Introduction
ミクロ生物レベルでの遺伝子やタンパク質の転送は、細菌の生存と発展だけでなく、感染の過程において中心的な役割を果たしています。細菌の間、または細菌と細胞間のDNAの交換は、形質転換、接合またはベクターの形質導入によって達成することができます。 1,2結合は、複雑な高分子システムがドナーとレシピエント細胞を接続することによりDNAの転移がドナー・制御された様式で発生し、 大腸菌などのグラム陰性菌間の共役中にその中の形質転換および形質導入と比較してユニークです。結合はまた、細菌細胞は、ホストシステムの中での遺伝子、タンパク質または化学物質を注入するために、宿主細胞と相互作用する最も直接的な方法です。 図3は、かなり頻繁に、このような薬剤の転送は、進化と適応をホストするために発病し、発癌に至るまで、ホスト上の顕著な効果を持っています。その接合recombinatioが示されていますnは環境ストレスの条件下で高い突然変異率を持つ細菌に適応3倍の速度を増加させます。 4さらに、結合は、はるかに菌株における抗生物質耐性遺伝子が拡散され、それを通して、最も一般的な経路です。 5,6
微生物は細胞膜を横切る巨大分子の転送をサポートするために特殊な分泌系を進化させてきました。 T1SS、T2SS、T3SS、T4SS、T5SS、T6SS、T7SS、ならびに秒（分泌）およびTat（2-アルギニン転座）：記載されているグラム陰性菌における分泌系（のTSS）の9種類が現在あります経路。分泌系の7,8各タイプは、さらに、異なるサブタイプに起因するタンパク質の多様性と異なる細菌株で、関与する経路の特殊性への必要性を分割されています。例えば、IV型分泌系（T4SS）で、TiおよびCAGシステムはF-プラスミド、R27 Aに対し、エフェクター輸送を促進しますND pKM101 T4SSsは、接合性プラスミドの伝達を促進します。生物はその構成タンパク質からそれぞれの分泌系を組み立てると、受信者またはその周囲の環境と細胞内容を共有するメカニズムの7,9,10詳細な理解は、病原性微生物やプロセスに対抗するための目標と戦略の開発における重要な因子であります携帯感染。
レーダーバーグ＆テイタムによって大腸菌での最初の同定細菌接合に続いて、モバイルおよび接合性プラスミドの11多数同定され、特徴付けられています。 12このようなモバイルプラスミドは、かなりの範囲は（1から200以上のキロベース（キロバイト）まで）のサイズであることを示す、しかしすべてのモバイルプラスミドは、それによって、プラスミドの伝達を可能にする転送（oriTを）の原点を認識しrelaxaseを、含まれています。機能T4SSの組み立てだけでなく、タイプの接合プラスミドさらにエンコード遺伝子IV結合タンパク質。 12例えば、 大腸菌の100キロバイトFプラスミドは33.3 kBの転送（TRA）領域内のすべての接合の遺伝子をコードしています。 13ペア形成（MPF）、DNA転移と除外機能を交配線毛形成を促進する全てのタンパク質、接合性プラスミドの転送中にFプラスミドエンコードのTRA領域における遺伝子。 10,14,15は、知識の重要な身体は、接合T4SSsのために利用可能である、しかし、唯一のより最近利用可能になってきている共役タンパク質との複合体の構造研究を詳述しました。 16から28
接合プロセスの包括的なビューを組み立てるためには、接合伝達タンパク質の変異分析に詳細な構造研究のカップリングが必要です。これは、接合交配アッセイを介して達成することができます。 Fプラスミドは、TRA領域内にコードされる各タンパク質は、F媒介コにおいて役割を果たすnjugation;従って、転写遺伝子のノックアウト/欠失は、細胞の接合容量（ 図1）を廃止します。小さい携帯プラスミドは、標準的な削除の手続きをより助長しているが、このようなFのようなより大きな接合プラスミドのために、遺伝子ノックアウトは、より容易に標的遺伝子は明確な抗生物質耐性遺伝子を伝えるものに交換され、相同組換えを介して達成されます。現在のプロトコルでは、我々は55キロバイトFプラスミドの誘導体pOX38-TCでクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）と利益の伝達遺伝子を置き換えるために、相同組換えを利用します。 29,30、得られたノックアウトプラスミド、pOX38-TCΔgene:: Cmが、増殖培地中のクロラムフェニコール（CM）の存在に対する抵抗性を促進します。 pOX38-TCΔgene:: Cmとを保有するドナー細胞は交配アッセイの使用を介して観察されるように接合DNA転送/交配に影響を与えることができません。 pOX38-TCΔgene:: Cmをドナー細胞と正常RECIPの接合効率ientは廃止され、より多くの場合、減少またはます。 pOX38-TCΔgene:: Cmをプラスミドの接合伝達を標的に転送遺伝子を保有する小型の回復プラスミドを経由して復元することができます。この回復プラスミドは、プラスミドpK184（pK184遺伝子）、31または限り、そのプラスミドが適切細胞（細胞質またはペリプラズム）内の正しい場所に遺伝子を標的として誘導性の発現を提供するものとして、構成的発現を提供するものであることができます。したがって、この新しいドナー間の交配アッセイ（pOX38-TCΔgene:: Cmを+ pK184遺伝子のプラスミドを有します） そして、レシピエント細胞は、接合効率はほぼその正常ドナー・レシピエントの交配アッセイのに復元することが期待されます。このシステムは、CM曲庇:: pK184-遺伝子構築物（欠失または点変異）の一連の生成を介してとpOX38-TCΔgeneの交配能力を回復するために各構築物の能力を試験するノックアウト遺伝子の機能を調べるために1を可能にしますドナー細胞秒。
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Protocol
DNA構築物の1世代
- 標的遺伝子の相同組換えのためのオリゴマーの設計
- 次のように単一の55から72塩基対の前方オリゴマーを設計します。（a）は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の5 '開始部位の上流領域10-100 bpの中のDNA配列に相同である19-32 bpの長さのヌクレオチド配列を選びます商業pBAD33プラスミド、32（b）は36-54塩基対長のヌクレオチド配列領域10-150に相同でbp標的遺伝子の5 '開始部位の下流を選択 興味のあります。
