Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En hurtig Laser Sondering Metode Letter ikke-invasive og Kontakt-fri Bestemmelse af Leaf Termiske egenskaber

Published: January 7, 2017 doi: 10.3791/54835
Automatic Translation
1,2, 1, 3
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Fraunhofer Institute for Laser Technology ILT, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V.

Abstract

Planter kan producere værdifulde stoffer såsom sekundære metabolitter og rekombinante proteiner. Rensningen af ​​sidstnævnte fra plantebiomasse kan strømlines ved varmebehandling (blanchering). En blanchering apparat kan udformes mere præcist, hvis termiske egenskaber bladene er kendt i detaljer, dvs. den specifikke varmekapacitet og varmeledningsevne. Målingen af ​​disse egenskaber er tidskrævende og arbejdskrævende, og normalt kræver invasive metoder, der er i kontakt med prøven direkte. Dette kan reducere produktets udbytte og kan være uforenelig med indeslutningskrav, fx i forbindelse med god fremstillingspraksis. For at løse disse problemer blev en ikke-invasiv, kontakt-fri metode udviklet som bestemmer specifikke varmekapacitet og varmeledningsevne af et intakt plante blad i omkring et minut. Fremgangsmåden indebærer anvendelse af en kort laserimpuls med defineret længde og intensitet til et lille område afblad prøve, hvilket medfører en temperaturstigning, der er målt ved anvendelse af en nær infrarød sensor. Temperaturstigningen er kombineret med kendte leaf egenskaber (tykkelse og densitet) for at bestemme den specifikke varmekapacitet. Den termiske ledningsevne beregnes derefter på grundlag af profilen af ​​den efterfølgende temperatur tilbagegang, idet varmestråling og konvektionsvarmeoverførsel i betragtning. De tilhørende beregninger og kritiske aspekter af prøvehåndtering diskuteres.

Introduction

Den omfattende behandling af biologisk materiale kræver ofte varme-behandling skridt såsom pasteurisering. Udstyret til sådanne processer kan udformes mere præcist, hvis de termiske egenskaber af de biologiske materialer er velkarakteriserede, herunder specifikke varmekapacitet (c p, s) og varmeledningsevne (λ). Disse parametre kan bestemmes nemt for væsker, suspensioner og homogenater ved kalorimetri 1. Måler sådanne parametre i faste prøver kan dog være arbejdskrævende, og kræver ofte direkte kontakt med prøven eller endda dens ødelæggelse 2. F.eks fototermisk teknikker kræver direkte kontakt mellem prøven og detektoren 3. Sådanne begrænsninger er acceptable under forarbejdning af fødevarer, men er uforenelige med stærkt regulerede processer såsom fremstilling af biofarmaceutiske proteiner i planter i forbindelse med god fremstillingspraksis 4. jegn sådan sammenhæng kan gentages (f.eks ugentligt) overvågning af termiske egenskaber kræves i løbet af en syv-ugers vækstperiode for individuelle planter som en kvalitetskontrol værktøj. Hvis en sådan overvågning vil kræve og forbruge et blad for hver måling, ville der ikke være nogen biomasse tilbage til at behandle på høsttidspunktet.

Derudover kun bruger bladdele stedet ville forårsage sårdannelse til planten eller øge risikoen for nekrose eller patogen infektion, igen aftagende processen udbytte. Sandsynligheden for patogen infektion kan også stige, hvis ville blive anvendt en fremgangsmåde med direkte kontakt til prøven, inducere risikoen for, at en hel batch af planter kan være inficeret ved kontakt med et forurenet følerindretning. Lignende aspekter bør overvejes til overvågning af anlægget understreger ligesom tørke, fx i en økofysiologiske sammenhæng. For eksempel er vandtabet ofte overvåges af en ændring i den friske biomasse, som kræver en invasiv threevådt, af planterne undersøgte 5, fx, dissekere et blad. I stedet bestemmelse af specifikke varmekapacitet, der afhænger af indholdet af en prøve vand, på en ikke-invasiv måde som beskrevet her, kan anvendes som et surrogat parameter for hydreringsstatus planter. I begge scenarier (farmaceutisk produktion og Økofysiologi), ville kunstige spændinger fremkaldt af ødelæggende eller invasive målemetoder være skadelige, da de kan fordreje de eksperimentelle data. Derfor tidligere rapporterede flash metoder 6 eller placeringen af prøver mellem sølv plader 7 er uegnede til sådanne processer og eksperimenter, fordi de enten kræver direkte kontakt til prøven eller er destruktiv. Parametrene c p, s og λ skal bestemmes for at designe procesudstyr til en blanchering skridt, der kan forenkle produkt rensning og dermed reducere produktionsomkostningerne 8-10. Både cp, s og λ kan nu hurtigt bestemmes ved kontakt-fri ikke-destruktiv nær infrarød (NIR) laser sondering på en konsekvent og reproducerbar måde 11 og denne nye fremgangsmåde vil blive forklaret detaljeret nedenfor. De med denne fremgangsmåde resultater blev med held anvendt til at simulere varmeoverførsel i tobaksblade 12, hvilket tillader udformning af passende udstyr og udvælgelse af tilsvarende parametre som blanchering temperatur.

Metoden er nem at sætte op (figur 1) og har to faser, måling og analyse, som hver omfatter to store skridt. Ved målingen fase, er et blad prøve først lokalt opvarmet af en kort laser puls og den maksimale temperatur prøven registreres. Temperaturprofilen af ​​prøven registreres derefter i en varighed af 50 s. I analysefasen, blad egenskaber såsom densitet (let og præcist bestemt af pyknometriske measurement) kombineres med den maksimale prøvetemperatur at beregne cp, s. I det andet trin bladet temperaturprofil bruges som input til en energibalance ligning, idet ledning, konvektion og stråling i betragtning, at beregne λ.

