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डुबकी बर्फ़ीली: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में निलंबन कोशिकाओं के Ultrastructural और Immunolocalization अध्ययन के लिए एक उपकरण

Published: May 5, 2017 doi: 10.3791/54874
Automatic Translation
1, 1
1Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires, Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5095, Université de Bordeaux

Summary

यह पांडुलिपि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निलंबन कोशिकाओं दृश्यमान करने के लिए एक और उपयोग में आसान-कम लागत वाली cryofixation विधि का वर्णन है।

Abstract

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) सेल अल्ट्राक्चर का अध्ययन करने के लिए एक असाधारण उपकरण है, ताकि प्रोटीन को स्थानांतरित किया जा सके और बहुत उच्च संकल्प पर मैक्रोमोलेकुलर कॉम्प्लेक्स का अनुमान लगाया जा सके। हालांकि, देशी राज्य के लिए जितना करीब हो सके, सही नमूना संरक्षण आवश्यक है। उदाहरण के लिए, एल्डिहाइड के साथ परंपरागत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) निर्धारण, अच्छा अल्टरस्ट्रक्चर संरक्षण प्रदान नहीं करता है। फिक्सिस्टिक्स के धीमे गति से सेल पुनर्गठन और विभिन्न सेल घटकों के नुकसान को प्रेरित करता है। इसलिए, पारंपरिक ईएम निर्धारण एक तात्कालिक स्थिरीकरण और संरचनाओं और प्रतिजन के संरक्षण की अनुमति नहीं देता है। इंट्रासेल्युलर घटनाओं की जांच करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प रिक्ति-प्रतिस्थापन निर्धारण पद्धति के बाद क्रिस्टीशन का उपयोग करना है जो अपने मूल अवस्था में कोशिकाओं को रखता है। उच्च दबाव ठंड / फ्रीज-प्रतिस्थापन, जो सेलुलर मूलभूत संरचना की अखंडता को सुरक्षित रखता है, यह सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है, लेकिन इसकी आवश्यकता हैउपकरण किया है। यहाँ एक और उपयोग में आसान-कम लागत वाली फ्रीज निर्धारण विधि निलंबन कोशिका संवर्धन के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन के बाद प्रस्तुत किया है।

Introduction

किसी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन की सफलता के लिए नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) 1 के लिए ऊतक या कोशिकाओं को फिक्स करने के लिए पारंपरिक ईएम निर्धारण प्राथमिक विधि था। सबसे पहले, एल्डिहाइड और ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग कमरे के तापमान पर रासायनिक पदार्थों को ठीक करने के लिए किया जाता है। फिर, सामग्री कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ निर्जलित है, घुसपैठ, और एपॉक्सी राल में एम्बेडेड है। यह विधि सेल में फिक्सिव्स के प्रवेश दर पर निर्भर है। नतीजतन, सेल्युलर सामग्री की कलाकृतियों और निष्कर्षण आमतौर पर 2 देखे जाते हैं।

सेलुलर संरचनाओं के संरक्षण के लिए स्पष्ट रूप से एक बेहतर विकल्प 3 , उन्हें बरकरार रखना Cryomyation / फ्रीज प्रतिस्थापन विधि का उपयोग करके पतली राल खंडों में मंदिरों की उच्चतम गुणवत्ता 4 प्राप्त की जा सकती है। इस तकनीक का उद्देश्य वर्थिफाइड द्वि प्राप्त करना हैबर्फ के क्रिस्टल गठन या युक्त बर्फ के क्रिस्टल काफी छोटा कोशिकाओं के फैटी नुकसान न बिना ological नमूने हैं। उच्च दबाव ठंड (HPF) और अति तीव्र cryofixation है, जो भी ठंड (पीएफ) डुबकी कहा जाता है, नमूने cryofix करने के लिए दो तरीके हैं। HPF तत्क्षण सेल में अणुओं immobilizes और पारंपरिक ईएम निर्धारण के कारण नुकसान से बचा जाता है। ठंड मशीनों और स्वत: प्रतिस्थापन उपकरणों के कई प्रकार विकसित किया गया है 5। ठंड मशीनों और उपभोज्य (तरल नाइट्रोजन, वाहक नमूना आदि) महंगे हैं, लेकिन वे उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन micrographs 6, 7 के उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं। पीएफ एक तकनीक है कि 1950 के दशक में इस्तेमाल किया गया था और के रूप में सरल और सस्ते 8 पीएफ प्रक्रिया के दौरान, तैयार नमूना एक तेजी से दर पर जमे हुए है प्राप्त करने के लिए बर्फ के क्रिस्टल कम से कम 3 से 5 एनएम आकार साहित्य में वर्णित किया गया है। इस उद्देश्य के लिए नमूना हैएक तरल cryogen में कूद गया, जैसे कि ईथेन, प्रोपेन, या एथेन-प्रोपेन मिश्रण। 1 9 50 के दशक से, इस तकनीक को उपयोगकर्ताओं की एक बड़ी संख्या में उपलब्ध कराने के लिए पीएफ के सुधार किए गए हैं। उच्च दबाव ठंड वर्तमान में केवल 50 माइक्रोन (डिस्क आकार के नमूनों के लिए 200 माइक्रोन की मोटाई तक) की तुलना में अधिक मोटी नमूनों की एक विशाल विविधता को फ्रीज करने का एकमात्र व्यवहार्य तरीका है, जबकि पीएफ व्यापक रूप से छवि छोटी वस्तुओं (<100 एनएम ), जैसे मैक्रोमोलेकुलर कॉम्प्लेक्स को अनाकार की 9 पतली फिल्म में निलंबित कर दिया गया उदाहरण के लिए बड़े नमूने, यूकेरियोटिक कोशिकाओं को पीएफ द्वारा रोशन किया जा सकता है, लेकिन नमूना धारकों की आवश्यकता होती है, जैसे केशिका तांबे ट्यूब या सैंडविच सिस्टम 8 , 10 , 11 ।

