Bestemmelsen af opløsningen struktur af et protein ved lille vinkel røntgenspredning (SAXS) kræver monodisperse prøver. Her præsenterer vi to muligheder for at sikre minimale forsinkelser mellem prøveforberedelse og dataopsamling: online størrelse-(SEC) og online ionbytningskromatografi (IEC).
Biologisk lille vinkel røntgenspredning (BioSAXS) er en kraftfuld teknik i molekylær og strukturel biologi anvendes til at bestemme opløsning struktur, partikelstørrelse og form, og flade-til-volumen-forholdet af makromolekyler. Teknikken kan anvendes til en meget bred vifte af løsningsmodeller betingelser spænder over en bred vifte af koncentrationer, pH-værdier, ioniske styrker, temperaturer, tilsætningsstoffer osv, men prøven er forpligtet til at være monodisperse. Denne advarsel førte til gennemførelsen af væskekromatografi systemer på SAXS beamlines. Her beskriver vi den opstrøms integration af størrelsesudelukkelseschromatografi (SEC) og ionbytningskromatografi (IEC) på en beamline, forskellige metoder til optimal baggrund subtraktion, og datareduktion. Som et eksempel beskriver vi, hvordan vi bruger SEC og IEC-SAXS på et fragment af det essentielle vacciniavirus protein D5, der består af en D5N helicasedomænet. Vi bestemme dens overordnede form og molekylvægt, der viser den hexameriske struktur the-protein.
BioSAXS er et kraftfuldt værktøj til at bestemme formen af nanostørrelse objekter 1-4. Spredningen af røntgenstråler ved en opløsning indeholdende makromolekyler, dimensioneres på nm, registreres ved meget lave vinkler. Denne kantede sortiment indeholder oplysninger om globale parametre: inertiradius; den største intrapartikulære distance; partiklen form; og graden af foldning, denaturering, eller lidelse. Teknikken kræver ikke krystaller, og makromolekylet forbliver i opløsning og kan således holdes under forhold efterligner visse vigtige parametre for cellen, såsom ionstyrke, pH osv Kendskabet til disse faktorer kan bidrage til at fastslå, for eksempel det fysiologisk relevante oligomere tilstand af et protein af interesse eller til at validere en foreslået model af et kompleks. Karakteriseringen af protein-protein interaktioner i forskellige bufferbetingelser, skabelse af modeller for manglende domæner, forfinelse af homologi modeller, og dekan udføres terminering af diskrete foldede og ufoldede tilstande hurtigt og nemt 5.
Som med enhver teknik, BioSAXS har iboende svagheder: aggregerede eller denaturerede prøver, blandinger af partikler, heterogene prøver, stråleskader, og buffer misforhold kan resultere i un-fortolkelige data. For mange analysemetoder, er det implicit antaget, at prøven er monodisperse, et krav, er ofte vanskeligt at opnå i praksis. I mange tilfælde, nedbrydningen af prøven er subtile og kan ikke påvises i data på egen hånd, og ethvert forsøg på at fortolke data giver urigtige eller endda misvisende resultater. For at overvinde disse forhindringer, var kombinationen af størrelse-(SEC) og SAXS implementeret på mange beamlines at sikre datakvaliteten og gøre denne teknik mere tilgængelige for stadig sværere prøver 6-11. For nylig har vi tilføjet en ny metode til at repertoiret ved at udvikle online ionbytningkromatografi (IEC) -coupled SAXS 12. Begge teknikker åbner SAXS til en bred vifte af biologiske partikler tidligere umuligt at analysere. Valget af metode afhænger af de biofysiske egenskaber af partiklerne af interesse.
SEC adskiller makromolekyler ved deres størrelse, hvorved der behov for mindst en forskel i tilsyneladende molekylvægt på 10% til adskillelse. Fysiske begrænsninger i søjlen og fysiologiske egenskaber af prøverne, ligesom hydrofobe overflader, fleksibilitet og manglende stabilitet, også komplicere dataindsamling, analyse og fortolkning.
Ionbytningskromatografi, som adskiller molekyler baseret på deres ladning og dermed deres bindingsaffinitet til IEC kolonne, kan anvendes i stedet for eller som supplement til SEC. Den totale ladning kan let manipuleres ved ændring af pH eller variere koncentrationen af bufferen salt, hvilket giver en forholdsvis simpel metode til styret elution af molekylerne fra IEC kolonne. Ved at bruge afgiften, adskillelse af lignende typer og størrelser af molekyler, som ellers ville være svært at adskille, kan udføres rutinemæssigt med IEC. Derudover IEC har den fordel at være i stand til at behandle fortyndede prøver, tillader en at undgå koncentrering, som bærer den potentielle risiko for denaturering af proteinet. Desværre, som ladningsfordelingen er yderst prøve-afhængig, IEC kræver optimering med hensyn til pH og saltkoncentrationer 13,14.
For mange proteiner, som er vanskeligt at udtrykke, oprense eller begge kun lave mængder af prøven er tilgængelige til at studere. Det er vigtigt at være effektiv og for at minimere antallet af rensningstrin og dermed tab. Af denne grund det sidste oprensningstrin er online direkte inden SAXS dataopsamling, for at øge sandsynligheden for opsamling af en god data sættet.
HerPræsenterer vi og sammenligne online SEC-SAXS og IEC-SAXS. Begge teknikker blev gennemført på BioSAXS beamline BM29 på ESRF (ESRF) i Grenoble, Frankrig 15. Som en prøvesag, brugte vi D5N og helicasedomænet af vacciniavirus protein D5, som var temmelig vanskeligt at analysere strukturelt ved hjælp af andre metoder. Vaccinia virus er et medlem af Poxviridae familien og er 98% identisk med variolavirus, årsagen til kopper. Ved hjælp af vaccinia systemet, studerer vi replikation maskiner, der fokuserer her på de væsentlige helicase-primase D5.
D5 er et 95-kDa protein med en N-terminal Archeo-eukaryot primase (AEP) domæne 16 efterfulgt af en cystein klynge region (res. 240-345) 16. Tættere på C-terminus kommer en D5N domæne (res. 340-460), som altid er forbundet med D5-type helicaser, og endelig en superfamilie 3 (SF3) helicasedomænet (res. 460-785) 17 (Figure 1A). Helicasedomænet af D5 bygger en hexamer ringstruktur, der er nødvendig for tæt binding til DNA. Takket være de seneste SAXS og EM studier er de lav opløsning strukturer i primase og helicase domæner nu kendt 18.
Her viser vi, hvordan man bruger de gennemførte online kromatografiteknikker på BioSAXS beamline BM29 på ESRF at få indblik i strukturen af den C-terminale fragment (rest 323-785) i D5.
For mange makromolekyler, er et sidste rensning skridt ved hjælp chromatografi påkrævet før SAXS dataindsamling for at opnå en god kvalitet datasæt. Men ikke alle prøver forbliver stabile; de kan være tilbøjelige til aggregering eller re-ækvilibrering til en blanding af oligomeriserende stater. Derfor er en endelig online rensning skridt på beamline kræves for at minimere tiden mellem rensning og dataindsamling for at opnå den SAXS data bedst kvalitet. Afhængigt af de biofysiske egenskaber af proteinet af interesse, kan SEC-SAXS eller IEC-SAXS blive valgt til at opnå optimal prøve kvalitet. Her, på et protein-konstruktion afledt af helicase / primase D5, er begge teknikker forklaret og diskuteret.
Erhvervelse af SEC-SAXS data bliver mere og mere standardiseret og er tilgængelig på mange BioSAXS beamlines. Dataanalyse, især baggrund subtraktion, er forholdsvis ligetil og nemt. Men en stabil puffer signalog en tilstrækkelig adskillelse af de makromolekylære arter fortsat vigtigt. Derfor er det afgørende at reservere tilstrækkelig tid til at ækvilibrere søjlen grundigt. Svigt af denne metode kan skyldes persistente forureninger af lignende størrelse til proteinet af interesse, lave koncentrationer, og strålingsfølsomme buffere.
I praksis indledningsvist, SEC-SAXS er forventes anvendt som den foretrukne metode til de fleste makromolekylære prøver. Stadig, mange oprensningsprotokoller kræve en forudgående IEC trin på grund af tilstedeværelsen af forurenende stoffer eller aggregering. I betragtning af, at hver koncentration og kromatografi trin er forbundet med tab af prøve (anslået til 30-50%) og tid, direkte IEC-SAXS er fordelagtig. For prøver, der ikke kan renses ved SEC, det være sig på grund af tilstedeværelsen af samme størrelse "forureninger", eller fordi de er alvorlig aggregat ved de nødvendige koncentrationer, ville IEC-SAXS altid være lige velegnet fremgangsmåde. Også, støttet de højere flowhastighederaf mange IEC kolonner kan bidrage til at reducere transittiden mellem rensning og måling. I eksemplet præsenteret her, blev IEC bruges med en trinvis eluering, hvilket giver mulighed for adskillelse af de tætte toppe af D5 323-785 fra kontaminanter ved omhyggeligt at vælge saltkoncentrationen trin. I princippet er antallet af trin er ubegrænset, men praktisk er mindst 1 trin pr peak påkrævet, og ikke for mange bør vælges. For baggrundssubtraktion beskrevet ovenfor, er det vigtigt at kunne måle et relativt stort antal af forskellige buffer-sammensætninger for at finde den matchende en.
En delt ulempe ved begge teknikker er manglen på præcise oplysninger proteinkoncentration. På grund af dette, præcis masse bestemmelse baseret på forward spredning er ikke mulig. For kugleformede proteiner såsom D5 323-785, den Porod volumen giver et alternativ, om end mindre præcise, masse skøn, men for meget fleksible eller uordnede proteinerVille denne fremgangsmåde ikke være gyldig.
En variation af den trinvise gradient IEC-SAXS metode præsenteres her er anvendelsen af en lineær gradient i stedet. Selv om det er muligt at arbejde med så mange trin, som ønskes at isolere sub-toppe under anvendelse af en trinvis eluering i lineær gradient tilgang, er det nødvendigt at optimere gradientbetingelserne omhyggeligt for at adskille toppene helt før start af SAXS eksperiment. Baggrund subtraktion i denne tilgang kunne gøres frame-klog og kunne verificeres ved en sammenligning af de enkelte frames, men det kræver mere avanceret data håndtering, og en dedikeret software findes ikke endnu.
Valget af en egnet kolonne er kritisk for begge teknikker, eftersom den måler adskillelsen af de makromolekylære arter. Størrelsesudelukkelses-kolonner forskellige i lasteevnen, størrelsesområdet adskillelige makromolekyler, og opløsning, mens ionbyttersøjler variere i form og densitetenaf deres immobiliserede afgifter.
Mens den protokol, der præsenteres her er specifik for ESRF beamline BM29, tilpasning til enhver anden SAXS beamline er i princippet ligetil. De vigtigste krav er en tilstrækkelig høj X-ray flux og en egnet detektor (ideelt enkelt-foton-tælling), at erhverve rimelige signal-til-støj-data i området fra sekunder eller mindre, og et online væskekromatografi system, der kan skabe gradienter. Den nøjagtige implementering vil naturligvis afhænge af den lokale beamline miljø.
De opnåede på D5 323-785 ved hjælp af de to metoder resultater afvige lidt. Den inertiradius er lidt mindre for IEC data end for SEC-data, og den lokale minima af spredningen kurven forskydes til lidt større sprednings- vektorer. Dette betyder, at D5 323-785 målt med IEC-SAXS er lidt mere kompakt end D5 323-785 målt med SEC-SAXS. Dette kan be på grund af forskelle i prøveforberedelse, i tiden mellem rensning og måling (IEC er hurtigere), eller, mindre sandsynligt, at et forurenende stof i SEC-renset prøve. Perlen modeller opnået helt uafhængigt med begge metoder er sammenlignelige (Figur 1 H). D5 323-785 viser den forventede hule, hexamere struktur 18.
Afslutningsvis online ionbytning og online gelpermeationskromatografi er vigtige biokemiske oprensningsmetoder, som kan kobles direkte til SAXS 6,7,9-12,25,26. Baggrunden fratrækning af IEC-SAXS data er lidt sværere og tvetydig end for SEC-SAXS, men det er ikke desto mindre muligt. Afhængigt af de biofysiske egenskaber af proteinet af interesse, både SEC og IEC-SAXS muliggøre optimering af separation arter med iboende fordele. Forudsat, at validering trin (som beskrevet) er korrekt observeret, kan de resulterende data analyseres with tillid, og modeller kan bestemmes ved hjælp af standard værktøjer til rådighed i samfundet. Sammen begge teknikker tillader online adskillelse for en bred vifte af biologiske makromolekyler, hvilket giver data ikke tilgængelige via standard statiske målinger.
The authors have nothing to disclose.
We acknowledge financial support for the project from the French grant REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 and by research grants from the Service de Santé des Armées and the Délégation Générale pour l’Armement. We are thankful to the ESRF for the SAXS beam time. We thank Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister, and Guy Schoehn for financial and scientific support.
1,4 dithiothreitol [DTT] | Euromedex | EU0006-B | |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gel | Biorad | 4561033 | |
2x Phusion Flash PCR Master Mix | ThermoFisher scientific | F 548 | |
acetic acid glacial | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20104.298 | |
Agarose D-5 | Euromedex | LF45130653 | |
Amicon Ultra -15 Centrifugal filters Ultracel -30K | Millipore Ltd | UFC903024 | |
Ampicillin sodium salt | Euromedex | EU0400-D | |
Benzonase | Novagene | 70750-3 | |
bromophenol blue | MERCK | 8122 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11231400 | |
Econo-Pac 10 DG Desalting column | Bio-rad | 732-2010 | |
EDTA | Sigma | E-5134 | |
Glycerol | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 24388.295 | |
Glycine | Euromedex | 26-128-6405-C | |
HindIII | Roche | 656313 | |
HisSelect HF Nickel Affinity Gel | Sigma | H0537 | |
Hydrochloric acid (HCl) | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 20252.295 | |
Imidazole | AppliChem Panreac | A1073,0500 | |
InstantBlue | Expedeon | ISB1L | |
LB broth Miller | Fluka Analytical | L3152 | |
MgCl2 | ICN Biomedicals Inc. | 191421 | |
NaCl | VWR Chemicals (BDH Prolabo) | 27808.297 | |
NcoI | Fermentas | ER0571 | |
One Shot BL21 Star (DE3) | ThermoFisher scientific | C6010-03 | |
pProEx HTb vector | Addgene | 10711018 | |
Primer | Eurofins mwg operon | ||
QIAprep Spin Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
QIAquick Gel extraction kit | QIAGEN | 28706 | |
QIAquick PCR purification kid | QIAGEN | 28106 | |
SDS | Sigma | 75746 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen life technology | S33102 | |
T4 ligase | ThermoFisher scientific | EL0011 | |
TEV | home made | ||
TOP 10 | Invitrogen life technology | C404003 | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Uno Q 1R column | Bio-rad | 720 0011 | |
β-mercaptoethanol | MPBiomedicals, LLC | 194834 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Softwares | |||
Beamline control software BsXCuBE | ESRF | Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664 | local development |
Camserver software | Dectris | n.a. | detector control software |
DAMAVER | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to align ab initio models |
DAMMIF | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | ab initio model reconstruction programm |
HPLC program Biologic Duo Flow | Bio-rad | ||
HPLC program LabSolutions | Shimadzu | n.a. | |
ISPyB | ESRF | De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85. | local development |
PRIMUS | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program, which performs the manipulation with experimental SAXS |
PyMOL | DeLano Scientific LLC | https://www.pymol.org/ | software for visualization. |
SUPCOMB | ATSAS 2.6.0 | http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html | program to superimpose 3D structures |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
BioLogic Duo Flow | Biorad | ||
BioLogic Biofrac Fraction collector | Biorad | ||
HPLC system | Shimadzu | ||
Labsonic P | Sartorius Stedim biotech | BBI8535108 |