Detaljerede trin-for-trin instruktioner findes i protokollen afsnittet, ekspanderende om indholdet af den medfølgende video. Typiske målinger er derefter vist i resultatafsnittet. Endelig er fordele og begrænsninger metoden fremhævet i afsnittet diskussion sammen med potentielle forbedringer og yderligere ansøgninger.

figur 1
Figur 1: Apparat anvendt til at bestemme blad termiske egenskaber. A. Fotografi af måleapparatet anvendes til at bestemme den specifikke varmekapacitet og varmeledningsevne leaves. De perifere enheder (computere, oscilloskop) er ikke vist. B. Skematisk fremstilling af måleapparatet. Laseren og tilsluttet udstyr er fremhævet med rødt, er NIR detektor til temperaturmåling vist i lilla, bladet prøven er grønt, og fotodiode power-sensoren er blå. C. Tegning af elementerne i målingen setup med samme farvekode som i B. Størrelsen bjælke angiver 0,1 m. D. Skærmbillede illustrerer de typiske elementer i laser kontrol software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plant Dyrkning og Prøveforberedelse

  1. Skyl hvert mineraluld blok med 1-2 l deioniseret vand og derefter med 1 liter 0,1% [m / v] gødning opløsning. Placer en tobak (Nicotiana tabacum eller N. benthamiana) frø i hver blok og forsigtigt skylles med 0,25 liter gødning løsning uden at vaske væk frøet.
  2. Dyrke planter i 7 uger i et drivhus eller phytotron med 70% relativ fugtighed, en 16-timers fotoperiode (180 pmol s - 1 m - 2; λ = 400-700 nm) og en 25/22 ° C lys / mørke temperatur regime.
  3. Flytte planterne til måleapparatet. Hvis planterne er immobile, høst enkelt blade til måling af termiske egenskaber.

2. Bestem Leaf Tykkelse og massefylde

  1. Bestem tykkelsen blad
    1. En 2% [m / v] agaroseopløsning i phosphatbufret saltvand (PBS) ogautoklaveres det. Lad opløsningen afkøle til 40 ° C og indlejre et blad prøve anbringes i en petriskål. Størkne agarose ved at placere petriskålen i et køleskab ved 4 ° C i 30 minutter.
    2. Skær agarose blokken i 200-um skiver ved hjælp af en vibratome med et barberblad skærevinkel på 15 °. Brug en skærende hastighed på 1,0 mm s -1 og en amplitude på 0,5 mm.
    3. Mount fem tværgående blad sektioner på en glasplade ved hjælp cyanoacrylat som fiksativ. Bestemme tykkelsen blad under et mikroskop med en 20 × objektiv og et okular med 10 ganges forstørrelse, ved anvendelse af de måleværktøjer indbygget i mikroskopet software i henhold til producentens anvisninger.
    4. Bestem bladet tykkelser i prøve områder uden årer.
    5. Alternativt, fastlægge blad tykkelse med en dial-profilet ved en vene-frit område af bladpladen. Sørg for, at dial-gauge holdes vinkelret på planet af bladpladen.
      cautioN: cyanocrylatklæbemidler er hudirriterende og kan også lime fingrene sammen, hvis ikke håndteres med forsigtighed.
  2. Bestem bladet tæthed
    1. Bestem den tomme masse (m 0) i et tørt pyknometer, så fyld den med vand og bestemme massen igen (m 1). Tør pyknometret helt placere et blad inde og bestemme massen (m 2) en gang mere. Med bladet inde, omhyggeligt fylde pyknometer med vand og bestemme massen (m 3).
    2. Beregn blad densitet (Ps) ved anvendelse af ligning 1.
      Ligning 1: ligning

3. Bestem Spectral Transmission og Refleksion af Blade

  1. Placer et blad i prøven kammer i et UV / VIS spektrofotometer ved fastsættelse det mellem prøve-bedrift klemmer. For transmission målinger placere bladet foran it ektor. Til refleksion målinger placere bladet på bagsiden af ​​detekteringskammeret.
  2. Start spektrofotometer kontrol software. Vælg et spektrum fra 900 nm til 1600 nm. Start en ny scanning og registrere værdierne for transmission (μ T) og refleksion (μ R) vises af UV / VIS spektrofotometer software, baseret på spektral kurve.
  3. Udfør alle målinger med mindst tre biologiske replikater. Øge antallet af biologiske gentagelser til fem eller mere, hvis der kan forventes en heterogen prøve kvalitet, dvs. variation i blade overflade morfologi og tykkelse.
  4. Beregn effekten til transmission (P T) og refleksion (P R) ved at multiplicere den målte μ T eller u-R værdier ved den målte lasereffekt P Laser ifølge ligning 2 og 3.
    Ligning 2:ftp_upload / 54.835 / 54835eq2.jpg "/>
    Ligning 3: ligning
    BEMÆRK: Transmissionen kan også bestemmes med en fotodiode sensor under målingen (se 6.3).

