x objectief en een oculair met 10x vergroting via de meetinstrumenten ingebouwd in de microscoop software volgens de instructies van de fabrikant.
- Bepaal het blad dikten in de steekproef gebieden zonder aderen.
- Als alternatief, bepalen het blad dikte met een dial-gauge in een ader-vrije zone van het blad. Controleer de dial-gauge gehouden loodrecht op het vlak van het blad.
CAUTION: cyanoacrylaat is een irriterend voor de huid en kan ook vingers aan elkaar te lijmen, zo niet met zorg behandeld.
- Bepaal het blad dichtheid
- Bepaal de lege massa (m 0) van een droge pyknometer, dan vullen met water en opnieuw bepalen van de massa (m 1). Droog de pyknometer geheel, plaats een blad binnen en wordt de massa (m 2) te klikken. Met het blad binnen, zorgvuldig vullen de pyknometer met water en het bepalen van de massa (m 3).
- Bereken het blad dichtheid (PS) met behulp van Vergelijking 1.
Vergelijking 1:
3. Bepaal de Spectral Transmission en Reflectie van Bladeren
- Plaats een blad in de steekproef kamer van een UV / VIS spectrofotometer door de vaststelling van deze tussen-sample met klemmen. Voor transmissiemetingen, plaats het blad voor het det Ector. Voor reflectie plaats metingen het blad aan de achterzijde van de detectiekamer.
- Start de spectrofotometer besturingssoftware. Selecteer een spectrum van 900 nm tot 1600 nm. Een nieuwe scan starten en de waarden voor de transmissie (T μ) en reflectie (R μ) weergegeven door de UV / VIS spectrofotometer software op basis van de spectrale curve te nemen.
- Voer alle metingen met ten minste drie biologische repliceert. Toename van het aantal biologische herhalingen vijf of meer als een heterogeen monster kwaliteit kan worden verwacht, dat wil zeggen variaties in bladoppervlak morfologie en dikte.
- Bereken het vermogen voor transmissie (PT) en reflectie (PR) door vermenigvuldiging van de gemeten μ μ T of R-waarden van de gemeten laservermogen P Laser volgens de Vergelijkingen 2 en 3.
Vergelijking 2:ftp_upload / 54835 / 54835eq2.jpg "/>
Vergelijking 3:
NB: De transmissie kan ook worden bepaald met een fotodiode sensor tijdens de meting (zie 6.3).
4. Stel de meetapparatuur
- Monteer een gevezelde één bar NIR diodelaser (golflengte = 1550 nm) in een 25,4-mm diameter kegel op een roestvrij stalen houder. Sluit een controller om het uitgangsvermogen (P Laser) van de NIR laser ingesteld op 4-6 W.
- Plaats een bi-convexe lens met een brandpuntsafstand van 25,4 mm aan het einde van de conus de bundelbreedte passen aan 13 mm.
- Plaats een fotodiode krachtsensor 354 mm onder de onderkant van de lens. verzwakken dan de fotodiode door een grijsfilter met een optische dichtheid van 1,0 en een 22-mm keramische laag boven de sensor.
- Sluit de krachtsensor fotodiode op een oscilloscoop met een coaxiale kabel.
- aansluiteneen 10 x 10 cm frame dat een monster cm belichtingsgebied 6 x 6 met het skelet van de meetopstelling op een hoogte van 308 mm onder de lens (figuur 1) heeft. Bevestig het blad positie in de ruimte door het monteren van het in de 10 × 10 cm frame.
- Sluit een NIR detector op een personal computer met behulp van een Universal Serial Bus (USB) kabel en installeer de interface software voor de detector.
- Plaats de detector bij een 45 ° hoek met de laserbundel 135 mm boven de keramische laag. Lijn het meetgebied van de detector om de laserspot op het monster door het variëren van de sensor positie en hoek tot de maximale temperatuursignaal wordt waargenomen.
- Gebruik de laser besturingsinterface software om de output laservermogen tot 5 W en de duur van de laserpuls 0,5 s te passen. Selecteer de opdracht "Current control" in het venster bedieningsopties onder de grafische weergave van het laservermogen en stel het laservermogen door het intikken van "5" in het & #34; Vermogen [W] ". Veld Pas de laserpuls duur door het intikken van" 0.5 "in het" veld "Tijd [s].
