Summary
تصف هذه المخطوطة وسيلة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة كريوفيكساتيون لتصور خلايا تعليق عن طريق انتقال المجهر الإلكتروني.
Abstract
انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) هو أداة استثنائية لدراسة التركيب الدقيق خلية، من أجل توطين البروتينات وتصور المجمعات الجزيئات في دقة عالية جدا. ومع ذلك، للحصول على أقرب ما يمكن إلى الدولة الأم، مطلوب الكمال الحفاظ على العينة. التقليدية المجهر الإلكتروني (EM) التثبيت مع الألدهيدات، على سبيل المثال، لا يوفر الحفاظ التركيبية جيد. اختراق البطيء للمثبتات يدفع إعادة تنظيم الخلايا وفقدان مكونات الخلية المختلفة. لذلك، EM تثبيت التقليدي لا يسمح لاستقرار لحظية والحفاظ على الهياكل واستضداد. أفضل خيار لدراسة الأحداث داخل الخلية هو استخدام cryofixation تليها طريقة تثبيت تجميد الاستبدال التي تحافظ على خلايا في حالتها الأصلية. الضغط العالي تجميد / تجميد الاستبدال، الذي يحافظ على سلامة التركيب الدقيق الخلوية، هو الأسلوب الأكثر شيوعا، ولكن يتطلب expensiلقد المعدات. هنا، يتم تقديم وسيلة سهلة الاستخدام والتكلفة المنخفضة للتجمد تثبيت تليها تجميد استبدال لمزارع الخلايا تعليق.
Introduction
إعداد عينة أمر بالغ الأهمية لنجاح أي دراسة المجهر الإلكتروني. كان التقليدية EM تثبيت الوسيلة الرئيسية لتحديد الأنسجة أو الخلايا للانتقال المجهر الإلكتروني (TEM) 1. أولا، يتم استخدام الألدهيدات ورباعي أكسيد الأوزميوم لإصلاح كيميائيا المواد في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، يتم المجففة المواد مع المذيبات العضوية، تسلل، وجزءا لا يتجزأ من راتنجات الايبوكسي. هذا الأسلوب يعتمد على معدل تغلغل المثبتات في الخلية. وبالتالي، فإن القطع الأثرية واستخراج محتويات الخلوية وعادة ما تكون لاحظت 2.
Cryofixation ومن الواضح أن البديل الأفضل للحفاظ على الهياكل الخلوية 3، وحفظ لهم سليمة. أعلى مستوى من الجودة من الصور TEM 4 في أقسام الراتنج رقيقة يمكن الحصول عليها باستخدام طريقة الاستبدال cryofixation / التجميد. والهدف من هذه التقنية هو الحصول على نصف المزججعينات ological دون تشكيل بلورات الثلج أو التي تحتوي على بلورات الثلج الصغيرة بما يكفي كي لا تلحق الضرر التركيب الدقيق للخلايا. تجميد الضغط العالي (HPF) وcryofixation فائقة سريعة، وهو ما يسمى أيضا يغرق التجمد (PF)، طريقتان لcryofix العينات. HPF يشل الجزيئات في خلية على الفور والابتعاد عن الأضرار الناجمة عن تثبيت EM التقليدية. وقد تم تطوير عدة أنواع من آلات تجميد والأجهزة الاستبدال التلقائي 5. آلات التجميد والمواد الاستهلاكية (النيتروجين السائل، عينة الناقلين، الخ) غالية الثمن، لكنها تسمح لإنتاج الميكروسكوب الإلكتروني ذات جودة عالية 6، 7. PF هو الاسلوب الذي تم استخدامه في أوائل 1950s، ويوصف في الأدبيات بسيطة ورخيصة 8. وخلال إجراء PF، يتم تجميد العينة مستعدة بمعدل سريع للحصول على بلورات الثلج حجم أقل من 3 إلى 5 نانومتر. تحقيقا لهذه الغاية، والعينةسقطت في كريوجين السائل، مثل الإيثان والبروبان، أو خليط الإيثان والبروبان. منذ 1950s، وقد تم القيام به تحسينات PF لجعل هذه التقنية متاحة لعدد أكبر من المستخدمين. ارتفاع ضغط التجميد هو حاليا السبيل الوحيد لتجميد مجموعة كبيرة ومتنوعة من نماذج سمكا من 50 ميكرون (تصل إلى سمك 200 ميكرون لعينات على شكل قرص) 5، في حين يستخدم PF على نطاق واسع لصورة الأشياء الصغيرة (<100 نانومتر )، مثل المجمعات الجزيئات العالقة في طبقة رقيقة من الجليد غير متبلور 9. عينات أكبر، على سبيل المثال خلايا حقيقية النواة، يمكن cryofixed التي كتبها PF، ولكنها تتطلب عينة أصحاب، مثل الأنابيب الشعرية النحاس أو أنظمة ساندويتش 8 و 10 و 11.