- ヌクレオチド配列の5 '末端に（b）の中で選んだ塩基配列の3'末端に参加し、したがって、単一の55から72までの長い前方オリゴマーを与えて、（a）の中で選びました。
- 次のように単一の55から72 bpの逆オリゴマーを設計して、（a）領域10から100 bpの中のDNA配列に相同である19-32 bpの長さのヌクレオチド配列を選ぶ下流3の目的の標的遺伝子のエンドサイト「商業pBAD33プラスミド中のクロラムフェニコール遺伝子の末端、および（b）は3の上流10-150塩基対以内の領域に36から54 bpの長さのヌクレオチド配列の相同性を選択」 。
- 3ヌクレオチド配列の '末端塩基配列の末尾が5に（b）の中で選んだ「参加する（a）は、それ単独のオリゴマー作るために選びました。
- 任意の利用可能なバイオインフォマティクスソフトウェアに、このオリゴマーをコピーし、その逆相補体にシーケンスを変換します。これは、単一の55から72 bpの長逆オリゴマーが得られます。
- 使用可能な任意のオリゴアナライザー・プログラムを使用して、組換えオリゴマーは40から60までパーセント、低ヘアピン融解温度（T m）、低自己とヘテロ二量体化T メートルの間のGC含量を持っていることを確認してください。任意の好適なバイオテクノロジー企業からの合成と出荷のためのプライマーを注文します。
- 次のように単一の55から72塩基対の前方オリゴマーを設計します。（a）は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の5 '開始部位の上流領域10-100 bpの中のDNA配列に相同である19-32 bpの長さのヌクレオチド配列を選びます商業pBAD33プラスミド、32（b）は36-54塩基対長のヌクレオチド配列領域10-150に相同でbp標的遺伝子の5 '開始部位の下流を選択 興味のあります。
- pBAD33（CM RからCATカセットの増幅
- 200rpmで、37℃で振とうしながら20μg/ mLのクロラムフェニコール（CM）で滅菌LB培地（LB）でpBAD33プラスミドをDH5α細胞の一晩（O / N、16〜18時間）の文化を育てます。
- 室温でO / N培養の遠心分離機6-8 mLを、3分間5000×gで。上清を除去し、プラスミドミニプレップキット（ 材料表 ）および製造業者のプロトコルを使用してペレットからpBAD33プラスミドを抽出します。
- 与えられた順序で滅菌チューブに以下を追加することで、pBAD33プラスミドDNAのダイジェストを実行します。50μL、pBAD33プラスミド1μgの容量の最終容量に再蒸留水（のddH 2 O）の適切な量、5μLの10倍AvaI制限酵素の酵素反応緩衝液、及び0.5μL（RE）。静かにピペッティングにより混合し、反応を37℃で1時間進行させます。熱は、80℃で20分（分）、反応を不活性化°C。粘着末端の劣化を最小限に抑えるために、もはや24時間以上のために-20℃で保存サンプル。
- 250 mLの三角フラスコ内のバッファ1×TAEの100ミリリットル（;; 20mMの酢酸、1mMのEDTA、40mMのトリス、pH8.5）で、アガロースの1.2グラムを混合することにより、分離ゲル1.2％アガロースを準備します。完全に電子レンジで溶解する熱と旋回。液体が沸騰し、フラスコを旋回し始めるとすぐに加熱を停止します。
- 旋回しながら、室温で3分間液体アガロースを冷却混合するための10mg / mLの臭化エチジウムとスワールの2μLを追加します。ウェルコームを有するゲルトレイにアガロースを注ぎ、それを室温で1時間凝固することを可能にします。 1×TAE緩衝液中で最大2日間4℃で保存してゲル化します。
- それぞれが1.2.3からピペッティングによるDNAローディング色素（50μL反応あたりの色素の10μL）の0.2容量でダイジェストRE混ぜます。負荷を500μg/ mLのDNAラダーの5μLaの上に別のウェルに第一のウェルとREダイジェスト染料混合物のすべてにgaroseゲル。ゲルに反応容積のすべてをロードするために2-3井戸を使用してください。
- かろうじて1×TAE緩衝液中に沈めたゲルを実行し、ゲル電気泳動装置で65分間45-50 V（4.5から5 V / cm）でで動作します。
- UVキャビネットおよび滅菌かみそりを使用して、迅速にDNAのUV照射を最小化するためにゲルからCAT配列に対応するの2.8kbのバンドを切りました。製造業者のプロトコルに従ってゲル抽出キット（ 材料表）を使用して、カットアウトゲルスライスからDNAを抽出します。
注：直接UVの下で肌を露出し、注意してかみそりを処理しないように注意してください。 - 相同組換えを可能にする遺伝子配列に対して相同突出部を含む1.1に設計されたプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって1.2.6から抽出されたCATカセットを増幅します。 PCR反応は、次の順序で、製造業者のガイドライン（ 材料表）を使用して氷の上に設定されています。
- に無菌PCRチューブは、O PCR緩衝液の10μL、10 mMのdNTPを、10μMのフォワードプライマーの2.5μL、10μMのリバースプライマーの2.5μLの1μLに続いて、50μLの最終容量にのddH 2の適切なボリュームを追加します、100単位/μLDNAポリメラーゼの1.2.6および0.5μLから鋳型DNAの1から25 ngの。
- 1.2.7.1としてではなく、鋳型DNAを除いて同じ成分を負う負の制御を設定します。適切なのddH 2 Oのボリュームの代わりに、鋳型DNAを使用してください。そのような製造業者によって陽性対照として提供されるように、PCR反応において機能することが実証されている鋳型DNAおよびプライマーを用いてポジティブコントロールを設定します。
- ピペッティングにより穏やかにすべての反応内容物を混ぜます。
- 次の設定を使用して、PCRによって増幅する：98℃で30秒間の最初の変性、98℃で、20秒間のプライマーアニーリング、72℃でのアンプリコンのキロベースあたり20秒のための拡張機能であり、aで10秒の変性の30サイクルフィン72℃で10分間アル拡張子。 -20ºCで保存サンプル。