4. Opsæt måleapparatet

  1. Monter en fiber-koblede single-bar NIR diodelaser (bølgelængde = 1550 nm) i kegle en 25,4 mm diameter på en holder af rustfrit stål. Tilslut en controller til at indstille udgangseffekten (P Laser) i NIR laser til 4-6 W.
  2. Placer en bikonveks linse med en brændvidde på 25,4 mm ved enden af ​​keglen for at justere strålebredden til 13 mm.
  3. Placer en fotodiode power sensor 354 mm under bunden af ​​linsen. Derefter dæmpe fotodioden ved at placere et neutralt tæthed-filter med en optisk densitet på 1,0 og en 22-mm keramisk lag over sensoren.
  4. Tilslut fotodiode power sensor til et oscilloskop ved hjælp et koaksialkabel.
  5. Forbindeen 10 x 10 cm ramme, som har en 6 × 6 cm prøve eksponering med stilladset af opsætningen måling i en højde på 308 mm under linsen (figur 1). Fastgør blad position i rummet ved at montere det i 10 × 10 cm ramme.
  6. Tilslut en NIR-detektor til en personlig computer ved hjælp af en Universal Serial Bus (USB) kabel og installere interface software til detektoren.
  7. Placer detektoren i en 45 ° vinkel i forhold til laserstrålen 135 mm over det keramiske lag. Juster det område af detektoren til laserpletten på prøven måling ved at variere sensorens position og vinkel, indtil der observeres den maksimale temperatur signal.
  8. Brug af laseren kontrol interface software til at justere outputtet lasereffekt til 5 W og varigheden af ​​laseren puls til 0,5 s. Vælg kommandoen "Current kontrol" i kontrolmuligheder vinduet under den grafiske repræsentation af laser magt og justere laser magt ved at skrive "5" i & #34, Effekt [W] ". Feltet Juster laser puls varighed ved at skrive" 0,5 "i" Time [s] "feltet.
  9. At bestemme den absolutte lasereffekt for hvert sæt af eksperimenter, udskifte fotodiode power sensor med en termisk overflade absorber power sensor ved slutningen af ​​hvert sæt forsøg og måle laser udgangseffekt i 20 s uden en prøve.

5. Forbered Leaf Prøver

  1. Brug intakte og ubeskadigede blade til målingerne.
  2. Hvis det er relevant for undersøgelsen, efterligne typiske skader blad typer af piercing bladet med en skalpel, gnide bladet mellem latexhandsker, udsætter bladet for åben ild eller en laserstråle til 2-3 s, eller bruge andre teknikker til at simulere andre typer af skader.
  3. Forsigtigt men hurtigt montere blad prøve mellem sample-holder klemmer.

6. Tag temperaturmålinger

  1. Undgå direkte kontakt mellem bladet og den keramiskedæmperen placeret over fotodiode sensor for at forhindre kunstig varmeoverførsel, der forstyrrer beregningen af c p, s og λ (se afsnit 9).
  2. Bruge softwaren temperaturmåling at indsamle temperaturprofilen af ​​bladet prøven til i alt 60 s via NIR-detektor. Først registrere temperaturen baseline for 10 s, derefter aktivere laser til 0,5 s og fortsætte dataindsamling til 49,5 s.
    1. Start en måling ved at klikke på "Måling" og derefter "Ny måling". Bagefter klikke på den grønne pil over den grafiske repræsentation af den termiske profil. Gemme temperaturprofilen ved at klikke på "Save" ikonet (en stiliseret disk) over grafisk repræsentation af profilen.
  3. Bekræft transmitterede laser magt ved hjælp af fotodiode power sensor ved at beregne forskellen i signal for målinger med og uden et blad prøve at bruge et oscilloskop tilsluttettil fotodiode power sensor via et koaksialkabel (figur 2).
    1. Bestemme højden af de to flanker (f 1, S og f2, S) i spændingsprofilen erhvervet med oscilloskopet.
    2. Gentag målingen uden blad prøve som reference (f 1,0 og f 2,0). Beregn transmission μ T som forholdet mellem disse målinger i henhold til ligning 4 (se også figur 2).
      Ligning 4: ligning

Figur 2
Figur 2: Måling blad transmission ved hjælp af en fotodiode power sensor. A. Typisk spænding profil for en reference eksperiment uden et blad prøve visualiseret ved anvendelse af et oscilloskop. B. Spænding profilmed et blad prøve monteret i apparatet. I begge tilfælde er den transmitterede lasereffekt er proportional med hver af de to flanker. Klik her for at se en større version af dette tal.

7. Beregn specifikke varmekapacitet af Leaf Sample

  1. Beregne den maksimale temperaturforskellen [K] under laserimpulsen ved at subtrahere rumtemperaturen T 0 [K] fra den maksimale blad temperaturen T ma x [K] (ligning 5).
    Ligning 5: ligning
  2. Beregn den energi, der absorberes af et blad (E S [J]) baseret på den effektive lasereffekt og laser impulsvarighed (ligning 6), hvor P R [W] er den reflekterede lasereffekt og P T [W] er den transmitterede laser magt.
    Equation 6: ligning
  3. Beregn massen af det opvarmede bladareal (m S [kg]) under anvendelse af ligning 7, hvor d S [m] er tykkelsen blad ifølge 2.1), r Laser [m] er radius af laserpunktet, V S [ m 3] er det opvarmede blad volumen, og ρ S [kg m-3] er bladet tæthed ifølge 2.2).
    Ligning 7: ligning
  4. Beregn cp, s [J kg -1 K -1] i henhold til ligning 8 ved at dividere den absorberede energi E S med produktet af det opvarmede bladareal masse m S og maksimal temperaturforskel AT.
    Ligning 8: ligning