هنا، وسريعة وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة يغرق التكنولوجيا تجميد / تجميد الاستبدال التي يمكن استخدامها لمختلف الثقافات تعليق خلية يرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد Formvar الشبكة السينمائي
ملاحظة: إجراء التلاعب الكلوروفورم تحت غطاء الدخان باستخدام معدات الحماية الشخصية (القفازات، معطف المختبر، والنظارات). استخدام 400 يتناغم المجهر الإلكتروني شبكات النحاس. مع أنواع أخرى شبكة (أحجام شبكة أخرى، والذهب والنيكل شبكات)، ونوعية التجميد هو أسوأ.
- يعد حل 100 مل من 0.3٪ formvar في الكلوروفورم. السماح لها حل بين عشية وضحاها دون الانفعالات.
- وضع 400 شبكة (عدد الثقوب لكل بوصة مربعة) شبكات microscopycopper الإلكترون (قطر 3.05 مم) في قارورة زجاجية (ارتفاع 3 سم وقطرها 2 سم) التي تحتوي على الأسيتون. تحريك قنينة زجاجية مع حركة دائرية من ناحية. إزالة الأسيتون مع نقل ماصة بلاستيكية. السماح للمذيب لتتبخر لمدة 5 دقائق. نقل شبكات بصب لهم على ورقة الترشيح وتسمح لهم لتجف لمدة 5 دقائق.
- تلميع شريحة زجاجية 76 × 26 مم 2 عن طريق المسح بقطعة قماش خالية من الوبر حتى لامعة / زلق.
- خذ عاء التبلور (قطر 15 سم، الطول: 7 سم وقدرة 1200 مل) وملئه حتى أسنانها مع الماء المقطر. تنظيف سطح الماء عن طريق تمرير شريط الزجاج على سطح مرتين لإزالة الغبار.
- عقد شريحة زجاجية بين إصبعين وتراجع في الحل formvar لبضع ثوان. الاحتفاظ بها تستقيم لتجف تحت الكأس رأسا على عقب لمدة 5 دقائق.
- عندما الفيلم الجاف، والنتيجة حواف شريحة زجاجية مع شفرة حلاقة حادة لتحديد حدود الفيلم ليتم إقصاؤه من الشريحة.
- خذ نفسا عميقا وزفر بشدة على الشريحة للحصول على طبقة من بخار الماء على وتحت الفيلم لتقديم فيلم مبهمة قليلا وتعزيز حضورها.
- على الفور تطفو الفيلم على سطح المياه عاء التبلور من خلال لمس الجزء السفلي من الشريحة مع زاوية من حوالي 30 درجة. دعونا الافراج عن الفيلم من الشريحة وقشر تشغيله على سطح الماء عاء التبلور. برفق الفيلم قبالة معملاقط، إذا لزم الأمر.
- وضع بلطف شبكات الوجه لأسفل على الفيلم العائمة على سطح الماء في المناطق التي هي من سمك السليم (حوالي 10 نانومتر) ودون التجاعيد.
- التقاط الفيلم عن طريق تغطية الشبكات مع ورقة جوزيف لأنها تطفو على سطح المياه البلورة.
- عقد ورقة جوزيف بيد واحدة، تلمس نهاية واحدة من ورقة جوزيف إلى نهاية واحدة من الفيلم. انتظر حتى ورقة جوزيف الرطب تماما. إزالة ورقة جوزيف مع شبكات عالقة على.
- وضع الشبكات لمدة 24 ساعة في طبق بتري مغطاة للتجفيف النهائي والتخزين قبل استخدامها في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد تجميد الاستبدال المتوسطة
ملاحظة: رباعي أكسيد الأوسيميوم (أوسو 4 ) وخلات اليورانيل هي مواد كيميائية خطرة. التعامل معها في غطاء الدخان أثناء ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (ب) بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. الفلآه تحذيرات السلامة للتعامل مع (أوسو 4) وخلات اليورانيل. استخدام cryovials O-عصابة لتجنب تسرب أوسو 4.
- الدراسات التركيبية
- وضع الزجاج أوسو 4 أمبولة في قارورة زجاجية.
- كسر أمبولة عن طريق هز قارورة.