- 各反応のわずか5μLを使用して（1.2.4-1.2.5を参照）アガロースゲル電気泳動を介して、増幅の正しいサイズを確認してください。 PCR精製キットを、製造業者のプロトコルを使用してPCRアンプリコンを精製します。ストアは、-20ºCでDNAを精製しました。
- フォワードプライマーの5から始まり '末端および3に向かう'、次の順序で最後の設計：（A）の切断効率のために4ランダムヌクレオチド（アデニン、チミン、グアニンとシトシンの組み合わせ）を選択、に取り付けられた（B） （c）は、続いてEcoRI制限酵素（RE）切断部位配列（GAATTC）、開始コドンを含む、関心対象の遺伝子の5 '末端に相同な21~25塩基対長のヌクレオチド配列。標的遺伝子はEcoRI部位が含まれている場合は、pK184マルチクローニングサイトから別の適切なREを選択します。
- ペリプラズムタンパク質をコードする遺伝子の場合には、RE部位とフォワードプライマーで開始コドンとの間の追加のリーダー配列を含みます。
- 使用可能な任意のオリゴアナライザを使用して、プライマーは40から60パーセント、低ヘアピンT mを、低自己とヘテロ二量体化T メートルの間のGC含量を持っていることを確認してください。合成のためのプライマーを注文してください。
- 32ºCと200 rpmで振盪しながら10μgの/ mLのテトラサイクリン（TC）を含む滅菌LBでDY330R pOX38-TC細胞のO / N培養物を成長させます。室温でO / N培養の遠心分離機6-8 mLを、3分間5000×gで。デカント上清およびプラスミドミニプレップキット（ 材料表 ）および製造業者のプロトコルを使用して、ペレットからのプラスミドDNAを抽出します。
- （1.2.7.1-1.2.7.3を参照）を鋳型としてpOX38-TCを使用して、1.3.1-1.3.5からプライマーを用いて、関心の完全な遺伝子を増幅します。
- 各反応のわずか5μLを使用して（1.2.4-1.2.5を参照）アガロースゲル電気泳動を介して、増幅の正しいサイズを確認してください。 PCR精製キットを、製造者のプロトコルを用いて増幅されたDNAを精製します。ストアは、-20℃でDNAを精製しました。
- （1.3.7から。）市販pK184プラスミドDNAと増幅された遺伝子の両方の二重消化を行い、指定された順序で滅菌チューブに以下を追加することにより：50μLの最終容量のddH 2 Oの適切な量を、pK184プラスミド1μgの量、5μLの10x酵素反応バッファー、および各EcoRIおよびHindIIIの1μL。
- 静かにピペッティングにより混合し、反応を1時間進行させます37ºCで。熱は80ºCで20分間反応を不活性化します。粘着末端の劣化を最小限に抑えるために、もはや24時間以上のために-20℃で保存サンプル。
注：ここで使用される制限ヌクレアーゼの種類は、ステップ1.3.1および1.3.2でプライマー中に設計された制限酵素サイトに依存します。 - 陽性対照として、反応管に一つだけのREを追加除き、1.3.8と同様の反応を調製することによりpK184プラスミドの単一のダイジェストを設定します。両方のREと別々にこれを行います。
- 静かにピペッティングにより混合し、反応を1時間進行させます37ºCで。熱は80ºCで20分間反応を不活性化します。粘着末端の劣化を最小限に抑えるために、もはや24時間以上のために-20℃で保存サンプル。
- ダブルpK184遺伝子の両方の断片を消化DNAを抽出1.2.4-1.2.5プロトコルを使用して、1.2％アガロースゲル上で消化物を実行します ステップ1.2.6によると、関心の。
- 3ベクター：10×T4 DNAリガーゼバッファー、1から成る100 ngのDNAの合計の2μL：次の順序で、滅菌チューブにコンポーネントを追加することにより、pK184ベクターへの遺伝子の挿入を連結挿入（pK184：遺伝子） 比、のddH 2 Oまで20μLと1μLのT4 DNAリガーゼの総容量。ネガティブコントロールとして、挿入遺伝子なしでベクター100ngを用いて同様の反応を設定します。
- 穏やかにマイクロピペットを用いて、全ての反応内容物を混合し、25℃で30分間インキュベートします。 65℃で10分間ライゲーション反応を熱不活化した後、氷上に置きます。
- 氷上でいる間、pK184-遺伝子の15μLを追加 滅菌した1.5 mLの試験管内で化学的にコンピテントなDH5α細胞の100μLまでのステップ1.3.10からライゲーション反応。静かにピペッティングにより混合し、氷上で10分間インキュベートします。陰性対照試料についても同様にします。陽性対照のために、pBAD33のようなプラスミドの20から100 ngのを使用し、50μLDHαの細胞に変換。
- 直接42℃の水浴中に氷からのサンプルを転送し、90秒間インキュベートします。これは、細胞に熱ショックを提供し、それらをプラスミドDNAを取り込むことができます。
- 別のために戻って氷の上のセルを配置その後、5分および滅菌LBの900μLを追加125 rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートします。
- 50μg/ mLのカナマイシン（キロ）を含む寒天プレート上に1.3.13の各ライゲーション反応からのサンプルの100μLボリュームを等分し、滅菌スプレッダーを用いて細胞を広めます。ポジティブコントロールプレートは、適切な抗生物質を持っている必要があります。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。 37℃で一晩逆さまにプレートをインキュベートします。
- 滅菌ピペットまたはループを使用して、細胞の単一の別個のコロニーを採取し、50μg/ mlのキロと20 mLの滅菌LBに接種。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。細胞O / Nは、200 rpmで振盪しながら37℃で成長します。
- 滅菌クライオチューブに無菌の100％グリセロール（最終50％v / vの）の500μLでO / N培養の500μLを混合することにより、形質転換されたDH5α細胞の3-5グリセロールストックを作ります。 -80℃で保管してください。
- 室温でO / N培養のも遠心分離機6-8 mLで、5,003分間0 XG。上清を除去し、プラスミドミニプレップキット（ 材料表 ）および製造業者のプロトコルを使用してペレットからpK184遺伝子回復プラスミドを抽出します。