यहां, विभिन्न निलंबन सेल संस्कृतियों के लिए एक तेज़, आसान उपयोग और कम लागत वाली डुबकी फ्रीजिंग / फ़्रीज-प्रतिस्थापन तकनीक का उपयोग किया जाता है।

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Protocol

1. फॉर्मवर ग्रिड फिल्म की तैयारी

नोट: निजी सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, चश्मा) का उपयोग कर एक धूआं हुड के तहत क्लोरोफॉर्म हेरफेर करें। 400 मेष इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तांबा ग्रिड का उपयोग करें। अन्य ग्रिड प्रकारों (अन्य मेष आकार, सोना और निकेल ग्रिड) के साथ, ठंड की गुणवत्ता खराब है।

  1. क्लोरोफॉर्म में 0.3% formvar के 100 एमएल समाधान तैयार करें। आंदोलन के बिना रातोंरात भंग करने की अनुमति दें
  2. एक ग्लास शीशी (ऊंचाई 3 सेंटीमीटर और व्यास 2 सेमी) में 400 मेष (प्रति वर्ग इंच छेद की संख्या) इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपीकोपर ग्रिड (व्यास 3.05 मिमी) रखें जो एसीटोन युक्त है। हाथ की एक परिपत्र आंदोलन के साथ गिलास शीशी हिलाओ। एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ एसीटोन निकालें। विलायक 5 मिनट के लिए लुप्त हो जाना उन्हें एक फिल्टर पेपर पर डालने से ग्रिड ट्रांसफ़र करें और उन्हें 5 मिनट तक सूखने दें।
  3. चमकदार / फिसलन तक एक लिंट-फ्री क्लॉथ के साथ इसे पोंछते हुए एक 76 x 26 मिमी 2 ग्लास स्लाइड पोलिश करें।
  4. एक क्रिस्टलाइज़र (व्यास 15 सेंटीमीटर, ऊंचाई: 7 सेंटीमीटर और क्षमता 1200 एमएल) लो और डिस्टिल्ड वॉटर के साथ कबाड़ में भरें। धूल से हटाने के लिए दो बार सतह पर एक ग्लास बार गुजरने से पानी की सतह को साफ करें।
  5. दो उंगलियों के बीच कांच की स्लाइड को पकड़ो और इसे कुछ सेकंड के लिए formvar समाधान में डुबकी। इसे 5 मिनट के लिए ऊपर की ओर वाली बीकर के नीचे सूखा करने के लिए इसे ठीक से रखें
  6. जब फिल्म सूखी है, स्लाइड से उखाड़ने के लिए फिल्म की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए एक तीव्र रेजर ब्लेड के साथ कांच स्लाइड के किनारों को स्कोर करें।
  7. फिल्म को थोड़ा अपारदर्शी रेंडर करने और उसकी दृश्यता बढ़ाने के लिए फिल्म के नीचे और नीचे पानी की वाष्प की परत पाने के लिए एक गहरी साँस लें और स्लाइड पर भारी साँस लें।
    1. लगभग 30 डिग्री के कोण के साथ स्लाइड के निचले भाग को छूकर क्रिस्टलीय पानी की सतह पर तुरंत फिल्म चलाएं। फिल्म को स्लाइड से रिलीज करने दें और इसे क्रिस्टलीटर पानी की सतह पर छील दें। धीमी गति से इस फिल्म को खींचेंचिमटी, यदि आवश्यक हो।
  8. धीरे रखना ग्रिड फिल्म क्षेत्रों कि उचित मोटाई (लगभग 10 एनएम) और झुर्रियों के बिना कर रहे हैं में पानी की सतह पर तैरते पर नीचे का सामना।
  9. के रूप में वे Crystallizer पानी की सतह पर तैरने लगते हैं यूसुफ कागज के साथ ग्रिड को कवर करके फिल्म उठाओ।
    1. एक हाथ से पकड़े यूसुफ कागज, फिल्म के एक छोर को यूसुफ कागज के एक छोर स्पर्श करें। तक प्रतीक्षा करें यूसुफ कागज पूरी तरह से गीला है। ग्रिड पर अटक के साथ यूसुफ कागज निकालें।
  10. अंतिम सुखाने और भंडारण कमरे के तापमान पर उपयोग करने से पहले के लिए एक कवर पेट्री डिश में 24 घंटे के लिए ग्रिड रखें।

2. फ्रीज-प्रतिस्थापन माध्यम की तैयारी

नोट: आज़मियम tetroxide (Oso 4) और uranyl एसीटेट खतरनाक रसायनों हैं। उन्हें धूआं हुड में संभाल जबकि उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने सहित पहने। follसे निपटने के लिए सुरक्षा चेतावनी (Oso 4) और uranyl एसीटेट ओउ। ओ-रिंग cryovials का प्रयोग करें Oso 4 के रिसाव से बचने के लिए।