8. Forbered Temperatur Profil Data for Thermal Ledningsevne Beregninger

  1. Brug "Export" kommando af NIR-sensor kontrol software til at eksportere den tid og temperatur rådata som en * .dat fil og åbne filen i et regneark processor.
  2. Påfør 1: 100 datareduktion, fx under anvendelse af en "IF (MOD (værdi 100) = 0;" x "," 0 ")" kommando, hvilket resulterer i en datatæthed på et datapunkt pr 0,1 s.
  3. Beregn den gennemsnitlige basislinie temperaturen T B [° C] for hver temperaturprofil over den indledende 10 s en måling, hvor laseren var stadig slukket. Derefter beregnes differensen mellem T B og den faktiske omgivelsestemperatur T 0 [° C].
  4. Brug denne forskel individuelt normalisere hver profil ved at forskyde den mod T 0 (y-normalisering), fx hvis T B - T 0 = 2,0 K, derefter trække 2,0 K fra hver temperatur værdi i temperaturen profile (figur 3A).
  5. Normalisere tidskoordinatet af hver temperaturprofil (x-normalisering) ved at slette hver datapunkt før den maksimale prøvetemperatur (T max) og tildele nye tidsværdier starter med t = 0 for T max (figur 3B).
  6. Screen hver profil for pludselige temperaturskift, dvs temperaturforskelle, der er mere end tre gange den baseline støjniveau, som typisk er 3 × 0,31 K ≈ 1,0 K. Fjern disse regioner fra datasættet, fordi de svarer til målingen artefakter (figur 3C ).
  7. Monter en eksponentiel henfald funktion (ligning 9) til dataene ved brug af et regneark processor, hvor T t [K] er monteret blad prøvetemperatur på tidspunktet t [s], T 0 er den omgivende temperatur, A [K] er amplituden og t 1 [s] henfaldskonstanten (figur3D).
    Ligning 9: ligning
  8. Brug monteret funktion til at beregne temperaturen faldet i bladet prøven fra 0-80 s efter laserimpulsen.
  9. Omdan temperaturdata måles i [° C] til [K] skala ved at tilføje en værdi på 273,15 for hver temperatur datapunkt (figur 3E).

Figur 3
Figur 3: Databehandling ordning for beregning af λ. A. Efter datareduktion, temperaturprofilerne normaliseres til den omgivende temperatur. B. Dernæst er alle datapunkter før den maksimale prøve temperatur (T max) fjernet. C. Måling artefakter (vist i "inkonsekvent" datasæt) identificeres på temperatur skifter større end three gange baseline støj og fjernet fra datasættet før montering på en eksponentiel funktion. D. Temperaturskalaen Celsius omdannes til Kelvin skalaen. E. For hvert tidsinterval, er λ beregnes på basis af temperaturprofil. F. Et vindue på 20 s er defineret ved hvilken en relevant temperaturændring kan observeres. G. Baseret på den valgte tidsvindue, er den gennemsnitlige og standardafvigelse beregnet for λ. H. Repræsentative resultater for to forskellige N. tabacum blad prøver. Orange pile og linjer angiver effekten af ​​den tilsvarende behandling skridt på de præsenterede data. Klik her for at se en større version af dette tal.

9. Beregning af varmeledningsevne Leaf Sample

  1. Beregn temperaturen Forskelnce mellem bladet prøven og miljøet for hver 0,1-s interval ifølge ligning 10, hvor AT x [K] er temperaturforskellen, T t [° C] er monteret blad prøven temperatur og T 0 [° C] den omgivelsestemperatur (Figur 3E).
    Ligning 10: ligning
  2. Antag, at faldet i temperaturen skyldes den kombinerede virkning af konvektiv varmeoverførsel, varmestråling og varmeledning. Brug den tilsvarende energibalancen (ligning 11) som grundlag for beregning af λ, hvor AE Temp [J] er forskellen i den termiske energi af prøven på to på hinanden følgende tidspunkter, AE rad [J] er den energi forskel skyldes for termisk stråling, AE conv [J] er den energi forskellen skyldes konvektiv varmeoverførsel, og ΔE cond [J] er den energi forskellen skyldes termisk ledning.
    Ligning 11: ligning
  3. Stedfortræder de generelle betingelser i energibalancen med de faktiske fysiske egenskaber der giver ligning 12, hvor AT t [K] er forskellen i den monterede blad prøve temperatur, ε det uden enhed emissivitet, σ [kg s -3 K -4] Stefan -Boltzmann konstant, En rad [m 2] området varmestråling, h [J s -1 m -2 K -1] den varmeoverføringskoefficienten, En conv [m 2] området for konvektive varmeoverførsel, A cond [m2] området for termisk ledning og l [m] den karakteristiske længde.
    Ligning 12:
    ligning
  4. Beregn Characteristic længde l baseret på korrelationen: l = V / A.
  5. Brug opvarmede prøvevolumen V S og tværsnitsarealet af bladet prøve at beregne A [m2]. Tværsnitsarealet bladareal svarer til en cond ifølge ligning 13, hvor A cond er det område, hvor ledning forekommer, r Laser er radius af laserpunktet og d s er tykkelsen blad.
    Ligning 13: ligning
  6. Beregne en rad og A conv ifølge ligning 14, hvor A Laser er arealet af laserpunktet.
    Ligning 14: ligning
  7. Stedfortræder ligninger 9, 12 og 13 i ligning 11 og løse sidstnævnte λ, hvilket giver ligning 15 hvor t Laser er than laser puls varighed [s].
    Ligning 15:
    ligning
  8. Antage en værdi på 0,94 for ε og beregne λ for hver 0,1-s tidsinterval i løbet af de første 20 sekunder af temperaturprofilen. Gennemsnittet af 200 værdier for λ opnået på denne måde og beregne standardafvigelsen (figur 3F - H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling af Leaf Properties