注：欠失、挿入および/または点突然変異のために設計されたプライマーを容易に製造者のオンラインで利用可能なツールを用いて生成することができます。
- 開始コドンを含む、目的の遺伝子の5 '末端に相同である18-32 bpの長さのヌクレオチド配列を選択することで、各フォワードプライマーを設計します。各フォワードプライマーは、適切な長さのN末端ペプチド断片を欠く欠失変異体で、その結果、一つ前の30から180 bpの下流にアニールするように設計プライマー。
- 停止コドンを含む、目的の遺伝子の3 '末端に相同である18-32 bpの長さのヌクレオチド配列を選択することで逆方向プライマーを設計します。このプライマーをコピーNY利用可能なバイオインフォマティクスプログラムとその逆相補体にシーケンスを変換します。これはリバースプライマーです。
- ペリプラズムタンパク質をコードする遺伝子の場合、遺伝子の末端およびペリプラズムにおけるタンパク質産物の適切なローカライズのために必要とされる3 '5フランクリーダー配列の終わり」の逆相補体であるリバースプライマーを設計します。
- 任意の利用可能なオリゴ分析プログラムを使用して、削除プライマーは40〜60％、低ヘアピン融解温度（T m）、低自己とヘテロ二量体化T Mの間のGC含量を有することを確認します。任意の利用可能なバイオテクノロジー企業からの合成と出荷のためのプライマーを注文します。
- テンプレートと1.2.7-1.2.8のガイドラインとして、プロトコル1.3で得られたpK184-遺伝子構築物を使用して、PCRは、段階的に設計されたプライマーを用いて欠失構築物を増幅1.4.1-1.4.3 pK184遺伝子ΔXアンプリコンを生成するために、 。ストア増幅したDNA Aトン-20°C。
- 任意の利用可能な突然変異誘発キット（ 材料表）を用いて増幅したコンストラクトを連結。
- （1.3.11-1.3.13を参照）は、標準的な熱ショックプロトコルを使用して化学的にコンピテントなDH5α細胞に別々にpK184遺伝子ΔXのリゲートのそれぞれを変換します。
- 50μg/ mlのキロメートルを含む寒天プレート上に1.4.12の各ライゲーション反応からのサンプルの100μLボリュームを等分し、滅菌スプレッダーを用いて細胞を広めます。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。 37℃で一晩逆さまにプレートをインキュベートします。
- 滅菌ピペットまたはループを使用して、細胞の単一の別個のコロニーを採取し、50μg/ mlのキロと20 mLの滅菌LB培地に接種。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。細胞O / Nは、200 rpmで振盪しながら37℃で成長します。
- 無菌の100％グリセロールの500μLでO / N培養の500μLを混合することにより、形質転換されたDH5α細胞の3-5グリセロールストックを作る（Final 50％v / v）の滅菌クライオチューブです。 -80℃で保管してください。
- 室温でO / N培養の遠心分離機6-8 mLを、3分間5000×gで。上清を除去し、プラスミドミニプレップキット（ 材料表 ）および製造業者のプロトコルを使用してペレットからpK184 遺伝子 ΔXのプラスミド構築物を抽出します。 -20℃で保存するDNA。
pOX38-TCΔgene:: Cmと株の2世代
- DY330R pOX38-TCΔgene:: Cmをノックアウト
- 10μg/ mLのTcのを含む10 mLの滅菌LBでDY330R pOX38-TC細胞のO / N培養物を準備します。 32℃、200rpmで培養O / Nを成長させます。
- 新鮮な滅菌LBの20ミリリットルにO / N培養の1:70希釈を作ります中期対数期（OD 600nmで0.4から0.6）成長するまで32℃で細胞を増殖させます。
- 揺れ水BA中の滅菌フラスコに文化の移転10 mLおよび150 rpmで15分間、42℃でインキュベート番目。これはDY330Rにおける組換え特異的タンパク質の発現を誘導します。
- 10分間氷水浴中で培養物を冷やします。次のようにエレクトロコンピテント細胞を準備します。
- 4ºCで7分間、4000×gであらかじめ冷却コニカルチューブと遠心分離機に冷やした細胞を転送します。今後のステップで使用される全てのチューブおよびピペットを冷却するために4℃または氷上に置かれるべきです。
- 上清を除去し、静かに氷のように冷たいのddH 2 O 1mL中の細胞は氷冷のddH 2 Oの別の30 mLを加え再懸濁
- 穏やかに遠心分離した細胞（4,000×gで、7分、4℃）、上清を破棄し、氷冷のddH 2 O 1mLに細胞を再懸濁しました
- 4ºCで1分間15,000×gで予備冷却1.5 mLのマイクロチューブと遠心分離機に再懸濁した細胞を転送します。
- 静かに、50μL容量中の氷冷のddH 2 O、アリコートの200μLにペレットを再懸濁しました。 Electrocompete細胞は-80℃で保存することができる塩基
- ピペッティングにより穏やかに、氷上で混合しながらエレクトロDY330R pOX38-TC細胞の50μLに1.2からの増幅されたCATカセットの300 ngのを追加します。陽性対照として未修正のpBAD33プラスミドを使用して、この手順を繰り返します。
- 予め冷却した（-20°C）1ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに細胞を移します。エレクトロを使用して、5.5ミリ秒の時定数で1.8 kVでの細胞をエレクトロポ。すぐにパルスを印加した後、1 mLのSOCのメディアで細胞を希釈し、新鮮なマイクロチューブに移します。 2時間32℃で細胞をインキュベートします。
- 10μg/ mLでのTcおよび20μg/ mLののCmを含有し、滅菌スプレッダーを用いて拡散寒天プレート上に各試料のアリコート100μL。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。成功した組換え体を選択するために32℃で一晩逆さまにプレートをインキュベートします。細胞に導入されたCATカセットが相同な再を受けます目的の遺伝子との組み合わせとはDY330R pOX38-TCΔgene:: Cmを（リフR、Tcの R、CmのR）のクローンを作成します。
注：エレクトロ細胞を生成する前に、ステップ2.1.3の42℃での15分間の誘導を除いて、32℃でDY330R細胞を成長させることが重要であり、高温での長期の成長により産生細胞死リスクとしてDY330Rにおける再結合機能を担うのP Lオペロンから毒性産物の。 33,34 - Oを準備/ DY330R pOX38-TCΔgeneのN ::滅菌ピペットまたはループと細胞の単一の別個のコロニーを収穫し、10μgの/ mLでのTc、および20μg/ mLで20 mLの滅菌LB培地を接種することによりCmの細胞Cm。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。細胞O / Nは、200 rpmで振盪しながら32℃で成長します。
- 無菌の100％GLの500μLでO / N培養の500μLを混合することにより、O / Nから3-5グリセロールストックを作ります滅菌クライオチューブ中ycerol（最終50％V / V）。 -80℃で保管してください。
- 室温でO / N培養の遠心分離機6-8 mLを、3分間5000×gで。上清を除去しpOX38-TCΔgene:: Cmを抽出 プラスミドミニプレップキット（ 材料表 ）および製造業者のプロトコルを使用してペレットから構築します。 -20℃で精製したDNAを保存します。
- プロトコル3.1に従って遺伝子ノックアウトによって共役の中断を確認するために、受信者としてXK1200細胞を用いた接合交配アッセイを行います。
- DY330R pOX38-TCΔgene:: Cmを+ pK184遺伝子
- 2.1.4-2.1.7手順に従ってエレクトロポレーションを介しpK184-遺伝子構築物の300 ngのでエレクトロDY330R pOX38-TCΔgene:: Cmと細胞を形質転換します。すべての選択培地を20μg/ mLでのCmおよび50μg/ mLのキロを含める必要があります。 32℃でインキュベートします。エレクトロポレーションした細胞の回復プラスミドは現在、Dでノックアウト遺伝子の機能を回復しますY330R pOX38-TCΔgene:: Cmを細胞。
- 滅菌ピペットまたはループと細胞の単一の別個のコロニーを収穫、および20μg/ mLの、Cmを20 mLの滅菌LB培地に接種することにより:: Cmを+ pK184、遺伝子組換え細胞O DY330R pOX38-TCΔgeneの/ Nを準備しますおよび50μg/ mLのキロ。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。細胞O / Nは、200 rpmで振盪しながら32℃で成長します。
- 滅菌クライオチューブに無菌の100％グリセロール（最終50％v / vの）の500μLでO / N培養の500μLを混合することにより、O / Nから3-5グリセロールストックを作ります。 -80℃で保管してください。
- またXK1200 pOX38-TCΔgene:: Cmを組換え細胞を生成するためのプロトコル3.1を実行します。
- XK1200 pOX38-TCΔgene:: Cmを+ pK184遺伝子および変異体
- （ステップ2.2.4から）エレクトロXK1200 pOX38-TCΔgene:: Cmと細胞を準備します。
- 別に電子部品商談の50μLにpK184遺伝子またはpK184遺伝子変異プラスミド300ngのをエレクトロポctrocompetent XK1200 pOX38-TCΔgeneの手順に従って、:: Cmと細胞2.1.4-2.1.7。すべての選択培地を10μg/ mLのナリジクス酸（NAL）、20μgの/ mLでのCm、および50μg/ mLのキロが含まれている必要があり、37℃でインキュベートします。
- Oを準備/ XK1200 pOX38-TCΔgeneのN ::滅菌ピペットまたはループと細胞の単一の別個のコロニーを収穫し、Nalで、20μgの/ mLを持つ20 mLの滅菌LB培地を接種することによりCmの+ pK184遺伝子組換え細胞CMおよび50μg/ mLのキロ。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。細胞O / Nは、200 rpmで振盪しながら37℃で成長します。
- 滅菌クライオチューブに無菌の100％グリセロール（最終50％v / vの）の500μLでO / N培養の500μLを混合することにより、O / Nから3-5グリセロールストックを作ります。 -80℃で保管してください。
3.接合性交配アッセイ
- 接合交配はXK1200 pOX38-TCΔgene:: Cmと細胞を生成します
- 20 mLの滅菌LB O / NのCULを準備DY330R pOX38-TCΔgeneのトゥーレは::滅菌ピペットまたはループを使用してのCm + pK184遺伝子細胞を20mLの滅菌LBは上のグリセロールストックまたは単一コロニーを20μgの/ mLでのCmおよび50μg/ mLのキロメートルを含む接種します寒天プレート。 200 rpmで振盪しながら32℃で成長します。 37℃で成長し、10μgの/ mLのNalで、20 mLの滅菌LBにXK1200細胞のための同じを準備します。
- 別に同じ抗生物質内容の滅菌LBの2 mLの各培養物の1:70希釈液を作ります。すべてのドナー細胞への100mMの最終濃度にグルコースを追加します。 200 rpmで振盪しながら37℃で対数中期（OD 600 0.5から0.7）に細胞を増殖させます。
- 遠心分離機2 mLの冷間無菌のLBに抗生物質、および再懸濁細胞を除去するために、冷滅菌LBで一回洗浄し、上清を捨て、細胞をペレット化する（4000×gで5分間4℃）
- 一定分量の滅菌LB培地の800μLに各培養の100μL、それらを振とうせずに1時間、32℃で交尾することができます。 <LI>ボルテックス30秒のための細胞は、交配対を破壊し、さらに交配を防ぐために10分間氷上にそれらを配置します。
- XK1200 pOX38-TCΔgene:: Cmのセルを選択するためには10μg/ mLでのNalおよび20μg/ mLののCmを含む寒天プレート上に細胞混合物の一定分量100μL。滅菌スプレッダーを用いて細胞を広げます。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。 37°Cの逆さまにプレートO / Nインキュベートしました。
- 新しいXK1200 pOX38-TCΔ遺伝子の単一コロニーを収穫:: Cmを 滅菌ピペットまたはループを使用してノックアウト株および20μg/ mLのCmを、O / Nでと滅菌LBに成長 200 rpmで振盪しながら37℃です。滅菌クライオチューブに無菌の100％グリセロール（最終50％v / vの）の500μLでO / N培養の500μLを混合することにより、O / Nから3-5グリセロールストックを作ります。 -80℃で保管してください。
注：結果として得られる細胞は、今お尻のためにpK184-遺伝子構築物（プロトコル1.3および1.4）を用いた形質転換のための有能行うことができますプロトコル3.2での接合伝達を回復する能力に遺伝子およびその変異体をディエッサー。
- XK1200 pOX38-TCΔgeneのO / N培養物を準備:: Cmを+ pK184遺伝子 20μgの寒天プレート上にグリセロールストックまたは単一コロニーからの細胞を使用して/ mLのCmを、50μg/ mlのストレプトマイシン（SM）と5mLのLB中の50μg/ mLのキロとMC4100細胞と滅菌と滅菌LB 20mLの中の細胞ピペットまたはループ。で培養物を成長させます 200rpmで振盪しながら37℃です。
- 同じ抗生物質を滅菌LB 2mLに個別に各O / N培養物から1:70希釈液を作ります。すべてのドナー細胞への100mMの最終濃度にグルコースを追加します。 200 rpmで振盪しながら37℃で対数中期（OD 600 0.5から0.7）に細胞を増殖させます。
- 遠心分離し、上清を捨て、細胞をペレットantibioを削除するには、冷滅菌LBで1回洗浄する（4,000×gで5分間4℃）2 mLの冷間無菌のLBでチック、および細胞を再懸濁します
- 重複では、滅菌LB培地の800μLに、各培養物のアリコート100μLとは、それらを振盪せずに1時間、37℃で交尾することができます。
- 渦30のための細胞は、交配対を破壊し、さらに交配を防ぐために10分間氷上に配置します。
- ステップ3.2.2、新鮮な滅菌LBから中期対数培養を用いて、10 -2から10 -7にドナーとレシピエント細胞の6段階希釈液を準備します。
- 10μg/ mLのNalで、20μgの/ mLでのCmおよび50μg/ mLのキロメートルを含む寒天プレートの2つの半分、XK1200ドナー細胞の各希釈液の10μLのアリコートを、スポットのそれぞれに、図2に示すように。 50μg/ mlのSmのを含む寒天プレート上の受信者のMC4100細胞の希釈液について繰り返します。 37℃でプレートO / Nインキュベートします。
- ステップ3.2.5、新鮮な滅菌LBからボルテックス混合物を使用して、10 -2〜10 -7〜6希釈液を（準備図2のように、50μg/ mlのSm及び20μgの/ mLののCmを含有する寒天プレートの各半分に希釈液の各10μLのアリコートをスポットすることによってトランス接合MC4100 pOX38-TCΔgene:: Cmと細胞を選択。両方の重複の混合物について、この手順を繰り返します。無菌領域を維持し、火気の近くで働いています。 37℃でプレートO / Nインキュベートします。
- プロトコル3.3で説明したように各構築物の接合効率を決定します。
- すべての回復プラスミドは共役の効率上の特定の変異の効果を評価するために、このプロトコルを繰り返します。
- それぞれのプレート上の各ドナー、レシピエントおよびトランス接合セルに対して同じ希釈スポッティングからコロニーの数を数えます。
- その与えられた希釈での受信者以外のトランスの数が多いことから生じる任意のバイアスをテストするために、受信者のコロニーを数えます。
- C言語ドナーコロニー数で割ったトランス接合コロニーの数として交配効率をalculate。 100ドナー細胞当たりの効率値を得るために100を掛け。
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Representative Results
Fプラスミド駆動型細菌接合プロセスは、線毛の合成と接合DNAの転送を容易にするT4SSを組み立てるF-プラスミドのTRA領域内に伝達タンパク質を伴う協調プロセスです。タンパク質TRAF（GenBankアクセッション番号BAA97961、UniProtのID P14497）は、接合F線毛形成に必要とされます。 10,14,35 -それは、触媒CXXCモチーフを持っていませんが、37タンパク質は、C末端チオレドキシン様ドメインが含まれています。それは、そのN末端ドメインを介してTraHタンパク質と相互作用すると予測されているが35,38、39地域は他にあまりない37は 、タンパク質の構造的特徴について知られている、そのC末端ドメインよりも、よりダイナミックであることが示されました。構造研究と併せてTRAFタンパク質の機能的側面を評価するために、我々はまず、相同経由pOX38-TCにTRAF遺伝子をノックアウト組換え大腸菌 DY330R細胞におけるpOX38-TCΔtraF:: Cmのプラスミド（ 表1）を生成します 。また、生成された33,34は、結合の回復を提供し、タンパク質の配列をプローブ有効にするTRAF特異的プライマー（ 表2）からpK184-TRAFプラスミドでした。 pK184-TRAFがトランスで提供されていたXK1200細胞DY330R細胞から40へpOX38-TCΔtraF:: Cmをプラスミドの転送を示している（のトランスは、10 / mlのTcのおよび20μg/ mLのCmが10μgの/ mLのNalで上に成長させました） pOx38-TCΔtraF:: CMで、その（a）は、TRAFノックアウトは、インフレームCATカセットを提供し、（b）はそのpK184-TRAFは、接合機能を回復させることができます。
TRAF変異体のシリーズはXK1200 pOX38-TCΔtraF:: Cmを+ pK184-TRAFΔXを使用して接合交配アッセイ37を使用して、分析のために生成されましたそれぞれのドナーとレシピエントのような細胞およびMC4100細胞41。一つの代表的な変異体TRAF 55から247（ 表1）、タンパク質の領域はTraHと相互作用することが予測さ削除N末端欠失変異体です。完全長TRAFタンパク質がドナー細胞に提供されている場合、空のプラスミドpK184んではない（ 表3）を提供しながら、接合伝達は、（ 図2）復元されます。プラスミドpK184-TRAF 55から247（ 表3）が設けられたとき同様に、XK1200ドナー細胞における接合機能が復元されません。これは、タンパク質の切断部位は、おそらくTraHとの相互作用を介して、接合装置内のTRAFの機能にとって重要であることを示し、さらに変異解析のために標的化するためにタンパク質の領域を提供します。