  1. ultrastructural पढ़ाई
    1. एक गिलास फ्लास्क में रखो कांच Oso 4 इंजेक्शन की शीशी।
    2. कुप्पी मिलाने से इंजेक्शन की शीशी तोड़।
    3. एसीटोन की एक उचित मात्रा एक 4% अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़े 100%।
    4. हलचल और 1.8 एमएल cryovials में 1.5 एमएल aliquots बांटना।
  2. प्रोटीन immunolabeling
    1. uranyl एसीटेट की 0.05 ग्राम एक गिलास फ्लास्क में रखें।
    2. 100% एसीटोन के 50 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ समाधान हलचल। समाधान स्पष्ट हो जाता है, एक 0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर का उपयोग कर यह फ़िल्टर करें।
    4. बांटना 1.8 एमएल cryovials में 1.5 एमएल aliquots।
      नोट: डुबकी ठंड प्रक्रिया के पहले फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम युक्त cryovials तैयार करें और उन्हें -84 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखने के लिए। कांच फ्लास्क को उलटने फेंकखतरनाक कचरे में Oso 4 इंजेक्शन की शीशी।

3. कोशिकाओं की तैयारी

ध्यान दें: यह कदम विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं के संकेत दिया संख्या प्राप्त करने की कोशिकाओं को बढ़ने। निर्धारित समय और गति से संकेत ट्यूब में अपकेंद्रित्र।

  1. इस प्रकार विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से छर्रों के उचित स्थिरता प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को बढ़ने:
    1. Saccharomyces cerevisiae और Schizosaccharomyces pombe के लिए, कम से कम या पूरा तरल माध्यम के 5 एमएल में खमीर टीका। 28 डिग्री सेल्सियस, घूर्णन (180 आरपीएम) पर रात में सेते हैं। उपाय रातोंरात संस्कृति के 600 एनएम (ओवर ड्राफ्ट 600) पर ऑप्टिकल घनत्व। 0.2 50 मिलीलीटर में ताजा चयनात्मक माध्यम के एक आयुध डिपो 600 खमीर कोशिकाओं पतला। 28 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं करने के लिए, घूर्णन, 1 x 10 9 खमीर कोशिकाओं 7 प्राप्त करने के लिए जारी रखें।
    2. लीशमैनिया कशाभिका के लिए, inoसाथ 7.5% FCS (भ्रूण बछड़ा सीरम) 5 एमएल AM के माध्यम में culate परजीवी। 24 डिग्री सेल्सियस, घूर्णन (180 आरपीएम) पर रात में सेते हैं। रात भर संस्कृति के आयुध डिपो 600 का आकलन करें। 0.2 50 मिलीलीटर में ताजा चयनात्मक माध्यम के एक आयुध डिपो 600 परजीवी कोशिकाओं पतला। 24 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं करने के लिए, घूर्णन, 5 x 10 8 परजीवी कोशिकाओं 12 प्राप्त करने के लिए जारी रखें।
    3. ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी के लिए, 10% FCS 30 माइक्रोग्राम / एमएल hygromycin साथ एसडीएम-79 के माध्यम के 5 एमएल में परजीवी टीका। 27 डिग्री सेल्सियस, घूर्णन (180 आरपीएम) पर रात में सेते हैं। रात भर संस्कृति के आयुध डिपो 600 का आकलन करें। 50 एमएल ताजा चयनात्मक माध्यम में 0.2 की एक आयुध डिपो 600 परजीवी कोशिकाओं पतला। 27 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं करने के लिए, घूर्णन, 5 x 10 8 परजीवी कोशिकाओं 13 प्राप्त करने के लिए जारी रखें।
    4. कोलाई के लिए, 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन साथ DYT माध्यम के 5 मिलीलीटर में बैक्टीरिया टीका। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं, घूर्णन (180आरपीएम)। रात भर संस्कृति के आयुध डिपो 600 का आकलन करें। 0.2 50 मिलीलीटर में ताजा चयनात्मक माध्यम के एक आयुध डिपो 600 बैक्टीरिया कोशिकाओं पतला। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं करने के लिए, घूर्णन, 5 x 10 10 बैक्टीरिया कोशिकाओं 14 प्राप्त करने के लिए जारी रखें।
      नोट: रातोंरात ऊष्मायन के बाद, संस्कृति में कोशिकाओं या तो लघुगणक या स्थिर विकास के चरण में हो सकता है। के रूप में अनुभव निर्धारित बहुत धीमी गति से बढ़नेवाले सेल उपभेदों, ऊष्मायन बार एक रात, या कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का टीका से अधिक समय की आवश्यकता हो सकती।
  2. सभी कोशिकाओं प्रकारों के लिए, पर 1500 x जी 3 मिनट के लिए 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए संस्कृति कोशिकाओं से युक्त मध्यम हस्तांतरण।
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रासंगिक सेल संस्कृति माध्यम के 1 मिलीलीटर में सभी प्रकार की कोशिकाओं की गोली resuspend।
  4. अपकेंद्रित्र में 3,900 एक्स जी 1 मिनट के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में सभी प्रकार की कोशिकाओं। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटाने।
  5. बर्फ पर कोशिकाओं रखें।

नोट: देखभाल के साथ तरल नाइट्रोजन को संभालना क्राउग्लेव्स और गुगल्स सहित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें प्रोपेन संभावित रूप से विस्फोटक है, इसलिए एक अच्छी तरह हवादार कमरे में या एक धूआं हुड के नीचे द्रवीकरण करें। कोई खुली आग की अनुमति नहीं है