- De absolute laservermogen voor elke reeks experimenten bepalen vervangt de fotodiode krachtsensor met een thermisch absorber krachtsensor aan het eind van iedere serie experimenten en meet de laser uitgangsvermogen 20 s zonder monster.
5. Bereid de Leaf Samples
- Gebruik intact en onbeschadigd bladeren voor de metingen.
- Indien relevant voor het onderzoek, na te bootsen typische soorten blad schade door het doorboren van het blad met een scalpel, wrijven het blad tussen latex handschoenen, het blootstellen van het blad aan open vuur of een laserstraal voor 2-3 s, of gebruik maken van andere technieken andere te simuleren soorten schade.
- Zorgvuldig maar al snel te monteren het blad monster tussen-sample met klemmen.
6. Neem de temperatuurmetingen
- Vermijd direct contact tussen het blad en de keramischedemper boven de fotodiode sensor geplaatst om kunstmatige warmteoverdracht die interfereert met de berekening van de c p, s en λ te voorkomen (zie paragraaf 9).
- Gebruik de temperatuurmeting software om het temperatuurprofiel van het blad monster te verzamelen voor een totaal van 60 s via de NIR detector. In de eerste plaats nemen de temperatuur basislijn voor 10 s, dan is het activeren van de laser voor 0,5 s en blijven het verzamelen van gegevens voor 49,5 s.
- Start een meting door te klikken op "Measurement" en vervolgens "nieuwe meting". Daarna op de groene pijl boven de grafische weergave van het thermisch profiel. Sla de temperatuur profiel door te klikken op het pictogram "Save" (een gestileerde schijf) boven de grafische weergave van het profiel.
- Bevestigen uitgezonden laservermogen met de krachtsensor fotodiode door berekening van het verschil in signaal voor metingen met en zonder bladmonster met een oscilloscoop verbondende fotodiode energiesensor via een coaxiale kabel (figuur 2).
- Bepaal de hoogte van de twee flanken (f 1, f2 en S, S) in de spanning belangrijk geworden met de oscilloscoop.
- Herhaal de meting zonder een blad monster als referentie (f 1,0 en f 2,0). Bereken μ transmissie T als de verhouding van de metingen volgens vergelijking 4 (zie ook figuur 2).
Vergelijking 4:
Figuur 2: Het meten blad transmissie met behulp van een fotodiode stroom sensor. A. Typische profiel spanning voor een referentie-experiment zonder een blad steekproef gevisualiseerd met behulp van een oscilloscoop. B. spanningsprofielmet een blad monster aangebracht in de inrichting. In beide gevallen, het uitgezonden laservermogen evenredig is met elk van de twee flanken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Bereken de soortelijke warmte van de Leaf Sample
- Bereken het maximale temperatuurverschil AT [K] tijdens de laserpuls door het aftrekken van de kamer temperatuur T 0 [K] van de maximale blad temperatuur T ma x [K] (vergelijking 5).
Vergelijking 5:
- Bereken de energie geabsorbeerd door een blad (E S [J]) op basis van de effectieve laservermogen en laserpuls duur (Vergelijking 6), waarbij P R [W] is het gereflecteerde laservermogen en P T [W] is de uitgezonden laser macht.
Equatie 6:
- Bereken de massa van het verwarmde bladoppervlak (mS [kg]) gebruikt Vergelijking 7, waarbij d S [m] is vleugeldikte volgens 2,1), r Laser [m] de straal van de laserspot, Vs [ m 3] is verwarmd bladvolume en S ρ [kg m -3] de bladerdichtheid naar 2,2).
Vergelijking 7:
- Bereken c p, s [J kg -1 K -1] volgens vergelijking 8 wordt door het geabsorbeerde energie E S door het product van de verwarmde bladoppervlak massa mS en maximale temperatuurverschil AT.
Vergelijking 8:
8. Bereid de temperatuur profiel gegevens voor Thermal geleidbaarheid Berekeningen
- Gebruik de opdracht van de NIR sensor control software "Exporteren" om de tijd en de temperatuur ruwe gegevens exporteren als een * .dat bestand en open het bestand in een spreadsheet processor.
- Toepassen 1: 100 datareductie, bijvoorbeeld met behulp van een 'IF (MOD (Value; 100) = 0, "x", "0") "commando, waardoor een gegevensdichtheid van één gegevenspunt per 0,1 s.