図2： マット結合中の標的遺伝子の機能を評価するためのアッセイをる。ドナーとレシピエント細胞は、大腸菌 XK1200 pOX38-TCΔtraF:: Cmは、それぞれ、pK184-TRAFとMC4100で形質転換しました。得られたトランス（MC4100 pOX38-TCΔtraF:: Cmが）接合機能の正常な回復を示し、Sm及びCmとを含むプレート上で成長します。実験は、単一の寒天プレート上に二重に行われ、連続希釈を修復遺伝子変異体（ 表2）の接合効率を計算するために使用されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 細菌株/プラスミド | 関連する特性 | 選択マーカー（複数可）† | 参照 |
| 菌株 | |||
| DY330R | W3110ΔlacU169gal490λc1857Δ（CRO-のbioA）リフR | 解雇 | 33,34 |
| XK1200 | F - lacΔU124Δ（バイオジャイラattλ灘aroGギャル） | NAL | 40 |
| MC4100 | araD139Δ（ARGF-LAC）U169 rpsL150 relA1 flbB3501 deoC1 ptsF25 rbsR | Smの | 41 |
| ベクターおよび構築 | |||
| pBAD33 | P のaraBADから下を発現するプラスミド | Cm | 32 |
| pK184 | ベクトル、P15Aレプリコンをクローニング2.4キロバイト | キロ | 31 |
| pK184-TRAF‡</ TD> | pK184でpOX38からF TRAF | キロ | 35 |
| pK184-TRAF 56から247 | pK184-TRAFからF TRAFアミノ酸56から247 | キロ | |
| 接合プラスミド | |||
| pOX38-TC | IncFI、トラ+、RepFIA +、F、ミニのTnのF1 HindIII断片 | Tcの | 29,30 |
| pOX38-TCΔtraF:: Cmを | CATとpOX38-TcはTRAFに挿入します | TcのCmを | 35 |
| †Cmを、クロラムフェニコール;キロ、カナマイシン。 Nalで、ナリジクス酸;リフ、リファンピシン; Smを、ストレプトマイシン; Tcを、テトラサイクリン | |||
| ‡すべてのTRAF構築物は、細胞膜周辺腔への局在化を確実にするために、19残基のリーダー配列を含んでいます。 | |||
表1：
| 構築します | プライマー* |
| TRAF-CM-について | 5'- GATCGAGGCTGGCAGTGGTATAACGAGAAAATAAATCCGAAGGA - CTGTGACG GAAGATCACTTC -3 ' |
| TRAF-CM-REV | 5'- TCTTCAGAAACGTTCAGGAACTGTTTTGCCAGGTCGTCCT - CTTATTCAGGCGT AGCACCAG -3 ' |
| pK184-TRAF-について | 5'- TTTTTT GAATTC TATGAATAAAGCATTACTGCCAC -3 ' |
| pK184-TRAF-REV | 5'- TTTTTT AAGCTT TAAAAATTGGGTTTAAAATCTTCAGAAA -3 ' |
| pK184-TRAF 55から247 -For | 5'- TACG CATATG ATGGCCGCACTGCAGACGG -3 ' |
| pK184-TRAF 55から247 | 5'- TACG CATATG TCCTGACGCCGGAAAAATAAAGCAGCAGAGTAA -3 ' |
| †レントらから適応表。許可を得て、2016年35 | |
| * TRAF張り出し領域はイタリック体です。 （：AAGCTTをEcoRI：GAATTCをNdeI：CATATG HindIIIで）制限酵素部位には下線が引かれています | |
表2：本研究で使用したプライマーのリスト。
| ドナープラスミド† | 回復プラスミド | トランス接合‡§（細胞ミリリットル-1） | 交尾Efficiency§|| |
| pOX38-TCΔtraF:: Cmを | なし | 0 | 0 |
| pOX38-TΔtraF:: CmをC | pK184 | 0 | 0 |
| pOX38-TCΔtraF:: Cmを | pK184-TRAF | 5×10 3 | 0.0167 |
| pOX38-TCΔtraF:: Cmを | pK184-TRAF 55から247 | 0 | 0 |
| *レントらから適応表。許可を得て、2016年35 | |||
| †ドナー細胞は、3×10 7細胞mlの平均濃度で、 大腸菌 XK1200た-1 | |||
| ‡レシピエント細胞は、 大腸菌 MC4100ました。ポジティブコントロール用のトランスの数は10-5希釈からです。 0は10-2希釈からのトランス接合体がないことを示します。 | |||
| 2〜4個の交配実験の§An平均は、各構築物について実施しました。 | |||
| ||交尾効率がdefinです100ドナー細胞当たりのトランスとして編。 0交配効率は10-2希釈からのトランス接合体がないことを示します | |||
表3：TRAF 欠失構築物により廃止接合効率。
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Discussion
細菌接合プロセスは、細菌は、抗生物質耐性マーカーの普及など厳しい環境での成長のための進化上の利点を提供する遺伝子を広げることができる手段を提供します。接合性プラスミドの多くは非常に大きいので、接合プラスミド自体に標的遺伝子の突然変異によって転写装置の組み立てに関与するタンパク質上の12機能的研究は扱いにくいです。本明細書で詳細なプロトコルは、一つにはより容易に、より小さく扱い発現プラスミド（ 図1）を使用することによって、目的の標的遺伝子を評価することができる手段を提供します。我々は、Fプラスミド媒介性の結合を研究するためにFプラスミドの誘導体pOX38-TC（ 表1）を使用します 。他の接合性プラスミドはここで詳述プロトコルと適切な派生プラスミドを使用して研究することができます。概説交配アッセイは、いくつかのmodificatiとフロストや同僚、42から適応されていますアドオン。以前の研究では、pOX38-TCΔgene:: Cmを構築物の8,33,42作成は、適切な制限酵素を用いて目的の遺伝子を切断し、pOX38-TCに増幅CATカセットを挿入することによって達成されました。現在の方法では42、我々は、標的遺伝子をノックアウトし、CATカセットと交換するリコンビニアリング大腸菌株 DY330R 33,34における相同組換えを使用します。 F-T4SSはpK184遺伝子回復プラスミドを用いた転写の回収を介して接合伝達を媒介外これはpOX38-TCΔgene:: Cmは、遺伝子特異的ノックアウトのための対照として作用するように構成保有得DY330R株を可能にするという利点を有します。それは野菜室-Cas9方法論を用いてノックアウトを生成することが可能かもしれないが、43は、現時点ではこの可能性を調査していません。
プロセスは、F派生プラスミドpOX38-TC（Figurに遺伝子ノックアウトの世代で始まりますE 1）。これはDY330R細胞（ 表1）中での相同組換えを介して達成され、例えば、DY329、DY331およびDY378と同様の機能を有する他の株も使用することができます。プライマーは、最初pBAD33プラスミド32からCATカセットを増幅し、標的遺伝子（ 表2）に特異的なオーバーハング塩基を含むPCRように設計されています。 PCR産物を、次いでpOX38-TCを保有DY330R細胞にエレクトロポレーションされます。相同組換えは、CATのカセットがCm耐性を提供しながら、効果的にT4SSアセンブリおよび結合を破壊し、標的遺伝子内にインフレームで挿入されているノックアウトプラスミドpOX38-TCΔgene:: Cmとを生成します。これと同時に、標的遺伝子はpOX38-TCからPCR増幅し、小発現プラスミドに挿入し、このプロトコルでは、我々は、必要に応じてしかし1は、標的遺伝子の誘導発現とプラスミドを選んだ可能性があり、構成的発現のためにpK184を使用します。 pK184-遺伝子プラスミドは、その後、形質転換されますDY330R pOX38-TCΔgene:: Cmを細胞に、これらの細胞は、次いでpOX38-TCΔgene:: Cmは交配アッセイのためXK1200細胞への結合を介して構築転送するためのドナーとして使用されます。交配アッセイでは、ドナーとレシピエント細胞は、それぞれXK1200 pOX38-TCΔgene:: CMとMC4100、です。 pK184遺伝子回収プラスミド、ならびに標的遺伝子（欠失または点変異）の一連の変異体は、MC4100のレシピエント細胞（ 図2を用いて、交配を復元し、その効率を決定する能力を評価するために、ドナー細胞に提供されます。 ;表3）。
手順にとって重要適切なドナーおよびレシピエント株（ 表1）、および使用されるプライマーの設計を使用することです。設計された各プライマーについて、従うべき一般的なガイドラインがあります。我々は厳密に40から60パーセントのGC含量に遵守しようとするが、これは常に可能ではないかもしれません。このような場合には、プライマーWをテストするために実験者の判断でありますわずかにこの範囲を下回るまたは上記i番目のGC含量。順方向および逆方向プライマーの融解温度（T m）は類似していなければならない、アニール温度が（T a）の値は常にPCR 2-5゜CによるT mよりも低くなければなりません。ホモおよびヘテロ二量体化のT m 'はsは（より-10キロジュールと30°C以下）非常に低くなければならない一方でヘアピンが開発できるようにするために利用可能な自由エネルギーは、Tよりもはるかに低くする必要があります。プライマーは、所望のように欠失、挿入または点変異を調べるために設計することができます。なお、得られた遺伝子構築物が増幅され、それが適切に発現されるようにインフレームで回収プラスミドに連結されることが当然重要です。コンピテント細胞の形質転換は、それぞれ、エレクトロまたは化学的コンピテント細胞を用いてエレクトロポレーションまたは熱ショックを介して行うことができます。私たちは、エレクトロポレーションは、このようなpOX38-TCと相同組換えoligonucleとして大きな構成のためのより効率的であることがわかりotide、例えばpK184-TRAFとしてより小さい発現プラスミドは、容易に熱ショック方法を用いて、細胞に形質転換することができるが。最後に、両方のドナーとレシピエント株は接合およびリカバリのプラスミド上で使用するものとは異なる別の抵抗を必要とするように、プロトコル全体で使用されている複数の抗生物質が存在するであろうことを覚えておくことが重要です。
別にここで説明交配アッセイ技術から、彼らのアプローチで若干変動する細菌接合を研究するために使用されている他の方法が、あります。水平遺伝子伝達は、細菌が種間の受信者を含む、レシピエント細胞へのプラスミドを転送するプロセスです。 44例えばダールバーグと同僚44による研究は、種間の水平遺伝子伝達の程度を決定するために、細菌接合を使用していました。それらは、KT2442細胞にクローン化したプラスミドに、緑色蛍光タンパク質（GFP）の取り込みを使用しました。染色体リットルKT2442細胞における交流I q遺伝子は、GFPの発現を抑制する。 GFPを担持するプラスミドをlacリI q遺伝子なし種に転送されると、蛍光が観察されます。 44は、種々の種におけるタンパク質の特定の機能を提供するために、その制限にもかかわらず、種間の結合実験は、おそらく異なる種間のタンパク質-タンパク質相互作用のための進化の予測を行うためにここに提示されたプロトコルを用いて結合することができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、自然科学からディスカバリーグラント＆カナダのエンジニアリング評議会（NSERC）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
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