- إضافة حجم مناسب من الأسيتون 100٪ للحصول على التركيز النهائي 4٪.
- إثارة والاستغناء 1.5 مليلتر مأخوذة إلى 1.8 مل cryovials.
- البروتين immunolabeling
- ضع 0.05 غرام من خلات اليورانيل في قارورة زجاجية.
- إضافة 50 مل من 100٪ الأسيتون.
- تحريك الحل مع محرك مغناطيسي. عندما يصبح حل واضح، تصفية باستخدام مرشح 0.2 ميكرون.
- الاستغناء عن 1.5 مل aliquots إلى 1.8 مل cryovials.
ملاحظة: تحضير cryovials تحتوي على المتوسط تجميد استبدال قبل عملية التجميد يغرق والاحتفاظ بها في -84 ° C الثلاجة. عكس القارورة الزجاجية لرمي بعيداأوسو 4 أمبولة في النفايات الخطرة.
3. إعداد خلايا
ملاحظة: هذه الخطوة هو أمر حاسم لنجاح هذه الطريقة. لجميع أنواع الخلايا، وتنمو الخلايا للحصول على عدد من الخلايا المشار إليها. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب المبين في الوقت المحدد وسرعة.
- للحصول على التناسق المناسب من الكريات من أنواع مختلفة من الخلايا، وتنمو الخلايا على النحو التالي:
- لخميرة الخباز والسكيراء pombe، تطعيم الخميرة في 5 مل من الحد الأدنى أو كاملة وسط سائل. احتضان بين عشية وضحاها في 28 ° C، بالتناوب (180 دورة في الدقيقة). قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) من الثقافة بين عشية وضحاها. تمييع خلايا الخميرة إلى OD 600 من 0.2 في 50 مل المتوسطة انتقائية جديدة. الاستمرار في احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية، بالتناوب، والحصول على 1 × 10 9 خلايا الخميرة 7.
- لالليشمانيا السوط، إينوالطفيليات culate في 5 مل من AM المتوسطة بنسبة 7.5٪ FCS (الجنين مصل العجل). احتضان بين عشية وضحاها في 24 ° C، بالتناوب (180 دورة في الدقيقة). قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها. تمييع الخلايا الطفيليات إلى OD 600 من 0.2 في 50 مل المتوسطة انتقائية جديدة. الاستمرار في احتضان الخلايا في 24 ° C، بالتناوب، للحصول على 5 × 10 8 خلايا طفيل 12.
- لالمثقبية البروسية، تطعيم الطفيليات في 5 مل من SDM-79 متوسطة مع 10٪ FCS و 30 ميكروغرام / مل هيغروميسين. احتضان بين عشية وضحاها في 27 ° C، بالتناوب (180 دورة في الدقيقة). قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها. تمييع الخلايا الطفيليات إلى OD 600 من 0.2 في 50 مل المتوسطة انتقائية جديدة. الاستمرار في احتضان الخلايا في 27 ° C، بالتناوب، للحصول على 5 × 10 8 خلايا طفيل 13.
- لكولاي، تطعيم البكتيريا في 5 مل من المتوسط جان تنمية المناطق مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان ليلا 37 درجة مئوية، وتناوب (180 دورة في الدقيقة). قياس OD 600 من ثقافة بين عشية وضحاها. تمييع الخلايا البكتيريا إلى OD 600 من 0.2 في 50 مل المتوسطة انتقائية جديدة. الاستمرار في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، بالتناوب، للحصول على 5 × 10 10 البكتيريا خلايا 14.
ملاحظة: بعد الحضانة بين عشية وضحاها، قد تكون الخلايا في الثقافة في أي مرحلة النمو لوغاريتمي أو ثابتة. قد تتطلب جدا بطيء النمو سلالات الخلايا حضانة مرات أطول من ليلة واحدة، أو تلقيح عدد أكبر من الخلايا، كما تحدد تجريبيا.
- لجميع أنواع الخلايا، ونقل ثقافة المتوسط تحتوي على خلايا إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1500 ز س.
- إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه من جميع أنواع الخلايا في 1 مل من مستنبت الخلية ذات الصلة.
- الطرد المركزي جميع أنواع الخلايا في أنبوب microcentrifuge لمدة 1 دقيقة في 3900 ز س. تماما إزالة طاف.
- تبقي الخلايا على الجليد.
الصورة = "jove_title"> 4. تسييل البروبان
ملاحظة: التعامل مع النيتروجين السائل بعناية. استخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك cryogloves وغوغل. البروبان غير قابلة للانفجار، لذلك نفذ تسييل في غرفة جيدة التهوية أو تحت غطاء الدخان. لا يسمح اللهب المكشوف.