- Bereken de gemiddelde basislijn temperatuur TB [° C] voor elk temperatuurprofiel over de eerste 10 s van een meting, waarbij de laser nog af. Vervolgens berekent het verschil tussen TB en de werkelijke temperatuur T 0 [° C].
- Gebruik dit verschil aan elk profiel afzonderlijk normaliseren door een verschuiving richting T 0 (y-normalisatie), bijvoorbeeld, als T B - T 0 = 2,0 K, dan aftrekken 2,0 K van elke temperatuur waarde in de temperatuur profile (Figuur 3A).
- Normaliseren van de tijd coördinaat van elke temperatuur profiel (x-normalisatie) door het verwijderen van alle data punt voordat de maximale temperatuur van het monster (T max) en wijs nieuwe tijd waarden beginnend met t = 0 voor T max (Figuur 3B).
- Screen elk profiel voor plotselinge temperatuur veranderingen, dat wil zeggen, de temperatuur verschillen die meer dan drie keer de basislijn geluidsniveau, die typisch is 3 x 0,31 K ≈ 1,0 K. verwijder deze regio's uit de dataset, omdat ze overeenstemmen met artefacten meting (Figuur 3C ).
- Bevestig een exponentiële vervalfunctie (vergelijking 9) om de gegevens via een spreadsheet processor, waarbij T t [K] is de gemonteerde blad monstertemperatuur op tijdstip t [s] t 0 is de omgevingstemperatuur, A [K] is de amplitude en t 1 [s] de vervalconstante (fig3D).
Vergelijking 9:
- Gebruik de functie aangebracht om de temperatuur daling van het blad monster 0-80 s berekenen na de laserpuls.
- Transformeer de temperatuurgegevens gemeten in [° C] om [K] schaal door toevoeging van een waarde van 273,15 tot elke temperatuur gegevenspunt (figuur 3E).
Figuur 3: Data verwerking schema voor de berekening van de λ. A. Na datareductie, de temperatuurprofielen genormaliseerd tot de omgevingstemperatuur. B. Vervolgens datapunten voor de maximale monstertemperatuur (T max) worden verwijderd. C. Meting artefacten (weergegeven in de "inconsistent" data set) worden geïdentificeerd op basis van de temperatuur verschuift groter dan three maal de basislijnruis en verwijderd uit de dataset voorafgaand aan montage op een exponentiële functie. D. De Celsius temperatuurschaal wordt omgezet in het Kelvin schaal. E. Voor elk tijdsinterval is λ berekend op basis van het temperatuurprofiel. F. Een venster van 20 s gedefinieerd waarop een relevante temperatuur verandering kan worden waargenomen. G. Op basis van de geselecteerde tijdvenster, worden de gemiddelde en de standaarddeviatie berekend voor λ. H. Representatieve resultaten voor twee verschillende N. tabacum blad monsters. Oranje pijlen en lijnen geven het effect van de desbetreffende bewerkingsstap op de gepresenteerde gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
9. Berekening van de thermische geleidbaarheid van het blad Sample
- Bereken de temperatuur difference tussen het blad monster en de omgeving voor iedere 0,1-s interval volgens vergelijking 10, waarbij AT x [k] is het temperatuurverschil t t [° C] is de gemonteerde blad monstertemperatuur en T 0 [° C] de omgevingstemperatuur (figuur 3E).
Vergelijking 10:
- Neem aan dat de daling van temperatuur gevolg van het gecombineerde effect van convectieve warmteoverdracht, warmtestraling en warmtegeleiding. Gebruik de overeenkomstige energiebalans (Vergelijking 11) als basis voor de berekening van λ, waarbij AE Temp [J] is het verschil in de thermische energie van het monster bij twee opeenvolgende tijdstippen AE rad [J] is de energie Verschil thermische straling, AE conv [J] is de energie verschil door convectieve warmte-overdracht, en Δ; E cond [J] is de energie verschil te wijten aan thermische geleiding.
Vergelijking 11:
- De plaats van de algemene voorwaarden in de energiebalans met de daadwerkelijke fysieke eigenschappen waardoor Vergelijking 12, waarbij AT T [K] is het verschil in gemonteerde blad monster temperatuur, ε de unitless emissie, σ [kg s -3 K -4] de Stefan -Boltzmann constant, A rad [m 2] op het gebied van thermische straling, h [J s -1 m -2 K -1] de convectieve warmteoverdrachtscoëfficiënt, A conv [m 2] het gebied van convectieve warmteoverdracht, A cond [m 2] het gebied van thermische geleiding en l [m] de karakteristieke lengte.