Anvendelse af den ovennævnte mikroskopiske fremgangsmåde, et blad tykkelse på 0,22-0,29 × 10 - 3 m blev bestemt for både N. tabacum (0,25 ± 0,04 x 10 - 3 m, n = 33) og N. benthamiana (0,26 ± 0,02 x 10 - 3 m, n = 24), som ligger inden for 0,20-0,33 × 10 - 3 m rækkevidde tidligere rapporteret for bladene af forskellige plantearter 3. Bestemmelse af tykkelsen med en dial gauge gav værdier på ~ 0,28 × 10 - 3 m (n = 10), som var inden for én standardafvigelse af resultaterne fra mikroskopiske målinger. Således kan dial-gauge måling blive foretrukket frem for den mikroskopiske metode til tykkelse bestemmelse i rutinemæssige applikationer som det var lettere at anvende ogresultaterne for Cp, s og ʎ træder mindre end 10% fra den mere arbejdskrævende teknik. Densiteten af N. tabacum og N. benthamiana blade var 750 ± 10 kg m - 3 (n = 20), som modsvarer de 631-918 kg m - 3 område, der tidligere er rapporteret for blade i andre arter 3.

Beregning af specifikke varmekapacitet

Temperaturprofiler indsamlet til Nicotiana arter viste en hurtig stigning over tid af laserimpulsen indtil den maksimale temperatur (T max) blev nået inden for mindre end 1 sek. Efter impulsen, faldt temperaturen eksponentielt, indtil den nåede omgivende temperatur (T 0) (Figur 3A - E). Den specifikke varmekapacitet (c P, S -1 K -1 for N. tabacum og 2252 ± 285 J kg -1 K -1 for N. benthamiana. To dyrkning indstillinger og varigheder blev anvendt til hver arter (se afsnit 1.2), men dette påvirkede ikke cp, s (figur 4). Imidlertid c p, s værdier faldt lineært fra den gamle (nederst) til unge (øverst) blade (R 2 = 0,85) i tilfælde af N. tabacum (figur 4A), som korreleret til vandindholdet [gg -1 biomasse], der var blevet bestemt som forskellen af våd biomasse på tidspunktet for høst og massen efter 72 timers inkubation ved 60 ° C 11. Denne sammenhæng mellem vandindhold og specifikke varmekapacitet var i overensstemmelse med tidligere observationer af andre forfattere 13. En omvendt korrelation blev observeret for N. benthamiana (R2 = 0,79), hvor forskellen mellem de specifikke varme kapacitet blade af forskellige grader af modenhed (nederst = gamle, top = ung) var kun 13% i forhold til 21% for N. tabacum. Denne forskel kan have oprindelse i det forhold, at vandindholdet i blade af N. benthamiana er næsten konstant i de forskellige grader af blad modning 11. En følsomhedsanalyse viste, at forskelle i c p, s var proportional med udsving i måleparametre i ligning 8. Virkningerne af den reflekterede og transmitterede laser magt var sub-proportional, fordi disse parametre ikke var individuelle faktorer i ligning 7. Følgelig effekten af ​​fejl i disse to parametre var mindre end dem, der forårsages af svingninger i lasereffekten eller omgivelsestemperatur. Generelt blev målingen anses for at være robust, fordi alle parametre involveret i beregningen af Cp, s havde en koefficientvariation på under 10% (figur 4C og D).

Figur 4
Figur 4: specifikke varmekapacitet og varmeledningsevne værdier bestemmes for N. tabacum og N. benthamiana. A. Specifikke varmekapacitet og varmeledningsevne af N. tabacum leaves ifølge bladet position på planten (nederst = gamle blade; middle = modne blade; top = unge blade). Stjerner og trekanter angiver planter, der var 49 og 56 dage gammel, hhv. B. Specifikke varmekapacitet og varmeledningsevne af N. benthamiana blade ifølge bladet position på planten. Stjerner og trekanter angiver planter, der blev dyrket i en phytotron eller drivhus, hhv. C. Følsomhed af specifikke værdier varme kapacitet til ændringer i inputparametre. triangles viser specifikke varmekapacitet værdier fra en stigning på 10% (rød, opad) eller fald (blå, nedad) i enkelte modelparametre. D. Følsomhed af varmeledningsevne værdier til ændringer i inputparametre. Trekanter markerer sko varmeledningsevne værdier fra en stigning på 10% (rød, opad) eller fald (blå, nedad) i enkelte modelparametre. Fejl barer i A og B angiver standardafvigelsen (n≥3), mens der i C og D de repræsenterer det komplette sortiment af værdier opnået i løbet af 10% variation følsomhedsanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Beregning af varmeledningsevne

Den termiske ledningsevne (ʎ) blev beregnet ud fra temperaturprofilerne efter eksponentielfitting (figur 3) kombineret med ligninger for ledende og konvektiv varmeoverførsel såvel som termisk stråling. Ligning 15 gav gennemsnitlige værdier på 0,49 ± 0,13 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 19) for N. tabacum og 0,41 ± 0,20 J m - 1 s - 1 K - 1 (n = 25) til N. benthamiana. Der var ingen sammenhæng mellem ʎ og plante alder eller dyrkning indstilling, selv om der blev observeret en sammenhæng mellem blad alder og ʎ for N. benthamiana (figur 4B), enig med tidligere rapporterede aldersrelaterede afhængige forskelle i andre plantearter 14. Som beskrevet ovenfor vandindholdet var en usandsynlig årsag til denne forskel, da det viste sig at være homogent tværs blade af varierende modenhed til N. benthamiana. I stedet skal vi spekulere, at ændringer i leaf væv, f.eks cellevæggen sammensætning, var ansvarlige for denne observation ved ændring af varmeoverføringsegenskaberne af bladene og således påvirke værdien af ʎ. Bestemmelsen af ​​ʎ var følsom over for ændringer i den omgivende temperatur. En følsomhedsanalyse viste, at udsving på ± 2,3 K ændret værdien af ​​ʎ med 64-125%. Ifølge ligning 15, den omgivende temperatur har en effekt ved magt fire på varmestråling og dermed direkte påvirker værdien af ​​ʎ.