- وضع حوالي 150 مل من النيتروجين السائل في علبة البوليسترين. وضع كوب من النحاس الأصفر (ارتفاع 3.6 سم، وقطره 2 سم وسماكة 1.5 ملم) في النيتروجين السائل لتجميده. لا تدع النيتروجين السائل تخترق كوب من النحاس الأصفر.
- الانتظار حتى تهدأ فقاعات للتأكد من أن الكأس النحاس يتم تجميد.
- وضع خرطوم توصيل اسطوانة غاز البروبان في اتصال مع الجدار كوب من النحاس الأصفر.
- فتح بلطف صمام البروبان اسطوانة.
ملاحظة: في هذه الخطوة، إسالته البروبان في كوب من النحاس الأصفر. - وقف إسالة عن طريق إغلاق صمام اسطوانة غاز البروبان وبسرعة إزالة خرطوم الغاز.
- ملء علبة البوليسترين مع ني السائلTrogen من ما يصل الى 5 ملم من أعلى الكوب النحاس. لا تدع النيتروجين السائل تخترق كوب من النحاس الأصفر.
5. يغرق تجميد العينة
- وضع حوالي 200 مل من النيتروجين السائل في علبة البوليسترين. تجميد قليلا أكواب نحاس (ارتفاع 1.5 سم قطرها 2.5 سم وسماكة 1 ملم) من خلال وضعها في النيتروجين السائل. وضع كوب واحد لعينة تعليق خلية واحدة. يجب الحرص على عدم خلط العينات. تحقيقا لهذه الغاية، وضعت عينة 1 كوب 1، عينة 2 كوب 2، الخ.
- تجميد ملاقط التي تغرق طرف في النيتروجين السائل.
- يغرق مزدوجة إبرة حافة تشريح في بيليه تم الحصول عليها في 3.5.
- باستخدام الملقط، واتخاذ 400 شبكة النحاس المجهر شبكة المغلفة مع formvar أعدت في القسم 1.
- باستخدام إبرة تشريح، وضع قطرة من بيليه تم الحصول عليها في 3.5 على الشبكة. تجربة أحجام انخفاض المختلفة (مثل 2 و 5 و 10 ميكرولتر).
- يغرق بسرعة كبيرة الشبكة التي عقدها ملاقط داخل الجين البروبان السائلمصنفة في قسم 4 ويقلب الشبكة مع حركة دائرية لبضع ثوان.
- بسرعة نقل الشبكة المجمدة مع ملاقط لكأس النحاس القليل المجمدة في القسم 5.1.
ملاحظة: للحصول على كل عينة، وجعل لا يقل عن 3 شبكات. تجميد دائما ملاقط قبل اتخاذ الشبكة النحاسية.
6. تجميد إحلال
ملاحظة: رباعي أكسيد الأوزميوم هو غير المستقرة، وذلك باستخدام جهاز للتنفس تنقية الهواء مع خراطيش بخار. تجميد تثبيتي في النيتروجين السائل قبل يغرق التجميد هو أيضا حل.
- للدراسات التركيب الدقيق، افتح 1.8 مل أنابيب cryovial تحتوي على المتوسط تجميد استبدال أعدت في القسم 2.1. للدراسات immunolocalization، افتح 1.8 مل أنابيب cryovial تحتوي على المتوسط تجميد استبدال أعدت في القسم 2.2. ضع الغطاء على cryovials.
- تجميد ملاقط التي تغرق طرف في النيتروجين السائل.
- بسرعة إزالة الغطاء ونقل شبكات المجمدة طn لفي cryovials باستخدام ملاقط.
- وضع الغطاء الخلفي على cryovials.
- كرر العملية لكل شبكة من كل عينة.
- إغلاق كافة القبعات وتحريك cryovials مع حركة دائرية من جهة لضمان العينات في المتوسط تجميد تبديل.
- ضع cryovials في مربع محكم لمدة 3 أيام في -84 ° C الفريزر أثناء عملية تجميد تبديل.
الاحترار 7. عينة
- دراسات التركيب الدقيق
- حمل cryovials في علبة البوليسترين (لتجنب ارتفاع مفاجئ في درجة الحرارة) إلى -30 ° C الثلاجة. وضعها في -30 ° C الثلاجة لمدة 1 ساعة.
- ضع cryovials في -15 ° C الثلاجة لمدة 2 ساعة. وضع العينات في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة وبعد ذلك لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة المتوسطة تجميد الاستبدال مع نقل ماصة بلاستيكية. إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر من 100٪ الأسيتون.