Vergelijking 12:
- Bereken de charadiverse kenmerken lengte I gebaseerd op de correlatie: l = V / A.
- Gebruik de verwarmde monstervolume Vs en de dwarsdoorsnede van het blad monster te berekenen A [m2]. De dwarsdoorsnede bladoppervlak correspondeert met een cond volgens vergelijking 13, waarbij A cond is het gebied waar geleiding optreedt, Laser r de straal van de laserspot en ds is de bladdikte.
Vergelijking 13:
- Bereken A rad en A conv volgens vergelijking 14, waarbij A laser is het gebied van de laserspot.
Vergelijking 14:
- Plaatsvervanger Vergelijkingen 9, 12 en 13 in vergelijking 11 en de laatste voor λ, waardoor Vergelijking 15 waarin t Laser is t op te lossenHij laserpuls duur [s].
Vergelijking 15:
- Ga uit van een waarde van 0,94 voor de ε en λ voor elk 0.1-s tijdsinterval te berekenen over de eerste 20 jaren van de temperatuur profiel. Middel de 200 waarden voor λ aldus verkregen en bepaal de standaardafwijking (Figuur 3F - H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meting van de Leaf Properties
Onder toepassing van bovenstaande microscopische methode, een bladdikte van 0,22-0,29 x 10-3 m werd voor beide N. tabacum (0,25 ± 0,04 x 10-3 m, n = 33) en N. benthamiana (0,26 ± 0,02 x 10 - 3 m, n = 24), hetgeen ruim binnen het 0,20-0,33 x 10-3 m bereik eerder gerapporteerde de bladeren van verschillende plantensoorten 3. Het bepalen van de dikte met een dial gauge leverde waarden van ~ 0,28 x 10-3 m (n = 10), die binnen één standaardafwijking van de resultaten van de microscopische metingen. Aldus kan de dial gauge meting voorkeur via microscopische methode voor diktebepaling in routinetoepassingen omdat het gemakkelijker toepasbaar ende resultaten van c p, s en ʎ afgeweken minder dan 10% van de meer arbeidsintensieve techniek. De dichtheid van N. tabacum en N. benthamiana bladeren was 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), die overeenkomt met de 631-918 kg m - 3 range eerder gemeld voor bladeren in andere soorten 3.
Berekening van de soortelijke warmte
Temperatuurprofielen verzameld Nicotiana soorten vertoonde een snelle toename in de tijd van de laserpuls tot de maximale temperatuur (Tmax) werd bereikt in minder dan 1 s. Na de puls, de temperatuur daalde exponentieel totdat omgevingstemperatuur (T 0) (Figuur 3A - E) bereikt. De specifieke warmtecapaciteit (c p, s -1 K -1 van N. tabacum en 2252 ± 285 J kg -1 K -1 voor N. benthamiana. Twee kweken instellingen en perioden werden voor elke species (zie paragraaf 1.2), maar dit had geen invloed op c p, s (figuur 4). De c p, s waarden daalde lineair van oud (onderste) jonge (boven) blad (R 2 = 0,85) in het geval van N. tabacum (figuur 4A), die gecorreleerd aan het watergehalte [gg -1 biomassa] die was bepaald als het verschil van natte biomassa op de oogst en de massa na 72 uur incubatie bij 60 ° C 11. Deze correlatie tussen water inhoud en de specifieke warmtecapaciteit was in overeenstemming met eerdere opmerkingen van andere auteurs 13. Een inverse correlatie werd waargenomen voor N. benthamiana (R 2 = 0,79), waarbij het verschil tussen de soortelijke warmte capaciteiten van bladeren van verschillende graden van rijpheid (onder = oud; boven = jonge) waren slechts 13% ten opzichte van 21% voor N. tabacum. Dit verschil kan ontstaan in het feit dat het watergehalte in bladeren van N. benthamiana nagenoeg constant over de verschillende mate van rijping blad 11. Een gevoeligheidsanalyse is gebleken dat de verschillen in p c, s evenredig met de schommelingen in de meetparameters in Vergelijking 8. Het effect van de gereflecteerde en uitgezonden laservermogen was sub-verhouding, omdat deze parameters niet individuele factoren in Vergelijking 7. Bijgevolg het effect van fouten in deze twee parameters was kleiner dan die veroorzaakt door fluctuaties in het laservermogen en de temperatuur. In het algemeen werd de meting betrouwbaar geacht omdat alle parameters die bij de berekening van p c, s had een coëfficiëntvariatie van minder dan 10% (figuur 4C en D).