  1. एक polystyrene ट्रे में लगभग 150 एमएल तरल नाइट्रोजन रखें। तरल नाइट्रोजन में एक ब्रास कप (ऊंचाई 3.6 सेमी, व्यास 2 सेमी और मोटाई 1.5 मिमी) रखें, उसे ठंडा करना। तरल नाइट्रोजन पीतल के कप में घुसना मत देना।
  2. बुलबुले कम होने तक प्रतीक्षा करें कि ब्रास कप जमे हुए हों।
  3. पीतल कप दीवार के संपर्क में प्रोपेन सिलेंडर से जुड़े नली रखो।
  4. धीरे प्रोपेन सिलेंडर वाल्व खोलें।
    नोट: इस कदम पर, पीतल के कप में प्रोपेन द्रवीकरण होता है।
  5. प्रोपेन सिलेंडर वाल्व बंद करके द्रवीकरण को रोकें और गैस की नली को तेजी से हटा दें।
  6. तरल नी के साथ पॉलीस्टाइन ट्रे भरेंपीतल कप के ऊपर से 5 मिमी से ऊपर trogen। तरल नाइट्रोजन पीतल कप में प्रवेश मत।

5. नमूना की डुबकी बर्फ़ीली

  1. polystyrene ट्रे में तरल नाइट्रोजन के लगभग 200 एमएल रखो। उन्हें तरल नाइट्रोजन में डालकर थोड़ा पीतल कप (ऊंचाई 1.5 सेमी व्यास 2.5 सेमी और मोटाई 1 मिमी) फ्रीज। एक निलंबन सेल नमूने के लिए एक कप रखो। नमूने मिश्रण के प्रति सावधान रहें। इस उद्देश्य के लिए नमूना 1 कप 1 में, नमूना 2 कप 2, आदि में डाल दिया।
  2. तरल नाइट्रोजन में अपने टिप डूबनेवाला द्वारा चिमटी फ्रीज।
  3. गोली 3.5 में प्राप्त में एक डबल धार विदारक सुई डुबकी।
  4. चिमटी का प्रयोग, एक 400 जाल तांबा माइक्रोस्कोपी ग्रिड अनुभाग 1 में तैयार formvar के साथ लेपित ले।
  5. चीर-फाड़ सुई का प्रयोग, गोली ग्रिड पर 3.5 में प्राप्त की एक बूंद जगह। विभिन्न बूंद आकार (उदाहरण के लिए 2, 5 और 10 μL) की कोशिश करो।
  6. बहुत तेजी से तरल प्रोपेन जीन में ग्रिड चिमटी द्वारा आयोजित डुबकीअनुभाग 4 में मूल्यांकन किया गया और कुछ सेकंड के लिए परिपत्र आंदोलन के साथ ग्रिड हलचल।
  7. तेजी से थोड़ा पीतल कप खंड 5.1 में जमे हुए को चिमटी से जमे हुए ग्रिड हस्तांतरण।
    नोट: प्रत्येक नमूने के लिए, कम से कम 3 ग्रिड बनाते हैं। हमेशा एक तांबे ग्रिड लेने से पहले चिमटी फ्रीज।

6. फ्रीज-प्रतिस्थापन

नोट: आज़मियम tetroxide संभावित अस्थिर है, इसलिए वाष्प कारतूस के साथ एक हवाई सफ़ाई श्वासयंत्र का उपयोग करें। डुबकी ठंड से पहले तरल नाइट्रोजन में बंधक बर्फ़ीली भी एक समाधान है।

  1. फैटी अध्ययन के लिए, 1.8 एमएल cryovial खंड 2.1 में तैयार फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम युक्त ट्यूबों खोलें। immunolocalization अध्ययन के लिए, 1.8 एमएल cryovial खंड 2.2 में तैयार फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम युक्त ट्यूबों खोलें। cryovials पर टोपी रखें।
  2. तरल नाइट्रोजन में अपने टिप डूबनेवाला द्वारा चिमटी फ्रीज।
  3. तेजी से टोपी हटाने और जमे हुए ग्रिड हस्तांतरण मैंचिमटी का उपयोग कर cryovials nto।
  4. टोपी cryovials पर वापस रखो।
  5. प्रत्येक नमूने के प्रत्येक ग्रिड के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ।
  6. सुनिश्चित करने के लिए नमूने फ्रीज प्रतिस्थापन माध्यम में कर रहे हैं हाथ की एक परिपत्र आंदोलन के साथ सभी बड़े अक्षरों को बंद करें और cryovials हलचल।
  7. फ्रीज प्रतिस्थापन की प्रक्रिया के दौरान एक -84 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 3 दिनों के लिए एक वायुरुद्ध बॉक्स में cryovials रखें।