Evaluering af måleapparatet

Det var muligt at oprette forsamlingen måling inden 3 timer. Når dette var fuldstændig, opstart for systemet var ca. 15 min per måleserier. Enkelte målinger tog mindre end 3 min, herunder prøveforberedelse og hele måling cyklus. Analyse af laseren eksponeringstid afslørede, at enopvarmningstid på 0,5 s resulterede i en temperaturstigning på 19,9 ± 4,3 ° C (n = 55) var det bedste kompromis mellem den høje AT (opnået ved lange laserpulser), der kræves for et godt signal-til-støj-forhold (SNR) og den lave aT (opnået ved korte laserpulser), der kræves for at undgå vævsbeskadigelse. Pulsvarigheder længere end 0,5 s resulterede i tabet af masse fra prøven, hvilket sandsynligvis skyldes vandfordampning og / eller beskadigelse af bladvæv som prøve temperaturen nåede op til 70 ° C, mens kun 42,9 ± 4,2 ° C (n = 55) blev observeret for 0,5 s laserimpulser. For varigheder på mindre end 0,5 s, temperaturen støj på ± 0,31 K (standardafvigelse, n = 25) tegnede sig for mere end 5% af AT og var således en væsentlig del af AT. I modsætning hertil 0.5 s støjen udgjorde kun 2,5% af signalet og blev således betragtet som ubetydelig. Derudover har prøverne ikke varme op til mere end ~ 45 ° C, hvilket eren temperatur, der tobaksplanter kan også blive udsat for i den naturlige tropiske til sub-tropisk habitat og som kun til skade for plantearter findes i tundra levesteder 15. Effekttæthed af laseren var 170 kW m-2, hvorimod naturlig solstråling er typisk i området fra 1,0-1,4 kW m-2 16,17. Men på grund af den meget korte tid af impulsen, dette højere dosis energi sandsynligvis ikke beskadige bladvæv som angivet ved en nyligt offentliggjort mikroskopisk analyse 11. Temperaturen data, der anvendes til at beregne ʎ var begrænset til de første 20 s efter laser puls, fordi kun i denne periode gjorde støjen (± 0,31 K) udgør mindre end 5% af prøvens temperatur signal og blev således betragtet som ubetydelig. Hvornår blev brugt temperaturdata fra uden for 20 s tidsramme, de beregnede værdier for ʎ faldet (figur 3F). En mulig forklaring var, at nogle af de antagelserlavet til beregning af ʎ ikke fandt anvendelse for lave værdier af AT. Især kan udtrykket beskriver varmestråling i ligning 15 er blevet påvirket, da den påvirkes af den fjerde strøm af temperaturen. Også, kan bladet området omkring prøven stedet udsat for laseren har opvarmet lidt op og dermed måske ikke har været den ideelle køleplade antaget i modellen reducere den effektive AT x og i sidste ende den beregnede ʎ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontakten-fri, ikke-destruktiv målemetode beskrevet ovenfor, kan anvendes til at bestemme cp, s og ʎ i en samtidig og reproducerbar måde. Beregningen af ​​ʎ navnlig afhænger af flere parametre, som er følsomme over for fejl. Ikke desto mindre er effekten af ​​disse fejl var, enten lineær eller sub-proportionale, og variationskoefficienten for alle parametre fandtes at være mindre end 10%. Selvom fremgangsmåden således kan betragtes som robust, kan foretages visse tekniske forbedringer at reducere de tilbageværende fejlkilder.

Montering af prøven i forsamlingen var teknisk udfordrende, fordi et fladt blad overflade er at foretrække til måling, men prøven har naturligvis en bølgende overflade. Dette problem kan løses ved at designe en dedikeret prøve holder med geometrier præcist tilpasset til bladet prøven, fx blad tykkelse og bredde, fastspænding prøven i foretrækkerstand orientering. Denne fremgangsmåde vil gøre målingerne mere reproducerbar, men ville kompromittere kontaktfri karakter af målingen, fordi fast kontakt mellem prøven og indehaveren vil være forpligtet til at trække bladet overflade flad. Fordelene ved at bruge denne form for indehaveren vil derfor afhænge af omstændighederne af målingen, dvs. om præcision eller kontaktfri karakter af målingen er vigtigst. I modsætning hertil kan sådanne overvejelser ikke nødvendigt overhovedet for blade med en iboende flad overflade, fx ris og beslægtede arter.

Konvektiv varmeoverførsel grundet luft bevægelse i miljøet af prøven bør holdes på et minimum under målingerne, fordi det stærkt påvirker beregningen af både c p, s og ʎ 18. Apparatet bør derfor placeret væk fra luftstrømme genereret af klimaanlæg, radiatorer eller andet udstyr, såsom computer medintegrerede ventilatorer. Det er også vigtigt, fordi ændringer i det relative indhold af bladene 19, der kan opstå før eller under målingen på grund af fordampning, som kan øges ved luftbevægelser 20 vand, blev ikke tegnede sig for i modellen. Således målinger, især med aftagne blade, bør gennemføres hurtigt som beskrevet i protokollen afsnit for at undgå fejl under dataopsamling. I fremtiden kan virkningen af ​​fordampning på målingen reduceres eller undgås, hvis målingen udføres i en i det mindste delvist lukket målekammer med en implementeret fugtstyring.