Figuur 4: Specifieke warmtecapaciteit en thermische geleidbaarheid waarden bepaald voor N. tabacum en N. benthamiana. A. Specifieke warmtecapaciteit en thermische geleidbaarheid van N. tabacum laat volgens het blad positie op de plant (onder = oude bladeren; midden = volwassen bladeren; boven = jonge bladeren). Sterren en driehoeken geven aan planten die 49 en 56 dagen oud was, respectievelijk. B. Specifieke warmtecapaciteit en warmtegeleidingsvermogen van N. benthamiana bladeren volgens de vleugel positie op de plant. Sterren en driehoeken geven aan planten die in een fytotron of kas, respectievelijk werden gekweekt. C. Gevoeligheid van specifieke waarden warmtecapaciteit veranderingen in de invoerparameters. Triangles tonen soortelijke warmte waarden als gevolg van een stijging van 10% (rood, boven) of afname (blauw, naar beneden) in één model parameters. D. Gevoeligheid van thermische geleidbaarheid veranderingen in de invoerparameters. Driehoeken markeren schoen thermische geleidbaarheid waarden als gevolg van een stijging van 10% (rood, boven) of afname (blauw, naar beneden) in één model parameters. Error bars in A en B geven de standaarddeviatie (n≥3), terwijl in C en D zij het volledige gamma van de waarden die worden verkregen tijdens de 10% variatie gevoeligheidsanalyse vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Berekening van de thermische geleidbaarheid
De thermische geleidbaarheid (ʎ) werd berekend uit de temperatuurprofielen van exponentiëlefitting (Figuur 3) in combinatie met vergelijkingen voor geleidende en convectieve warmteoverdracht en warmtestraling. Vergelijking 15 leverden gemiddelde waarde van 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) voor N. tabacum en 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) voor N. benthamiana. Er was geen correlatie tussen ʎ en plantleeftijd of bewerking instelling, maar een correlatie tussen de bladouderdom en ʎ werd waargenomen voor N. benthamiana (figuur 4B), overeenkomen met eerder gerapporteerde leeftijdsafhankelijke verschillen in andere plantensoorten 14. Zoals hierboven besproken, was het watergehalte een onwaarschijnlijke reden voor dit verschil bleek homogeen in bladeren van verschillende rijpheid voor N. benthamiana te zijn. In plaats daarvan, speculeren we dat veranderingen in de leaf weefsel, bijvoorbeeld, de celwand samenstelling, waren verantwoordelijk voor deze waarneming door het veranderen van de warmte-overdracht eigenschappen van de bladeren en dus invloed zijn op de waarde van ʎ. De bepaling van ʎ was gevoelig voor veranderingen in de omgevingstemperatuur. Een gevoeligheidsanalyse bleek dat fluctuaties van ± 2,3 K veranderde de waarde van ʎ met 64-125%. Volgens vergelijking 15, de omgevingstemperatuur heeft invloed op de kracht van vier op de warmtestraling en dus de waarde van ʎ direct beïnvloedt.