7. नमूना वार्मिंग

  1. फैटी पढ़ाई
    1. ले जाने के एक polystyrene ट्रे में cryovials एक -30 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए (तापमान में अचानक वृद्धि से बचने के लिए)। उन्हें -30 डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए फ्रीजर में रखें।
    2. एक -15 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में cryovials 2 घंटे के लिए रखें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें और फिर।
    3. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम निकालें। 100% एसीटोन के लगभग 500 μL जोड़ें।
    4. हलचल 1.8 मिलीलीटर cryovialहाथ की एक परिपत्र आंदोलन और तेजी से साथ एसीटोन (1.5 एमएल) एक गिलास शीशी में ग्रिड (ऊंचाई 3 सेमी और व्यास 2 सेमी) युक्त डालना।
    5. 100% एसीटोन के 1 एमएल के साथ एक ही cryovial कुल्ला सब ग्रिड स्थानांतरित कर दिया है करने के लिए सुनिश्चित किया जाना है। हाथ की एक परिपत्र आंदोलन के साथ cryovial हलचल और एक गिलास शीशी में cryovial की सामग्री डालना।
    6. 10 मिनट के लिए की 100% एसीटोन 3 बार 3 एमएल के साथ एक गिलास शीशी कुल्ला।
    7. संदर्भ 15 में वर्णित के रूप एम्बेडिंग और शामिल किए जाने प्रक्रियाओं का पालन करें। एसीटोन में epoxy राल की सांद्रता बढ़ रही है (25%, 50%, और 75%) के साथ नमूना व्याप्त और जिलेटिन कैप्सूल में 100% epoxy राल के साथ नमूना एम्बेड।
  2. पढ़ाई immunolabeling
    1. ले जाने के एक polystyrene ट्रे में 1.8 एमएल cryovials -30 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के लिए (तापमान में अचानक वृद्धि से बचने के लिए)।
    2. 2 घंटे के लिए cryovials एक -30 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    3. एक -30 डिग्री में सी फ्रीजर, हाथ की एक परिपत्र आंदोलन के साथ cryovial हलचल और तेजी से एक polypropylene शीशी (ऊंचाई 5 सेमी और व्यास 1.5 सेमी) में फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम डालना।
    4. ताजा फ्रीज प्रतिस्थापन माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम बदलें।
    5. एक -30 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 2 घंटे के लिए polypropylene शीशी रखें।
    6. 100% एसीटोन के 2 एमएल और 100% इथेनॉल के 2 एमएल के साथ 1 घंटे के लिए तीन बार के साथ 1 घंटे के लिए polypropylene शीशी कुल्ला।
    7. संदर्भ 15 में वर्णित के रूप एम्बेडिंग और शामिल किए जाने प्रक्रियाओं का पालन करें। ऐक्रेलिक राल की सांद्रता बढ़ रही है (25%, 50%, और एसीटोन में 75%) के साथ नमूना व्याप्त और जिलेटिन कैप्सूल में 100% एक्रिलिक राल के साथ नमूना एम्बेड।

8. नमूने का विजुअलाइजेशन

  1. एम्बेड करने के बाद, एक ultramicrotome साथ नमूनों की 80 एनएम अति पतली वर्गों बनाते हैं। 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2% की बढ़त साइट्रेट के साथ वर्गों कंट्रास्टगधा = "xref"> 15।
  2. वर्गों 15 निरीक्षण करने के लिए एक 80 केवी या 120 केवी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

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Representative Results

इस लेख में, ultrastructural (आंकड़े 1 और चित्रा 2) और immunolabeling (चित्रा 3) के अध्ययन के लिए एक और उपयोग में आसान-कम लागत वाली डुबकी ठंड विधि प्रस्तुत किया है। हम जानते हैं कि यह आवश्यक फ्रीज प्रतिस्थापन प्रक्रिया के लिए और वार्मिंग प्रक्रिया एक समर्पित प्रणाली का उपयोग कर 24 घंटे के बजाय कम से कम 6 घंटे लग जाते हैं कि विशेष उपकरण है करने के लिए नहीं है का प्रदर्शन।

पीएफ / फ्रीज प्रतिस्थापन विधि Saccharomyces cerevisiae (चित्रा 1 ए और 1 डी-एच), Schizosaccharomyces pombe (चित्रा 1 बी और के intracellular संरचनाओं के सुधार संरक्षण में हुई सी), लीशमैनिया कशाभिका (चित्रा 2 ए और बी), ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी (चित्रा 2 सी और डी), और Escherichia कोलाई (चित्रा 2 ई)। संरचनाओं सिकुड़ा हुआ नहीं हैं और कोशिका द्रव्य घने प्रकट होता है। इसके अलावा, झिल्ली चिकनी कर रहे हैं, जो अच्छी संरक्षण का सबूत है। इस तरह के नाभिक (चित्रा 1 ए, बी डी और चित्रा 2A डी) माइटोकांड्रिया (चित्रा 1 ए -सी, ई और एच), और रिक्तिकाएं (चित्रा 1 ए, सी, एफ और एच) के रूप में अंगों, सब के सब, पूरी तरह से पहचाना जा सकता है । नाभिक में, एक डबल झिल्ली परमाणु लिफाफा, परमाणु ध्यान में लीन होना, धुरी पोल शरीर, और परमाणु लिफाफा की बाहरी झिल्ली पर संलग्न राइबोसोम के गठन साफ़ तौर पर दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 1डी और चित्रा 2 बी, 2 डी)। माइटोकॉन्ड्रिया में, आंतरिक झिल्ली invaginations, cristae कहा जाता है (चित्रा 1E), स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। रिक्तिकाएं महत्वपूर्ण अंगों क्योंकि बड़े बर्फ के क्रिस्टल उन्हें अंदर आसानी से विकसित कर सकते हैं कर रहे हैं। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, रिक्तिकाएं पूरी तरह से बर्फ क्रिस्टल क्षति (चित्रा 1 ए, सी, एफ, और एच) के बिना संरक्षित कर रहे हैं। अंत में, के रूप में फैटी अच्छी तरह से संरक्षित है, अलग अलग जैविक घटनाओं ऐसे भोजी (चित्रा 1C, एफ और एच), mitochondrial आकारिकी (चित्रा 1E), स्रावी पुटिकाओं (चित्रा 1G), और परमाणु विभाजन (चित्रा 1 ए के रूप में मनाया और विश्लेषण किया जा सकता, , चित्रा 2 बी, एकnd 2C)।

विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन की सीटू स्थानीयकरण में कोशिका जीव विज्ञान में सबसे शक्तिशाली और लोकप्रिय तकनीकों में से एक है। पीएफ भी प्रोटीन immunolocalization प्रदर्शन करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह प्रक्रिया प्रोटीन प्रतिजनकता को बरकरार रखता है और, के रूप में hereinabove उल्लेख किया है, organelle पहचान। इस तरह के विरोधी एटीपी सिंथेज़ 7, 15 (चित्रा 3 ए, 3 सी और 3 डी), विरोधी GFP (चित्रा 3 बी), विरोधी porine 16 (चित्रा 3 ई), और विरोधी fox2 17 (चित्रा के रूप में विभिन्न खमीर प्रोटीन, को लक्षित विभिन्न एंटीबॉडी 3F), पहले से ही परीक्षण किया गया है। यह भी इस तरह के लीशमैनिया 12 के रूप में विभिन्न जीवों, पर इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए संभव है।