Nøjagtigheden af Cp, s og ʎ værdier kan øges ved måling af parametre, der anvendes i de tilsvarende ligninger mere præcist. I tilfælde af c P, S disse parametre er lasereffekten, maksimum og omgivelsestemperatur og prøvevolumen, dvs. produktet af lasER pletareal og tykkelse, og prøvens densitet (ligning 8). De to sidstnævnte parametre skal bestemmes i forsøg, der ledsager den faktiske måling og deres pålidelighed kan forbedres, hvis flere repræsentative biologiske gentagelser testes. Men selv når en simpel dial gauge måling blev anvendt, forskellen i tykkelse blad sammenlignet med en mikroskopisk analyse var kun 11%, hvilket påvirkede de beregnede værdier for c p, s og ʎ af samme grad. I modsætning hertil kan overvåges temperaturer og lasereffekt hele målingen. Nøjagtigheden af c p, kan s forbedres, hvis disse online data anvendes i stedet for faste værdier til laser magt og omgivende temperatur, og data indsamles ved hjælp af godt kalibrerede sensorer. Disse betragtninger gælder også for ʎ, men den omgivende og prøve temperaturer er de vigtigste parametre, fordi både påvirker den beregnede værdi ved magt fire.

Den nuværende beregning af ʎ var baseret på en række antagelser om konvektiv varmeoverførsel og varmestråling. For eksempel blev det emissivitet (ε) og Varmeoverføringsevnen (h) ikke måles eller beregnes eksplicit i den ovenfor beskrevne metode, men stammede fra tidligere udgivelser 18,21. Nøjagtigheden af ​​ʎ kunne derfor forbedres ved at bestemme disse to parametre under de aktuelle målebetingelser. Men ved hjælp af litteraturen data for beregninger alligevel gav ʎ værdier, der var inden for det område eksperimentelt bestemt til andre plantearter, for hvilke der kan forventes lignende egenskaber på grund af deres fylogeni til Nicotiana arter og deres fysiologi, dvs. urteagtige planter 3. Selv om værdierne for ε og h blev varieret over hele området, der tidligere er rapporteret for disse værdier i planter, fx 0,93-0,98 for ε 21, deres effekt på den endelige værdi af ʎ var <10% og dermed inden for den naturlige variation observeret her.

Metoden præsenteres Ovenstående var ikke kun i stand til at bestemme de termiske egenskaber af intakte uskadt blade og fritliggende blade, men det er også korrekt identificeret forskellige typer af mere alvorlige skader indført med vilje før måling. Derfor kan forskellige typer af blade prøver let skelnes, hvilket giver et værktøj til at fjerne, før analyse, eventuelle dårlige prøver, der ville give data lav kvalitet. Denne funktion kan bruges til kvalitetskontrol, når de overvåger biologiske materialer, fx prøver ikke opfylder specifikationer i form af c p, s og ʎ kan udelukkes fra yderligere behandling. Dette ville være et aktiv i forbindelse med en stærkt regulerede processer såsom molekylært landbrug 4.

Fordelene ved denne nye metode sammenlignet med andre ilitteraturen omfatte hurtig prøvehåndtering, minimal forberedelse, kontakt-fri og ikke-destruktiv samtidig måling af Cp, s og ʎ, og brugen af fælles udstyr, der kan findes i mange optiske laboratorier. Dette vil lette bredere anvendelser af fremgangsmåden sammenlignet med dem, der kræver specialiserede og kostbare indretninger, såsom differential scanning varmemålere. Endvidere kalorimetri kræver direkte kontakt med prøve 22, så der er en risiko for skader, og fremgangsmåden er normalt begrænset til måling af specifik varmekapacitet 22. I modsætning, mens termografi kan registrere nekrose eller fysiske ændringer i blade eller hele planter i en kontakt-fri måde 23, det kræver også komplekse billedanalyse og dedikeret specialiserede enheder 24, som kan overvindes i fremtiden ved billigere og mere kraftfulde IR kameraer og ledsagende perifere enheder. Spektral analyse er en anden kontakt-free metode til analyse af vandindhold og klorofylniveauet 25, men det er endnu ikke blevet anvendt til at bestemme specifik varmekapacitet og / eller varmeledningsevne.