Evaluatie van de meetapparatuur
Het was mogelijk om het opzetten van de meting assemblage binnen 3 uur. Zodra dit voltooid was, de opstarttijd van het systeem bedroeg ongeveer 15 minuten per meetreeks. Single metingen duurde minder dan 3 minuten, met inbegrip van steekproefsgewijze voorbereiding en de gehele meetcyclus. Analyse van de blootstelling laser tijd is gebleken dat eenverwarmingstijd van 0,5 s tot een temperatuurstijging van 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) was het beste compromis tussen hoge AT (bereikt door lange laserpulsen) nodig om een goede signaal-ruisverhouding (SNR) en de lage AT (bereikt door korte laserpulsen) nodig om weefselschade te voorkomen. Pulsduur langer dan 0,5 s resulteerde in het massaverlies van het monster, waarschijnlijk als gevolg van de verdamping van water en / of beschadiging van het plantenweefsel wanneer het monster bereikte temperatuur tot 70 ° C, terwijl slechts 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) werden gedurende 0,5 s laserpulsen. Voor een duur van minder dan 0,5 s, de temperatuur geluid van ± 0,31 K (standaarddeviatie, n = 25) goed voor meer dan 5% van AT en was dus een belangrijk deel van AT. Daarentegen 0.5 is het geluid slechts voor 2,5% van het signaal en is dus beschouwd als significant. Bovendien hebben de monsters niet warm meer dan ~ 45 ° C, dat iseen temperatuur die tabaksplanten kan ook in de natuurlijke tropische worden blootgesteld aan te subtropische leefgebied en die alleen schadelijk is voor plantensoorten gevonden in de toendra habitats 15. De vermogensdichtheid van de laser was 170 kW m -2, terwijl natuurlijke zonnestraling ligt typisch in het traject van 1,0-1,4 kW m -2 16,17. Vanwege de zeer korte tijd van de puls, deze hogere dosis energie waarschijnlijk niet het bladweefsel schade zoals blijkt uit een recent gepubliceerde microscopische analyse 11. De temperatuurgegevens gebruikt ʎ berekening beperkt waren tot de eerste 20 s na de laserpuls omdat alleen tijdens deze periode toonde de ruis (± 0,31 K), minder dan 5% van temperatuursignaal het monster en wordt aldus beschouwd als significant. Wanneer de temperatuur gegevens van buiten de 20 s tijdsbestek werden gebruikt, de waarden berekend voor ʎ gedaald (figuur 3F). Een mogelijke verklaring is dat sommige veronderstellingengemaakt voor de berekening van ʎ niet van toepassing voor lage waarden van AT. Vooral zou de term die warmtestraling in Vergelijking 15 zijn beïnvloed wordt beïnvloed door de vierde macht van de temperatuur. Ook kan het blad omgeving van het monster plaatsen die aan de laser licht hebben opgewarmd en dus misschien niet de ideale koellichaam aangenomen in het model het verminderen van de effectieve AT x en uiteindelijk de berekende ʎ zijn geweest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De contactloze, niet-destructieve meetmethode beschreven kan worden bepaald c p, s en ʎ in een gelijktijdige en reproduceerbare wijze. De berekening van ʎ name hangt af van verschillende parameters die gevoelig zijn voor fouten. Toch is de invloed van deze fouten is lineair of sub-proportionele en de variatiecoëfficiënt voor alle parameters bleek minder dan 10% bedragen. Hoewel de werkwijze dus zo robuust kunnen worden beschouwd, kunnen sommige technische verbeteringen worden aangebracht in de resterende foutenbronnen verminderen.
Montage van de monster in de assemblage technisch uitdagend omdat een vlakke bladoppervlak de voorkeur dat meting maar het monster op natuurlijke wijze een golvend oppervlak. Dit probleem kan worden opgelost door het ontwerpen van een specifieke monsterhouder met geometrieën precies afgestemd op het blad monster, bijvoorbeeld bladdikte en breedte, klemmen het monster in de voorkeurstaat oriëntatie. Deze aanpak zou de metingen beter reproduceerbaar te maken, maar zou het contactloos aard van de meting compromitteren omdat goed contact tussen het monster en de houder zou zijn om het bladoppervlak vlak trekken. De voordelen van een dergelijke houder zou dus afhangen van de context van de meting, dwz of de precisie of contactloos aard van de meting belangrijkste. Daarentegen kunnen dergelijke overwegingen niet nodig heeft voor bladeren met een inherent vlakke ondergrond, bijvoorbeeld rijst en verwante soorten.
Convectieve warmteoverdracht als gevolg van luchtbeweging in het milieu van de steekproef moet tijdens de metingen tot een minimum worden gehouden, omdat dit ten zeerste de berekening van beide c p, s beïnvloedt en ʎ 18. Het apparaat moet daarom afstand gelegen van luchtstromen die door air conditioning systemen, radiatoren of andere apparaten, zoals computer metintegraal ventilatoren. Dit is ook belangrijk omdat veranderingen in de relatieve watergehalte van het blad 19 die kunnen vóór of tijdens de meting door verdamping, die kan worden verhoogd luchtbewegingen 20, niet opgenomen in het model. Aldus metingen, vooral met vrijstaande bladeren dient snel te gebeuren zoals beschreven in de paragraaf protocol fouten tijdens de gegevensverwerving voorkomen. In de toekomst, kunnen de effecten van verdamping op de meting worden verminderd of vermeden als de meting in een ten minste gedeeltelijk gesloten meetkamer wordt uitgevoerd met een geïmplementeerd vochtregeling.
De nauwkeurigheid van c p, s en ʎ waarden kunnen worden verhoogd door het meten van de parameters die in de desbetreffende vergelijkingen nauwkeuriger. Bij c p, s deze parameters het laservermogen, maximum en omgevingstemperatuur en monstervolume, dat wil zeggen, het product van laser spot gebied en de dikte, en sample dichtheid (vergelijking 8). De laatste twee parameters moeten worden bepaald in experimenten bij de eigenlijke meting en hun betrouwbaarheid kan worden verbeterd als meerdere representatieve biologische replica's worden getest. Zelfs wanneer een eenvoudige dial gauge metingen werd gebruikt, het verschil in bladdikte vergeleken met een microscopische analyse was slechts 11%, waarbij de berekende waarden voor c p, s en ʎ door dezelfde mate aangetast. Daarentegen temperaturen en laservermogen tijdens de meting worden gecontroleerd. De nauwkeurigheid van p c, s kan worden verbeterd als deze online data worden gebruikt in plaats van vaste waarden voor laservermogen en omgevingstemperatuur, en de data worden verzameld onder toepassing van algemeen gekalibreerde sensoren. Deze overwegingen gelden ook voor ʎ, maar de omgevings- en monstertemperaturen zijn de belangrijkste parameters omdat zowel invloed op de berekende waarde van de vierde macht.
De huidige berekening van ʎ was gebaseerd op een aantal aannames over convectieve warmteoverdracht en thermische straling. Zo werden de emissiviteit (ε) en convectieve warmteoverdrachtscoëfficiënt (h) wordt gemeten of berekend expliciet in de gepresenteerde methode, maar werden afgeleid uit eerdere publicaties 18,21. De nauwkeurigheid van ʎ kan derhalve worden verbeterd door het bepalen van deze twee parameters onder de feitelijke meetomstandigheden. Echter, met behulp van de gegevens uit de literatuur voor berekeningen toch leverde ʎ waarden die binnen het experimenteel bepaald voor andere plantensoorten waarvoor vergelijkbare eigenschappen kunnen worden verwacht bereik te wijten waren aan hun fylogenie aan Nicotiana soorten en hun fysiologie, dat wil zeggen, kruidachtige planten 3. Zelfs indien de waarden voor ε en h werden gevarieerd over het gehele bereik eerder gerapporteerde deze waarden in planten, bijvoorbeeld 0,93-0,98 voor ε 21, het effect op de uiteindelijke waarde van ʎ was <10% en dus binnen de natuurlijke variatie hier waargenomen.
De gepresenteerde methode niet alleen in staat om de thermische eigenschappen van intacte ongeschonden bladeren en bladeren los te bepalen, maar ook correct geïdentificeerd verschillende verdere schade opzettelijk geïntroduceerd voor de meting. Daarom kunnen verschillende bladmonsters gemakkelijk worden onderscheiden, die een instrument te verwijderen, voorafgaand aan de analyse, alle slechte monsters die lage datakwaliteit zou opleveren. Deze functie kan worden gebruikt voor kwaliteitscontrole bij het monitoren van biologische materialen, bijvoorbeeld monsters niet aan de specificaties voldoet qua c p, s en ʎ kunnen verdere verwerking uitgesloten. Dit zou een actief in de context van een sterk gereguleerde processen zoals moleculaire landbouw 4.
De voordelen van deze nieuwe werkwijze in vergelijking met anderende literatuur zijn de snelle afhandeling monster, minimale voorbereiding, contactloze en niet-destructieve gelijktijdige meting van c p, s en ʎ, en het gebruik van gemeenschappelijke apparatuur die kan worden gevonden in veel optische laboratoria. Dit bredere toepassingen van de werkwijze vergeleken met die die gespecialiseerde en dure apparatuur zoals differentiële scanning calorimeters vergemakkelijken. Bovendien calorimetrie direct contact met het monster 22 vereist dus bestaat het risico van beschadiging, en de werkwijze is meestal beperkt tot het meten van soortelijke warmte 22. In contrast, terwijl warmtebeeldcamera kan necrose of fysieke veranderingen in bladeren of hele planten in een contact-vrije manier 23 te detecteren, het vereist ook complexe beeldanalyse en toegewijd gespecialiseerde apparaten 24 die in de toekomst kan worden overwonnen door goedkoper en krachtiger IR-camera's en bijbehorende randapparatuur. Spectrale analyse is een andere contact-free werkwijze voor de analyse van het watergehalte en chlorofylniveaus 25, maar het is nog niet gebruikt om specifieke warmtecapaciteit en / of thermische geleidbaarheid bepalen.
De meting aanpak van dit formulier is een robuuste methode om de thermische eigenschappen te bepalen van de bladeren van de planten met lage investeringskosten en korte meettijden. Het werd met succes gebruikt om te bepalen c p, s en ʎ in N. tabacum en N. benthamiana, twee soorten die relevant zijn in het gebied van molecular farming 4 zijn. De berekende waarden voor beide parameters op basis blad temperatuurprofielen kwamen goed overeen met die eerder gerapporteerd voor andere plantensoorten 3. De methode is niet-destructief, contactloos, en vereist geen ingewikkelde monstervoorbereiding, het verstrekken van voordelen ten opzichte van alle huidige alternatieve methoden voor de analyse van de thermische eigenschappen. Het eenvoudige ontwerp kan ook de ontwikkeling van de hand-hel te vergemakkelijkend inrichtingen voor meer flexibiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" tube | Thorlabs | SM1L10E | Tube for fiber holder |
| Agarose | Sigma Aldrich | A0701 | Agarose |
| Bi-Convex lense f=25.4 | Thorlabs | LB1761 | Lense |
| Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console | Thorlabs | PM100D | Console for thermal surface absorber sensor |
| Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | DPO7104 | Oscilloscope |
| DMR light microscope | Leica | n.a. | Light microscope |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-2 | Pycnometer |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Fiber holder | Thorlabs | Fiber holder | |
| Forma -86 °C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| Infrared Detector Optris CT | Optris | OPTCTLT15 | Infrared detector |
| Infrared Detector Software Compact Connect | Optris | n.a. | Control software for infrared detector |
| Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer | PerkinElmer | L1050 | UV/VIS Spectrophotometer |
| Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module | DILAS | M1F-SS2.1 | Laser |
| Laser cover | Amtron | LM200 | Laser Cover |
| Laser Driver | Amtron | CS 408 | Laser Driver |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Photodiode sensor | Thorlabs | PDA20H-EC | Power sensor for transmission measurements |
| Precision weight Ohaus Analytical Plus | Ohaus | 80251552 | Precision weight |
| Sample frame | Fraunhofer ILT | n.a. | Fixation of the leaf sample |
| Software Pyro Control | Amtron | n.a. | Laser Power Control Software |
| Stainless-steel-holder | n.a. | n.a. | Holder for measurement set-up |
| Teflon plates 2 cm | Fraunhofer ILT | n.a. | Teflon attenuation |
| Thermal surface absorber Power sensor | Thorlabs | S314C | Sensor for laser power measurements |
| Vibratome | Leica | 1491200S001 | Vibratome |
| Zoc/Pro 6.51 | EmTec Innovative Software | n.a. | Laser Control Software |
References
- Wilhelm, E. Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. , Royal Society of Chemistry. 516 (2010).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).
- Jayalakshmy, M. S., Philip, J. Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature. International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).
- Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Schuster, A. C., et al. Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures. AoB PLANTS. 8, (2016).
- Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity. J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).
- Hays, R. L.
- Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
- Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts. J. Vis. Exp. , Under review (2015).
- Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Tödter, N., Wehner, M. Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing. J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).
- Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
- Hedlund, H., Johansson, P. Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants. Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).
- Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation. Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).
- Larcher, W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. , Springer Science & Business Media. (2003).
- Cowen, R. A gamma-ray burst's enduring fireball. Science News. 152, 197 (1997).
- Jones, H. G., et al. Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field. Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).
- Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives. Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).
- Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves. Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).
- Jones, H. G., Schofield, P. Thermal and other remote sensing of plant stress. General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).
- Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. Radiation measurement for plant ecophysiology. J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).
- Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues. Fuel. 115, 644-651 (2014).
- Chaerle, L., et al. Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue. Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).
- Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry. J. Agron. Crop. Sci. , 415-429 (2012).
- Yuan, L., et al. Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects. Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).