चित्र 1: खमीर Saccharomyces cerevisiae और Schizosaccharomyces pombe की ultrastructural पढ़ाई के TEM छवियों। (ए) एस cerevisiae का अवलोकन। (बी) एस pombe का अवलोकन। (सी) एस pombe कोशिका द्रव्य का एक हिस्सा। (डी) एक नाभिक की उच्च आवर्धन। (ई) cristae स्पष्ट रूप से दिखाई के साथ एक माइटोकांड्रिया का विस्तार। भोजी के दौरान (एफ) vacuolar आकृति विज्ञान। (G) स्राव पुटिकाओं के अंदर के साथ खमीर कली। (एच) भोजी की प्रक्रिया के दौरान रिक्तिकाएं और mitochondria के बीच अंतरंग संपर्कों का उदाहरण। एन, नाभिक; वी, रिक्तिका; मी, माइटोकांड्रिया; एसवी, स्राव vesicles; आर, राइबोसोम। स्केल सलाखों 200 एनएम =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: लीशमैनिया amazonesis, ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी और ई कोलाई का ultrastructural पढ़ाई के TEM छवियों। (ए) लीशमैनिया का अवलोकन। (बी) परमाणु ध्यान में लीन होना और जालिका साथ लीशमैनिया कोशिका द्रव्य का विस्तार। (सी) टी ब्रुसे का अवलोकन। (डी) टी ब्रुसे नाभिक के उच्च आवर्धन। (ई) ई कोलाई सेल का अवलोकन। N: नाभिक; वी, रिक्तिका; मी, मिटोchondrion; एनपी, परमाणु ध्यान में लीन होना; एफ, कशाभिका; एफपी, कशाभी जेब; कश्मीर, kinetoplast; आर, राइबोसोम। स्केल सलाखों 200 एनएम =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: मोनोक्लोनल और पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग प्रोटीन लेबलिंग के उदाहरण। (ए) एस cerevisiae का अवलोकन। (बी) विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ एमीलोयड-β के immunolabeling। (सीडी) विरोधी एटीपी सिंथेज़ एंटीबॉडी के साथ माइटोकॉन्ड्रिया लेबलिंग का उदाहरण। एक माइटोकांड्रिया की बाहरी झिल्ली में (ई) Porin स्थानीयकरण। (एफ) Fox2 प्रोटीन immunolabeling द्वारा माइटोकांड्रिया में पता चला है। (G) में Ld Flabarin का स्थानीयकरणलीशमैनिया amazonesis की एक कशाभिका के एक अनुदैर्ध्य अनुभाग। एंटीबॉडी के सभी 10 एनएम सोने पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया जाता है। एन, नाभिक; वी, रिक्तिका; मी, माइटोकांड्रिया। स्केल सलाखों 200 एनएम =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

TEM अंगों, कोशिकाओं और ऊतकों की ultrastructural अवलोकन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। Cryofixation / फ्रीज प्रतिस्थापन वर्तमान में दोनों फैटी और प्रोटीन प्रतिजनकता के संरक्षण के लिए सबसे अच्छा तरीका है। रासायनिक fixatives घुसना और बहुत धीरे धीरे जिससे कार्य फैटी 2 की पूरी स्थिरीकरण से पहले संरचनात्मक rearrangements की इजाजत दी। इसके विपरीत, cryofixation / फ्रीज प्रतिस्थापन तुरंत सेलुलर संरचनाओं 4 स्थिर। हालांकि, cryofixation / फ्रीज प्रतिस्थापन तकनीक की कमी और कठिनाइयों जिससे आवेदन की अपनी सीमा को सीमित करने के एक नंबर शामिल हैं। यह नमूना, ठंड कलाकृतियों, तकनीक, लागत, और उपकरणों की प्राप्ति से संबंधित है। उच्च दबाव ठंड / फ्रीज प्रतिस्थापन तकनीक सेलुलर विवरण 6 के संरक्षण, 7 के एक उच्च डिग्री में सक्षम बनाया है। इसके विपरीत, पीएफ पहले से ही obs के लिए प्रयोग किया जाता हैअनाकार बर्फ 9 की पतली फिल्मों पर निलंबित कर दिया छोटी वस्तुओं Erving। इधर, पीएफ ultrastructural और immunolabeling के अध्ययन के लिए / फ्रीज प्रतिस्थापन विधि खमीर, परजीवी, और बैक्टीरियल फैटी उच्च दबाव ठंड छवियों के लिए तुलनीय की उच्च गुणवत्ता छवियों प्रदान करता है।

फिक्सेशन गुणवत्ता ठंडा दरों 18 पर निर्भर करता है। उच्च ठंडा दरों पर, पानी कांच का अवस्था में है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के स्तर पर दिख रहा क्रिस्टलीय संरचना नहीं दिखाती है। कांच में रूपांतर एक बहुत पतली ऊपरी सतह (सामान्य रूप में 200 सुक्ष्ममापी) में पूरी तरह से होता है और इसलिए, अच्छा मोटाई ठंड धीरे-धीरे भीतरी परतों से 4 नमूना की सतह से कम हो जाएगा। पौधों की कोशिकाओं में, मोमी कोटिंग या रिक्त स्थान गैस से भरा ठंडा दरों धीमा कर सकते हैं। पीएफ के साथ, आश्चर्यजनक रूप से, ठंड प्रदर्शन की गुणवत्ता में कोई कमी मनाया गया। प्रयोगों के सभी में, अच्छी तरह से जमे हुए कोशिकाओं का प्रतिशत ग्राम है 50% से reater। यह प्रतिशत 90 से अधिक% से 50% के बीच भिन्न होता है और विभिन्न मापदंडों (संस्कृति मध्यम, कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति, बाहरी तापमान और नमी के स्तर) पर निर्भर है। जैसा कि ऊपर कहा, बर्फ के क्रिस्टल के गठन कोशिका संरचना को नष्ट कर देता है और बर्फ के क्रिस्टल रिक्तिकाएं में विशेष रूप से दिखाई दे रहे हैं। पीएफ / फ्रीज प्रतिस्थापन प्रक्रिया में, विशेष ध्यान देने की ठंड तापमान के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। फ्रीज प्रतिस्थापन कदम -82 डिग्री सेल्सियस से ऊपर नहीं किया जा चाहिए, अन्यथा, कांच का पानी क्रिस्टलीय पानी में परिवर्तित हो जाएगा। बर्फ क्रिस्टल क्षति के गठन से बचने के लिए cryoprotectant वर्तमान में प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह कोशिकाओं 19 की फैटी में परिवर्तन होता है। खमीर, बैक्टीरिया और परजीवी संस्कृति माध्यमों एक घटक cryoprotective एजेंट है कि हो सकता है। इस संदर्भ में, यह क्रम में अतिरिक्त cryoprotectant उपयोग करने के लिए वास्तविक सेलुलर राज्य के लिए अधिक से अधिक निकट होने के लिए नहीं का निर्णय लिया गया।

ve_content "> पीएफ / फ्रीज प्रतिस्थापन की सफलता विधि के विकास के चरण के दौरान कई महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर करता है। सबसे पहले, एक महत्वपूर्ण बिंदु छर्रों के उचित स्थिरता प्राप्त करने के लिए है। गोली centrifugation के बाद प्राप्त करने के लिए पर्याप्त कॉम्पैक्ट लुढ़काया जा करने के लिए किया जाना चाहिए बाहर एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ग्रिड पर। तो गोली भी कॉम्पैक्ट है, फ्रीज प्रतिस्थापन समाधान ड्रॉप नहीं कर सकते घुसना, और फैटी अच्छी तरह से संरक्षित नहीं किया जाएगा। इसके विपरीत, यदि गोली काफी कॉम्पैक्ट नहीं है, बचे हुए कल्चर माध्यम विकास हो सकता है बर्फ के क्रिस्टल और सेल फैटी ख़राब। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं से छर्रों के उचित स्थिरता प्राप्त करने के लिए, यह सब के लिए कोशिकाओं और centrifugation मापदंडों प्रोटोकॉल में संकेत का संकेत दिया संख्या प्राप्त करने (ऊपर देखें) संस्कृति की स्थिति का सम्मान करने के लिए आवश्यक है प्रकार की कोशिकाओं। हालांकि, पदार्थ की मात्रा तांबे ग्रिड पर नहीं डाल महत्वपूर्ण है, है। विभिन्न छोटी बूंद आकार का परीक्षण किया जा सकता है। दूसरा ग्रिड प्रकार थाटी एक समर्थन के रूप में महत्वपूर्ण है प्रयोग किया जाता है। विभिन्न जाल आकारों के साथ कई सोने, निकल, और तांबे ग्रिड परीक्षण किया गया। सबसे अच्छा परिणाम पतली सलाखों के साथ एक 400 जाल तांबा ग्रिड से प्राप्त की गईं। तीसरा, ठंड कदम के संबंध में, एक पीतल कप प्रोपेन दव्र बनाना करने के लिए पसंद किया जाता है। तांबा कप में तरल प्रोपेन फ्रीज जाता है और इसलिए, प्रयोग पेचीदा हो। अंत में, जोड़तोड़ जल्दी और ठंड की स्थिति में आकस्मिक नमूना वार्म अप से बचने के लिए काम करना चाहिए। यदि ऐसा होता है, नमूना खारिज कर दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, नमूना वार्मिंग को रोकने के लिए, चिमटी उन्हें प्रयोग करने से पहले पूर्व ठंडा किया जाना चाहिए और फ्रीज प्रतिस्थापन मध्यम अच्छी तरह से आगे की प्रक्रिया से पहले तैयार रहना चाहिए। ठंडा चिमटी भी डुबकी ठंड प्रक्रिया डुबकी ठंड becauseif दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए चिमटी ठंड के बिना महसूस किया है, धुआं रूपों का एक बहुत के रूप में चिमटी (गर्मी / ठंडा विनिमय के कारण) प्रोपेन में डूब रहे हैं। यह अनिवार्य रूप से ठंडा दरों पर प्रभाव पड़ता है। sampl साथ टेस्टunfrozen चिमटी से जमे हुए तों ठीक से जम नहीं होना दिखाई देते हैं।

इसके अलावा, इस तरह के हे अतः 4 और फ्रीज प्रतिस्थापन माध्यम में uranyl एसीटेट के रूप में खतरनाक रसायनों के उपयोग के समाधान के तैयारी के दौरान, की आवश्यकता है और फ्रीज-प्रतिस्थापन प्रक्रिया, पर्याप्त पीपीई साथ धूआं हुड के नीचे काम करने के लिए। Oso 4 के रिसाव और वाष्प की साँस लेना रोकने के लिए, cryovials एक कठिन ओ-रिंग सुनिश्चित करना है कि ट्यूबों फ्रीज प्रतिस्थापन की प्रक्रिया के दौरान सील कर रह होना आवश्यक है। फ्रीज प्रतिस्थापन माध्यम की तैयारी के दौरान आज़मियम वाष्प को अनावश्यक जोखिम से बचने के लिए Oso 4 इंजेक्शन की शीशी एक गिलास फ्लास्क में तोड़ा जा सकता है। शामिल किए जाने के बाद राल ब्लॉक में कांच के टुकड़े की उपस्थिति acetones rinses और एम्बेडिंग के चरणों के दौरान ठीक टिप हस्तांतरण pipettes का उपयोग करके बचा जा सकता है। एक दूरबीन पाश के तहत शामिल किए जाने के कदम और अर्द्ध पतली वर्गों की प्राप्ति प्रदर्शन भी पुष्टि करने के लिए कोई कांच के टुकड़े देखते हैं कि के लिए अनुमति देता है।प्रयोगों एक धूआं हुड (विशेष रूप से फ्रीज प्रतिस्थापन प्रक्रिया का पहला चरण में) के तहत आयोजित नहीं किया जा सकता है, वाष्प कारतूस के साथ एक हवाई सफ़ाई श्वासयंत्र का उपयोग करें। जोड़तोड़ भी जब तरल नाइट्रोजन के साथ या ठंड चरणों के दौरान ठंड की स्थिति में काम कर रहे सावधान रहना चाहिए। दस्ताने और चश्मे के इस्तेमाल की सिफारिश कर रहे हैं। इसके अलावा, प्रोपेन तो द्रवीकरण एक हवादार कमरे में या एक धूआं हुड के नीचे किया जाना चाहिए और कोई खुली आग की अनुमति है, संभावित विस्फोटक है।

कई लेख से पता चला कि, इस तरह के मस्तिष्क के ऊतकों, आइवी पत्ता, या ए थालिअना और एन benthamiana की जड़ के रूप में नमूने की एक विस्तृत विविधता पर, फैटी के संरक्षण के रासायनिक निर्धारण 20, 21 की तुलना में HPF तकनीक के साथ सुधार हुआ है। पीएफ के साथ, प्रयोगों निलंबन में कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया। इसलिए, ला पर इस तकनीक की सफलता का कोई संकेत नहीं हैrger ऊतकों की तरह नमूने। इसके अलावा प्रयोगों इस बात का पता करने के आयोजित किए जाने की जरूरत है। हालांकि, विधि सफलतापूर्वक filamentous कवक Podospora anserina कि कोशिकाओं को अलग नहीं है बल्कि माईसीलियम प्रपत्र 22 की है के साथ परीक्षण किया गया है।

इस लेख में प्रस्तुत विधि रासायनिक निर्धारण या HPF की वर्तमान तरीकों ऊपर एक उल्लेखनीय सुधार का प्रतिनिधित्व करता है। उदाहरण के लिए, पीएफ HPF 23 के विपरीत महंगे उपकरण या उपभोज्य आवश्यकता नहीं है। केयर इसलिए भी कि HPF तकनीक तरल नाइट्रोजन की एक बड़ी राशि (प्रति परीक्षण के बारे में 80 एल) का उपयोग करता है लिया जाना चाहिए। तकनीक का प्रस्ताव के साथ, एक प्रमुख लाभ यह है कि कोई महत्वपूर्ण उपकरण आवश्यक 23 है। इस प्रकार, एक प्रयोग की लागत काफी कम (लगभग एक सौ गुना सस्ता है)। एक और लाभ यह है कि कोई विशेष विशेषज्ञता तकनीक का उपयोग करने के लिए आसान है, क्योंकि जरूरत है। इसके अलावा, नमूना प्रसंस्करण ओच पीएफ / फ्रीज प्रतिस्थापन वार्मिंग प्रक्रिया है कि 24 घंटे के 24 के बजाय कम से कम 6 घंटे लग जाते हैं की वजह से HPF / फ्रीज प्रतिस्थापन की तुलना में काफी कम है। यह न अधिक समय पारंपरिक रासायनिक निर्धारण की तुलना में लगता है। लाभ यह है कि सेलुलर फैटी पूरी तरह से कम से कम कलाकृतियों के साथ संरक्षित और ज्यादा कोशिकाओं 'मूल राज्य के करीब है जाता है। इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग निश्चित रूप से इस तरह के फंगल हाईफे 22 के रूप में विभिन्न तेजी से जैविक घटनाओं का अध्ययन करने या निलंबन में उगाई जाने वाली कोशिकाओं के लिए और कुछ माइक्रोमीटर मोटाई, के नमूने के लिए उच्च संकल्प में प्रोटीन स्थानीयकरण फायदा नहीं होगा।

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Disclosures

लेखकों घोषणा करते हैं कि वे ब्याज की कोई संघर्ष की है।

Acknowledgments

हम उनकी मदद और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए एम Bouchecareilh, ई Tétaud, एस Duvezin-Caubet, और ए डेविन के लिए हमारी कृतज्ञता व्यक्त करते हैं। हम बोर्डो इमेजिंग सेंटर के इलेक्ट्रॉनिक इमेजिंग ध्रुव जहां छवियों ले जाया गया के आभारी हैं। यह काम केंद्र राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

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References

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डुबकी बर्फ़ीली: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में निलंबन कोशिकाओं के Ultrastructural और Immunolocalization अध्ययन के लिए एक उपकरण
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Blancard, C., Salin, B. Plunge… More

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

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