Målemetoden rapporteret heri er en robust metode til bestemmelse af termiske egenskaber af planteblade med lave investeringsomkostninger og korte måletider. Det blev med held anvendt til at bestemme cp, s og ʎ i N. tabacum og N. benthamiana, to arter, der er relevante inden for molekylært landbrug 4. De beregnede værdier for begge parametre baseret på blad temperaturprofiler var i god overensstemmelse med dem, der tidligere er rapporteret for andre plantearter 3. Fremgangsmåden er ikke-destruktiv, kontakt-fri, og som ikke kræver kompliceret prøveforberedelse, der giver fordele i forhold til alle aktuelle alternative metoder til analyse af termiske egenskaber. Det enkle design kan også fremme udviklingen af ​​hånd-held enheder for at øge fleksibiliteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" tube Thorlabs SM1L10E Tube for fiber holder
Agarose Sigma Aldrich A0701 Agarose
Bi-Convex lense f=25.4 Thorlabs LB1761 Lense
Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console Thorlabs PM100D Console for thermal surface absorber sensor
Digital Phosphor Oscilloscope  Tektronix DPO7104 Oscilloscope
DMR light microscope Leica n.a. Light microscope
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-2 Pycnometer
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Fiber holder Thorlabs Fiber holder
Forma -86 °C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm Grodan 102446 Rockwool block
Infrared Detector Optris CT Optris OPTCTLT15 Infrared detector
Infrared Detector Software Compact Connect Optris n.a. Control software for infrared detector
Lambda 1050 UV/Vis spectrophotometer PerkinElmer L1050 UV/VIS Spectrophotometer
Laser 400 μm, 1,550 nm Conduction Cooled Single Bar Fiber Coupled Module DILAS M1F-SS2.1 Laser
Laser cover Amtron LM200 Laser Cover
Laser Driver  Amtron CS 408 Laser Driver
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Photodiode sensor  Thorlabs PDA20H-EC Power sensor for transmission measurements
Precision weight Ohaus Analytical Plus Ohaus 80251552 Precision weight
Sample frame Fraunhofer ILT n.a. Fixation of the leaf sample
Software Pyro Control Amtron n.a. Laser Power Control Software
Stainless-steel-holder n.a. n.a. Holder for measurement set-up
Teflon plates 2 cm Fraunhofer ILT n.a. Teflon attenuation
Thermal surface absorber Power sensor Thorlabs S314C Sensor for laser power measurements
Vibratome Leica 1491200S001 Vibratome
Zoc/Pro 6.51  EmTec Innovative Software n.a. Laser Control Software 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilhelm, E. Heat Capacities: Liquids, Solutions and Vapours. , Royal Society of Chemistry. 516 (2010).
  2. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. J. Exp. Bot. 64, 3937-3949 (2013).
  3. Jayalakshmy, M. S., Philip, J. Thermophysical Properties of Plant Leaves and Their Influence on the Environment Temperature. International Journal of Thermophysics. 31, 2295-2304 (2010).
  4. Buyel, J. F. Process development strategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  5. Schuster, A. C., et al. Effectiveness of cuticular transpiration barriers in a desert plant at controlling water loss at high temperatures. AoB PLANTS. 8, (2016).
  6. Parker, W. J., Jenkins, R. J., Abbott, G. L., Butler, C. P. Flash Method of Determining Thermal Diffusivity, Heat Capacity, and Thermal Conductivity. J Appl Phys. 32, 1679-1684 (1961).
  7. Hays, R. L. The thermal conductivity of leaves. Planta. 125, 281-287 (1975).
  8. Menzel, S., et al. Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates. Front. Plant Sci. , (2015).
  9. Buyel, J. F., Hubbuch, J., Fischer, R. Blanching intact leaves or heat precipitation in an agitated vessel or heat exchanger removes host cell proteins from tobacco extracts. J. Vis. Exp. , Under review (2015).
  10. Beiss, V., et al. Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).
  11. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Tödter, N., Wehner, M. Determination of the thermal properties of leaves by non-invasive contact free laser probing. J. Biotechnol. 217, 100-108 (2016).
  12. Buyel, J. F. Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact. Biochem. Eng. J. , (2015).
  13. Hedlund, H., Johansson, P. Heat capacity of birch determined by calorimetry: implications for the state of water in plants. Thermochim Acta. 349, 79-88 (2000).
  14. Chandrakanthi, M., Mehrotra, A. K., Hettiaratchi, J. P. A. Thermal conductivity of leaf compost used in biofilters: An experimental and theoretical investigation. Environ. Pollut. 136, 167-174 (2005).
  15. Larcher, W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups. , Springer Science & Business Media. (2003).
  16. Cowen, R. A gamma-ray burst's enduring fireball. Science News. 152, 197 (1997).
  17. Jones, H. G., et al. Thermal infrared imaging of crop canopies for the remote diagnosis and quantification of plant responses to water stress in the field. Funct. Plant Biol. 36, 978-989 (2009).
  18. Defraeye, T., Verboven, P., Ho, Q. T., Nicolai, B. Convective heat and mass exchange predictions at leaf surfaces: Applications, methods and perspectives. Comput. Electron. Agric. 96, 180-201 (2013).
  19. Arndt, S. K., Irawan, A., Sanders, G. J. Apoplastic water fraction and rehydration techniques introduce significant errors in measurements of relative water content and osmotic potential in plant leaves. Physiol. Plant. 155, 355-368 (2015).
  20. Jones, H. G., Schofield, P. Thermal and other remote sensing of plant stress. General and Applied Plant Physiology. 34, 19-32 (2008).
  21. Jones, H. G., Archer, N., Rotenberg, E., Casa, R. Radiation measurement for plant ecophysiology. J. Exp. Bot. 54, 879-889 (2003).
  22. Dupont, C., Chiriac, R., Gauthier, G., Toche, F. Heat capacity measurements of various biomass types and pyrolysis residues. Fuel. 115, 644-651 (2014).
  23. Chaerle, L., et al. Multi-sensor plant imaging: Towards the development of a stress-catalogue. Biotechnol. J. 4, 1152-1167 (2009).
  24. Hackl, H., Baresel, J. P., Mistele, B., Hu, Y., Schmidhalter, U. A Comparison of Plant Temperatures as Measured by Thermal Imaging and Infrared Thermometry. J. Agron. Crop. Sci. , 415-429 (2012).
  25. Yuan, L., et al. Spectral analysis of winter wheat leaves for detection and differentiation of diseases and insects. Field Crops Res. 156, 199-207 (2014).

Tags

Biokemi Heat kapacitet i nærheden af ​​infrarød laser Plant-afledte biofarmaceutiske overvågning Plantevækst Procesoptimering Varmeledningsevne
En hurtig Laser Sondering Metode Letter ikke-invasive og Kontakt-fri Bestemmelse af Leaf Termiske egenskaber
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buyel, J. F., Gruchow, H. M.,… More

Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Wehner, M. A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties. J. Vis. Exp. (119), e54835, doi:10.3791/54835 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter