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Medicine

3D quantitativa doi: 10.3791/54868 Published: December 26, 2016

Summary

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

Abstract

Neuroinflamação é agora reconhecido como um importante fator etiológico em doenças neurodegenerativas. fagócitos mononucleares são células imunitárias inatas responsáveis ​​pela fagocitose e remoção de escombros e detritos. Estas células incluem macrófagos residentes do SNC conhecidos como microglia e fagócitos mononucleares infiltrantes a partir da periferia. A microscopia de luz tem sido geralmente usado para visualizar a fagocitose em roedores ou espécimes do cérebro humano. No entanto, os métodos qualitativos não forneceram provas definitivas da fagocitose in vivo. Aqui, nós descrevemos 3D quantitativa na modelagem de silício (q3DISM), um método robusto para a verdadeira permitindo a quantificação de 3D-amilóide β (Ap) a fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD). O método envolve a fluorescência visualizando Ap encapsulado dentro phagolysosomes em seções roedor cerebrais. Grandes conjuntos de dados confocal z-dimensional são então reconstrução 3D para quantificação de A &# 946; colocalized espacialmente no interior do fagolisossoma. Nós de demonstrar a aplicação bem sucedida de q3DISM de ratinho e de rato cérebros, mas esta metodologia pode ser estendida para virtualmente qualquer modo fagocitária em qualquer tecido.

Introduction

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Doença de Alzheimer (AD), a demência relacionada com a idade mais comum 1, caracteriza-se pela acumulação de amilóide cerebral-β (Ap) como placas "senis" beta-amilóide, neuroinflama�o baixo nível crónica, taupatia, perda neuronal, e perturbação cognitiva dois . No AD cérebros de pacientes, neuroinflamação é destinada pelos astrócitos e fagócitos mononucleares reativa (referido como microglia, embora as suas centrais vs. origem periférica permanece obscuro) em torno depósitos Ap 3. Como as sentinelas imunes inatas do SNC, microglia são posicionados centralmente para limpar Ap cérebro. No entanto, o recrutamento da microglia para placas de Ap é acompanhada por muito pouco, se algum, fagocitose Ap 4,5. Uma hipótese é que microglia são inicialmente neuroprotetor por phagocytozing pequenas montagens de Ap. No entanto, eventualmente estas células se tornam neurotóxico como carga Ap esmagadora e / ou d funcional relacionada com a idadeecline, provoca microglia em um fenótipo pró-inflamatório disfuncional, contribuindo para a neurotoxicidade e declínio cognitivo 6.

Estudo de associação genômica ampla Recentes (GWAS) identificaram um conjunto de alelos de risco AD pertencentes ao núcleo vias imunitárias inatas 7 que modulam a fagocitose 8-11. Consequentemente, a resposta imune a deposição de amilóide cerebral tornou-se uma grande área de interesse, tanto em termos de compreender a etiologia AD e para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas 12-14. No entanto, existe uma necessidade vital para a metodologia para avaliar a fagocitose Ap in vivo. Para atender a essa necessidade não satisfeita, temos desenvolvido 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) para permitir uma verdadeira quantificação 3D da cerebral fagocitose Ap por fagócitos mononucleares em modelos de roedores de doença de Alzheimer-like.

Limitado apenas pelo grau em que a doença recapitular, os modelos animais têmcomprovada de valor inestimável para a compreensão AD pathoetiology e para avaliar terapêutica experimental. Devido ao facto de que as mutações nos genes presenilina (PS) e da Proteína Precursora Amilóide (APP) independentemente causar AD autossómica dominante, estes transgenes mutantes têm sido extensivamente usados ​​para gerar modelos de roedores transgénicos. Camundongos transgênicos APP / PS1 coexpress� simultaneamente "sueco" mutante APP humana (swe APP) e Δ exon 9 mutante presenilina 1 humano (PS1ΔE9) presente com amiloidose cerebral acelerada e neuroinflamação 15,16. Além disso, geramos ratos bi-transgénicos co-injectado com APP swe e construções PS1ΔE9 (linha TgF344-AD, em um fundo Fischer 344). Ao contrário de modelos de ratos transgênicos de amiloidose cerebral, ratos TgF344-AD desenvolver amilóide cerebral que antecede tauopathy, perda apoptótica de neurônios, e comprometimento comportamental 17.

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para immunostaining microglia, phagolysosomes e depósitos de Ap em seções do cérebro de ratinhos APP / PS1 e ratos TgF344-AD, e aquisição de imagens confocal grandes z-dimensional. Nós detalhe na geração e análise dos verdadeiros reconstruções 3D a partir de conjuntos de dados confocal permitindo a quantificação da captação de Ap em phagolysosomes microgliais silico. Mais amplamente, a metodologia que nós detalhes aqui pode ser usado para quantificar virtualmente qualquer forma de fagocitose in vivo.

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Protocol

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Declaração de ética em pesquisa: Todos os experimentos envolvendo animais detalhados aqui foram aprovados pela University of Southern California Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) e realizado em estrita conformidade com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e recomendações da Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório animal Care International.

1. Rodent isolamento Cérebro e Preparação para imunocoloração

DIA 1:

  1. Coloque ratos TgF344-AD com idade (14 meses de idade) ou APP ratos / PS1 (12 meses de idade), sob anestesia isoflurano profunda contínua (4%). Avaliar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé e ausência de reflexo de retirada.
  2. Cortar ambos os lados da caixa torácica e levante para expor o coração. Inserir uma agulha G 23 para o ventrículo esquerdo do coração e fazer uma pequena incisão no átrio direito. Continuar a exsanguinação por perfusão transcardial com soro fisiológico tamponado com fosfato arrefecido com gelo(PBS) utilizando uma bomba peristáltica (30 mL para ratos; 150-200 mL para ratos).
  3. Fazer uma incisão na linha média na pele caudal e mover a pele e músculo de lado. Cortar através da parte superior do crânio, ao longo da linha média e entre os olhos. Retirar as placas ósseas e isolar todo o cérebro do crânio.
  4. Coloque o cérebro em uma matriz de roedores cérebro coronal e cortá-lo em quartos. Incubar quartos posteriores S / N (16 h) no fixador de paraformaldeído (PFA a 4% em PBS) a 4 ° C. Lavar 3x em PBS, e depois transferir para 70% de etanol. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado.

DIA 2:

  1. Coloque trimestres cerebrais em cassetes de embebimento e progressivamente desidratar o tecido em banhos de etanol 1 h sucessivamente mais concentrada (70%, 80%, 95%, e 100% x3).
  2. Limpar o etanol a partir do tecido com três banhos sucessivos de xileno a 100% (1 h cada). Atenção: O xileno é tóxico e should ser tratadas sob um capuz químico com equipamento de protecção individual adequado.
  3. Incorporar tecidos em blocos de parafina depois de dois banhos de fundição de cera de parafina (56-58 ° C, 90 min cada).

DIA 3:

  1. Cortar 10 seções mm de espessura de cérebros embebidos em parafina usando um micrótomo. secções mergulhar em um banho de água (50 ° C durante 1 min) e aplicam-se a lâminas de microscópio. Deixar as lâminas secar S / N, garantindo adesão do tecido à lâmina.

2. A imunocoloração

Nota: Diferentes combinações de anticorpos pode ser utilizada para o procedimento de coloração descrito a seguir. Misturas de anticorpos compatíveis com tecido cerebral de ratos e murganhos são listados na Tabela 1.

DIA 4:

  1. Desparafinar secções cerebrais usando 2x 100% banhos de xileno (12 min cada).
  2. Rehidratar secções do cérebro em banhos sucessivos de etanol - 100% durante 10 min, 95% durante 5 min, 80% durante 10 min, e, finalmente, 70% durante 15 min - followed por lavagens PBS 3x [5 min à temperatura ambiente, com agitação luz]. Enquanto isso, o calor solução de recuperação de antígenos a 95-97 ° C em uma placa quente com agitação barra magnética.
  3. Incubar secções do cérebro em solução de recuperação de antigénio a 95-97 ° C durante 30 min. Em seguida, lavar 3x em PBS (5 min à temperatura ambiente, com agitação leve).
  4. Rapidamente lâminas secas usando limpadores tarefa delicada para evitar a secagem do tecido, e desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor da área do tecido com uma caneta barreira hidrofóbica. Encher o tecido região cercada com tampão de bloqueio [PBS contendo 0,3% de Triton X-100 e 10% de soro normal burro (NDS)], e incubar à temperatura ambiente durante 1 h numa câmara humidificada.
  5. Substituir tampão com anticorpo primário Iba1 (diluído em tampão de bloqueio) a rotular fagócitos mononucleares, e incubar O / N a 4 ° C numa câmara humidif içada de bloqueio. Para hosts de anticorpos e diluições de trabalho, consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais.

DIA 5:

  1. Rinseanticorpo primário com banhos 3x PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação leve). Incubar com anticorpo fluorescente secundário (conjugado com um fluoróforo de emissão 594 nm) durante 1 h (em tampão à TA no escuro bloqueio) seguido de banhos 3x com PBS (5 min à temperatura ambiente com agitação luz). Neste momento, manter secções no escuro para evitar branqueamento sinal fluorescente.

Dia 6 - 7:

  1. Repita os passos 2.5 e 2.6 com CD68 (cérebros de ratos) ou anticorpos LAMP1 (tecido mouse) e anticorpos secundários apropriados (juntamente com um fluoróforo emissão de 488 nm) para rotular phagolysosomes.

DIA 7-8:

  1. Repita os passos 2.5 e 2.6 com OC (tecido de rato) ou anticorpos 4G8 (cérebro do rato) e anticorpos secundários apropriados (acoplado a um fluoróforo 647 nm) para rotular depósitos de Ap.
    NOTA: Como alternativa, o anticorpo 6E10 pode ser utilizado com sucesso tanto em tecidos do rato e rato. Para combinações de anticorpos adequado, consulte a Tabela de Materiais
  2. Permitir seções completamente O seco / N à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, cobrir amostras com uma lamela selada por meios de montagem de fluorescência contendo DAPI.

3. Aquisição de grande Z-stack confocal conjuntos de dados

Nota: Este protocolo requer um rastreio por laser microscópio confocal totalmente automatizado equipado com uma objectiva 60X e 405 nm, 488 nm, 594 nm e 647 nm lasers. Todo o equipamento é controlado por computador pelo software de imagem e controle laser. Antes de iniciar o protocolo de imagem, ligue o computador, lâmpada de epifluorescência, microscópio, lasers e câmera.

DIA 9:

  1. Escolha a objetiva do microscópio 60X. Adicione o óleo de imersão para a lente, e colocar a amostra no suporte de microscópio estágio slide. Elevar o objetivo até que o óleo faz contato com o slide. Ajuste o plano focal para localizar placas amilóides no hipocampo ou córtex cerebral usando iluminação de epifluorescência através das oculares.
  2. Adquirir im confocalidades de fagócitos mononucleares ativadas circundantes depósitos de amilóide no hipocampo ou córtex de roedores por microscopia confocal (60X ampliação, passos z-stack: 0,25 mm <z <0,40 mm, número de etapas de 25 <n <35).

4. q3DISM

Nota: A fim de produzir resultados significativos, sugerimos analisar um mínimo de 3 imagens por animal / região de interesse. Para cada imagem, a abundância de células a analisar pode variar dependendo de paradigmas experimentais. Nos resultados representativos apresentados neste relatório, foram analisadas 3 células / condição (por exemplo, fagócitos mononucleares distantes ou associados com placas; ver Figuras 1C - D e 2C - D).

DIA 10:

  1. Analisar conjuntos de dados confocal com co-localização de processamento de imagem 3D científico e análise de software (Coloc) módulo de proximidade espacial de Iba1 / CD68 (tecido de rato) ou Iba1 / LAMP1 (tecido mouse) coloração em todos os z-aviões simultaneamente.Criar Iba + / CD68 + ou canais Iba + / LAMP1 + co-localização que correspondem a phagolysosomes dentro de fagócitos mononucleares ativadas.
    1. Escolha TRITC para o canal A (correspondente a coloração Iba1 acoplada com 594 nm fluoróforo) e FITC para o canal B (que corresponde a CD68 ou coloração LAMP1 acoplada com 488 nm fluoróforo). No lado direito da janela do software para 'verificação modo,' selecionar 'limite' e por 'intensidades COLOC,' selecionar 'canais de origem'.
    2. Clique em "Editar" para selecionar "cor Coloc 'no lado direito da janela do software.
    3. Para cada canal de forma independente, ajustar os limites para incluir coloração específica e não incluem sinais de fundo / não-específicos. Uma vez ajustado, não altere os limites entre as imagens para garantir uma análise imparcial. Os voxels colocalized (pixels de todos os z-stacks) será exibido na cor selecionada na etapa 4.1.2 em todas as z-stacks SIMultaneously.
    4. Clique em 'construir canal Coloc'. O canal de co-localização criado aparecerá na janela de ajuste de display.
    5. Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A "% de volume de material / A acima limiar colocalized '% representa o sinal de Iba1 (voxels correspondentes ao fluoróforo 594 nm) co-localizada com LAMP1 ou sinal de CD68 (voxels correspondentes ao fluoróforo 488 nm). Mais simplesmente, este é o volume ocupado pelos monócitos fagolisossomas (ver Figuras 1C e 2C).
      NOTA: '% do volume de material / B acima do limiar colocalized' corresponde a% de sinal LAMP1 ou CD68 colocalized com Iba1. Isto deve ser próximo de 100%, como fagolisossomas são estruturas intracelulares. Os valores são baseados na proporção de sinal de todos os z-stacks acima do limiar colocalized.
  2. Usando o módulo Coloc, analisar o canal Coloc criado na etapa 4.1 para proximidade espacial com OC (ti ratossue) ou 4G8 (tecido mouse) sinais de Ap. Isto permite a quantificação de Ap encapsulado dentro de fagolisossomas.
    1. Seleccionar o canal Um conjunto de dados Coloc (correspondente ao Iba1 / CD68 ou Iba1 / LAMP1 Coloc canal criado no passo 4.1) e Cy5 para o canal B (que corresponde a coloração ou OC 4G8 acoplada com 647 nm fluoróforo).
    2. Construir um canal Coloc como descrito nos passos 4.1.2 a 4.1.5.
    3. Clique no canal Coloc para abrir estatísticas de canal. A "% de volume de material / A acima limiar colocalized 'representa a% de Iba1 / ou LAMP1 Iba1 / CD68 (voxels correspondente ao canal Coloc construído no passo 4.1.5.) Co-localizada com CO ou sinal 4G8 (voxels correspondente ao 647 fluoróforo nm). Este é o volume ocupado por fagolisoss�ico Ap (ver Figuras 1D e 2D).
      NOTA: '% do volume de material / B acima do limiar colocalized' corresponde a% de sinal de Ap total de colocalized com phagolysosomes.Isto pode ser usado para avaliar a fracção do total dos depósitos de Ap encapsulados dentro de fagolisossomas (não mostrado nos presentes resultados representativos).
  3. Use o módulo superar para reconstruir as pilhas de imagens confocal e gerar modelos 3D de Ap encapsulados dentro phagolysosomes monócitos.
    1. Na janela "ajuste display ', selecione TRITC (para mostrar coloração única Iba1). Na janela "Propriedades de volume", clique em "adicionar nova superfície".
    2. No passo '1/5 algoritmo', em 'Configurações', selecione 'superfície'. Além disso, em 'cor', selecione o tipo de cor na paleta ou RGB e ajustar a transparência (vermelho é de transparência de 60% nas Figuras 1B e 2B). a caixa de seleção "selecionar a região de interesse". Clique ao lado.
    3. No Passo '2/5 região de interesse, "desenhar uma janela em torno da célula de interesse, ajustando X, Y e Z coordenadas (ver caixas brancas nas Figuras 1A 2A). Clique ao lado.
    4. No Passo '3/5 canal de origem ", selecione o canal de origem TRITC. Marque a caixa "suave", e definir o nível de detalhe área de superfície a 0,4 mm. Para "limiar", selecione intensidade absoluta. Clique ao lado.
    5. Na Etapa '4/5 limiar,' ajustar o limiar de forma que o volume criado sobrepõe-se perfeitamente com o sinal de canal TRITC. Clique ao lado.
    6. No Passo '5/5 classificar superfícies ", na seção" tipo de filtro ", selecionar objetos dependendo do seu tamanho para ser incluído ou excluído dos volumes a serem criados. Clique em Concluir, executar todas as etapas de criação, e sair do assistente.
    7. Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal FITC (LAMP1 + ou CD68 + fagolisossomas).
    8. Repita os passos 4.3.1 a 4.3.6 para criar uma superfície 3D para o canal Cy5 (depósitos 4G8 + Ap OC + ou).

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Representative Results

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Utilizando a metodologia multi-fase para q3DISM detalhado acima, que são capazes de quantificar a absorção de Ap em fagolisossomas monócitos nos cérebros de murganhos APP / PS1 (Figura 1) e ratos TgF344-AD (Figura 2). Portanto, a metodologia q3DISM permitiu a análise de fagócitos mononucleares em ratinhos e ratos modelos da doença de Alzheimer. Curiosamente, o volume ocupado pelo CD68 + fagolisossomas é aumentado significativamente em fagócitos mononucleares Iba1 + associados com comparação com distante de placas, tanto em ratos TgF344-AD (Figura 2B, C) de APP / PS1 ratinhos (Figura 1B, C) e. Estes dados mostram que os fagócitos mononucleares próximos placas estão prontas para a fagocitose em comparação com células localizadas longe da placa. A fim de ilustrar a gama de dados de coloração diferentes confórmeros Aâ, utilizou-se vários anticorpos de rato e de tecidos de rato (detalhado na Table 1 e discussão) - não estamos a tentar comparar diretamente ratos e de camundongos modelos de AD com relação ao Ap fagocitose. No entanto, foi notável que a placa associada fagócitos mononucleares havia aumento da captação de Ap em murganhos APP / PS1 em comparação com células distantes de placas (Figura 1D). Ratos TgF344-AD tinha absorção muito modesto de fibrilas de Ap total, e nenhuma alteração em Ap fibrila fagocitose como uma função da distância a partir de placas (Figura 2D).

tabela 1
Tabela 1: A imunocoloração fagócitos mononucleares, fagolisossomos e amilóide-β no tecido cerebral de ratos APP / PS1 ou ratos TgF344-AD. Rato ou o ratinho cocktails de anticorpos específicos são listados com seus respectivos acolhimento entre parênteses. As cores indicam o fluoróforo utilizado para o anticorpo secundário. Vermelho: Alexa Fluor 594; verde: Alexa Fluor 488;magenta: Alexa Fluor 647.

figura 1
Figura 1: Visualização e quantificação de amilóide-β fagocitose em Brains APP / PS1 mouse. (A) imagens confocal de seções do cérebro de um / camundongo PS1 APP mostrando Iba1 células + (vermelho), LAMP1 + phagolysosomes (verde) e 4G8 + depósitos amilóides (magenta). Inserir uma destaca um fagócito mononuclear distante da placa, enquanto a margem interna 2 mostra um fagócito mononuclear associado com a placa. A barra de escala indica 50 um. Painéis menores à direita são alargamentos da Iba1, LAMP1 e 4G8 sinais dentro inserções 1 e reconstrução 2. (B) 3D de Iba1, LAMP1 e sinais 4G8 para inserções 1 e 2. A barra de escala indica 3 mm. (C) Quantificação do Iba1 + volume de fagócito mononuclear ocupada por LAMP1 + phagolysosomes. ( + fagolisoss�ico de volume intracelular ocupada por 4G8 + Ap. Os valores são baseados na proporção de sinal (voxels) acima do limiar que são colocalized. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 células) para os fagócitos mononucleares distantes de placas (1), ou associada com placas (2). ** P <0,01 pelo teste t de estudante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Visualização e quantificação de amilóide-β fagocitose em cérebros de ratos TgF344-AD. (A) imagens confocal de seções do cérebro de um rato TgF344-AD mostrando células Iba1 + (vermelho), CD68 + phagolysosomes (verde), e OC + fibrilar solúvel A & # 946; (magenta). Inserir uma destaca um fagócito mononuclear distante da placa, enquanto a margem interna 2 mostra um fagócito mononuclear associado com a placa. A barra de escala indica 50 um. Painéis menores à direita são alargamentos da Iba1, CD68 e sinais OC dentro inserções 1 e 2. (B) reconstrução 3D de Iba1, CD68 e sinais de OC para inserções 1 e 2. A barra de escala indica 3 mm. (C) Quantificação do Iba1 + volume de fagócito mononuclear ocupada por phagolysosomes CD68 +. (D) A determinação quantitativa de CD68 + fagolisoss�ico de volume intracelular ocupada por OC + Ap. Os valores são baseados na proporção de sinal (voxels) acima do limiar que são colocalized. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 células) para os fagócitos mononucleares distantes de placas (1), ou associada com placas (2). ** P <0,01 pelo teste t de estudante.rge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo que descrevemos neste relatório para a verdadeira quantificação 3D de Ap fagocitose in vivo pelos fagócitos mononucleares depende de rotulagem específica dos compartimentos celulares e subcelulares, bem como depósitos de Ap. Especificamente, usamos Iba1 (ionizada-se ligar à molécula de cálcio Adaptador 1), uma proteína que está envolvida em membrana ruffling e fagocitose por activação de célula 18, 19, para corar os fagócitos mononucleares cerebrais. Enquanto as células Iba1 + são geralmente considerados como microglia cerebral residente, continua a ser possível que perifericamente fagócitos mononucleares infiltrantes compreender um subconjunto de células imunomarcadas. Phagolysosomes intracelulares são reveladas com anticorpos que reconhecem membros da família Lisossomal / glicoproteína de membrana associada à endossomal (LAMP): LAMP1 20 ou CD68 21. Este último está localizada principalmente para os lisossomas e dos endossomas, com uma fracção menor que circula à s célulasseu rosto. Anticorpos LAMP1 e CD68 têm ambos sido utilizado com sucesso no tecido de rato e rato, ea decisão sobre qual usar é principalmente dependente do acolhimento de outros anticorpos utilizados para co-coloração (ver Tabela 1). É importante ter consciência de que vários anticorpos podem ser utilizados para a detecção de Ap. Em tecidos de rato, 4G8 (reconhecendo os resíduos de aminoácidos de rato humanos e 17-24 de péptido Ap 22, Figura 1) e 6E10 (reconhecendo os resíduos de aminoácidos humana 1-17 23, dados não mostrados) foram usados com sucesso, permitindo a detecção e quantificação do conteúdo de Ap no LAMP1 + ou CD68 + phagolysosomes presentes em fagócitos mononucleares Iba1 +. Usando nossa metodologia q3DISM, observou-se aumento da carga de Ap em células Iba1 + associados à redução global de carga Aâ em cérebros de APPPS1 / IL-10 - / - ratos 16, enquanto outros mostraram redução da captação de Ap em Iba1 + < / sup> células acompanhados por aumento de carga e placa de volume de Ap em cérebros de Rag-5xfAD ratos 24. Estes resultados sugerem que o fenómeno observado é um "instantâneo" de fagocitose Ap activo, embora o nosso método não pode ser utilizado para prever se o material fagocitado é digerido de forma eficiente e limpa.

Em tecidos de rato, foi detectada utilizando depósitos de Ap OC (reconhecendo solúveis Ap 42 oligómeros / fibrilas 25,26, Figura 2) ou 6E10 17 (não mostrado). Curiosamente, muito pouco OC + fibrilas estavam presentes em phagolysosomes monócitos em cérebros de ratos TgF344-AD. Esse fenômeno tem sido relatado anteriormente em ratinhos transgénicos APP23 usando coloração imuno e reconstrução 3D 27. Nota: uma variedade de anticorpos para a detecção de diferentes espécies de Ap / confórmeros estão disponíveis e podem potencialmente ser testados e utilizados à discrição do utilizador.

nt "> A nossa técnica q3DISM foi adoptada por nós e outros para quantificar Ap fagocitose no contexto da AD 16,24,28. No entanto, o método pode ser adaptado para avaliar virtualmente qualquer forma de fagocitose. Também pode ser aplicada a tecidos diferente do cérebro, e para outras espécies animais (incluindo seres humanos). os procedimentos descritos neste protocolo dependem de imunomarcação padrão, detectado com fluorescência e fotografada com um microscópio confocal. neste relatório, utilizou-se o tecido embebido em parafina de acordo com as directrizes fornecida pelos fabricantes de anticorpo. Se desejado, o protocolo pode também ser optimizada para o tecido fresco (incorporado em 2% de agarose em PBS). o protocolo também pode ser optimizado para detectar a fagocitose de coaggregating proteínas. Isto é tornado possível através da coloração e adquirir imagens composto por mais de 4 cores fluorescentes 29. neste caso, a criação do primeiro canal de colocalização (monócitos / fagolisossomo) seria seguido por criaçãode um segundo canal de co-localização (agregados de proteína 1 / co-agregados de proteína 2). Em seguida, os dois canais seria utilizada para a análise e modelagem 3D.

A técnica q3DISM é limitada principalmente pela especificidade e sensibilidade da imunocoloração, a qualidade de anticorpos, e uma co-localização abordagem. Este procedimento de passos múltiplos tem alguns potenciais problemas que podem afectar a qualidade da coloração e, por conseguinte, a quantificação de Ap 3D de absorção. O primeiro passo crucial do processo é o isolamento de cérebros de roedores. Com efeito, a manipulação cuidadosa de tecidos é fundamental para evitar danos no cérebro e para garantir que as estruturas cerebrais permanecer intacta quando segmentado. Em segundo lugar, o tempo de fixação do tecido é muito importante uma vez que o excesso de fixação (mais de 16 h em 4% PFA) limita a detecção de phagolysosomes subcelulares e conteúdo de Ap. Importante, a coloração sucessivas de 1), 2) monócitos fagolisossomas e 3) Ap é crítico para o sucesso do método. É Essential para utilizar os anticorpos não consecutively- concomitantemente. Além disso, a aquisição das imagens confocais Z-pilha é da maior importância, uma vez que a modelagem 3D de células, e fagolisossomas péptido Ap, bem como co-localização analisa dependem da qualidade da imagiologia de estruturas celulares e subcelulares através da espessura da secção de tecido. Finalmente, o ajuste de limiares no software é crucial para a modelagem 3D e para a análise de co-localização. Com efeito, os limiares para os diferentes canais necessitam de ser cuidadosamente escolhido, uma vez que irá determinar qual o sinal é incluído (específico) ou excluídos (fundo) a partir da análise. É também fundamental que os limiares escolhidos permanecem consistentes entre amostras no caso de a comparação de diferentes animais / espécimes. Até agora, immunohistostaining clássica, tomografia de ressonância e de emissão de positrões magnética têm sido os métodos de imagem de escolha para visualização in vivo e quantificação de Ap30. Embora altamente útil para a quantificação em grande escala de carga amilóide nos cérebros de roedores ou de pacientes com AD, estes métodos são ineficientes para a visualização de Ap intracelular. Outras técnicas usando microscopia confocal, espectroscopia de fluorescência e citometria de fluxo existem e têm sido utilizados por nós e outros para discriminar e quantificar o conteúdo de Ap intracelular in vitro 16,31,32. Coloração imuno juntamente com reconstrução 3D foi usado anteriormente para destacar a ausência de fibrilas amilóides dentro microglia in vivo em APP23 camundongos transgênicos 27, e outro estudo utilizado com sucesso confocal de imagem e 3D reconstrução da superfície da microglia associada com placas de beta-amilóide para mostrar Ap limitada interação e absorção 33. No entanto, estas técnicas não permitem a quantificação da intra-fagolisoss�ico espécies de Ap. Outros têm desenvolvido recentemente um fluorescência baseado no ensaio in vivo, permitindo a mediçãoda atividade fagocítica pelos macrófagos periféricos em ratos 34. Este método permite que engenhosamente para quantificação de bioprobes fluorescentes em fagolisossomas in vivo, no entanto, os dados disponíveis até agora estão limitados a periferia.

Para nosso conhecimento, q3DISM é o primeiro método que permite a visualização 3D e quantificação de Ap fagocitose nos cérebros de roedores modelos AD. Esta ferramenta formidável, sem dúvida, abrir o caminho para uma compreensão mais profunda cerebral fagocitose Aâ, e também pode ser útil em outros contextos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Abbott NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors VWR 82027-582
Dissecting scissors Blunt tip VWR 82027-588
Tweezers VWR 94024-408
23 G needle VWR BD305145
peristaltic pump FH10 Thermo Scientific 72-310-010
PBS 10x Bioland Scientific PBS01-02 Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm  Kent Scientific RBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA) EMS 15714-S Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol VWR 89125-188 Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura VWR 25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin VWR 15147-839
Microtome Leica RM2125 Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades  VWR 25608-964
Water bath Leica HI 1210 Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus VWR 48311-703
Xylene Sigma-Aldrich 534056-4X4L Caution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10x DAKO S1699 Working concentration 1x
KimWipes VWR 21905-026
Hydrophobic PAP pen VWR 95025-252
Triton X-100 VWR 97062-208
Normal Donkey Serum (NDS) Jackson Immuno 017-000-121
Coverslips VWR 48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI Life Technologies P36935
Glass Slide Rack VWR 100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit) Wako 019-19741  Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat) LifeSpan Bioscience LS-B2645 Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse) Abcam ab955 Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat) Abcam ab53444 Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat) Affymetrix 14-1071 Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39220 Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse) Covance SIG-39320 Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit) Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine) Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody Invitrogen A-11001 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody Invitrogen A-11006 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody Invitrogen A-11037 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody Invitrogen A-11080 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody Invitrogen A-21235 Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody Invitrogen A-21443 Working concentration 1:1,000
Immersion oil Nikon 
A1 Confocal microscope Nikon 
NIS Elements Advanced Research software Nikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6 Bitplane "coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

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References

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3D quantitativa<em&gt; In Silico</em&gt; Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer
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Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).More

Guillot-Sestier, M. V., Weitz, T. M., Town, T. Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (118), e54868, doi:10.3791/54868 (2016).

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