- تحريك 1.8 مل cryovialمع حركة دائرية من جهة، وبسرعة صب الأسيتون (1.5 مل) التي تحتوي على الشبكات في قارورة زجاجية (ارتفاع 3 سم وقطرها 2 سم).
- شطف نفس cryovial مع 1 مل من 100٪ الأسيتون للتأكد من أن نقل جميع الشبكات. تحريك cryovial مع حركة دائرية من ناحية وتصب محتوى cryovial في قارورة زجاجية.
- شطف كل قارورة زجاجية مع 3 مل من 100٪ الأسيتون 3 مرات لمدة 10 دقيقة.
- اتبع الإجراءات التضمين والشمول كما هو موضح في اشارة 15. تلقيح العينة مع زيادة تركيزات من راتنج الايبوكسي في الأسيتون (25٪، 50٪، و 75٪) وتضمين العينة مع راتنجات الايبوكسي 100٪ في كبسولات الجيلاتين.
- Immunolabeling الدراسات
- حمل 1.8 cryovials مل في علبة البوليسترين (لتجنب ارتفاع مفاجئ في درجة الحرارة) إلى -30 ° C الثلاجة.
- ضع cryovials لمدة 2 ساعة في -30 درجة مئوية الثلاجة.
- في -30 ° C الثلاجة، تحريك cryovial مع حركة دائرية من جهة، وبسرعة صب المتوسطة تجميد الاستبدال في قارورة البولي بروبلين (ارتفاع 5 سم وقطرها 1.5 سم).
- استبدال المتوسطة تجميد الاستبدال مع 2 مل من الطازجة المتوسطة تجميد تبديل.
- ضع قارورة البولي بروبلين لمدة 2 ساعة في -30 درجة مئوية الثلاجة.
- شطف قارورة البولي بروبلين لمدة 1 ساعة مع 2 مل من 100٪ الأسيتون وثلاث مرات لمدة 1 ساعة مع 2 مل من الإيثانول بنسبة 100٪.
- اتبع الإجراءات التضمين والشمول كما هو موضح في اشارة 15. تلقيح العينة مع زيادة تركيزات من راتنج الأكريليك (25٪، 50٪، و 75٪ في الأسيتون) وتضمين العينة بنسبة 100٪ راتنج الاكريليك في كبسولات الجيلاتين.
8. التصور العينات
- بعد تضمين، وجعل 80 نانومتر أقسام رقيقة جدا من العينات مع مشراح مستدق. على النقيض من المقاطع مع 2٪ من الرصاص سترات في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقةالحمار = "XREF"> 15.
- استخدام 80 كيلو فولت أو 120 كيلو فولت المجهر الالكتروني لمراقبة الأقسام 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه المقالة، يتم تقديم وسيلة تجميد سهلة الاستخدام وانخفاض التكلفة المنخفضة لالتركيبية (الشكلان 1 و الشكل 2) وimmunolabeling (الشكل 3) دراسات. علينا أن نبرهن على أنه ليس من الضروري أن يكون المعدات الخاصة لهذا الإجراء تجميد الإحلال وأن الإجراء الاحترار تستغرق أقل من 6 ساعات بدلا من 24 ساعة باستخدام نظام مخصص.
أدى PF طريقة / تجميد الاستبدال في الحفاظ تحسين الهياكل داخل الخلايا من خميرة الخباز (الشكل 1A و1D-H)، السكيراء pombe (1B الشكل و C)، الليشمانيا السوط (الشكل 2 ألف وباء)، تريبانوسوما بروسي ( الشكل 2 C و D )، والإشريكية القولونية ( الشكل 2E ). لا تتقلص الهياكل وتظهر السيتوبلازم كثيفة. وعلاوة على ذلك، والأغشية على نحو سلس، وهو دليل على حسن الحفظ. جميع العضيات، مثل نواة ( الشكل 1A ، B D والشكل 2A -D )، الميتوكوندريا ( الشكل 1A -C ، E و H )، والفراغات ( الشكل 1A ، C ، F و H )، يمكن تحديدها تماما . في النواة، غشاء مزدوج تشكيل المغلف النووي، المسام النووي، والجسم القطب المغزل، والريبوسومات تعلق على الغشاء الخارجي للمغلف النووي واضحة للعيان ( الشكل 1D والشكل 2B، 2D). في الميتوكوندريا، والانغلافات الغشاء الداخلي، ودعا أعراف (الشكل 1E)، واضحة للعيان. والفجوات هي عضيات حرجة بسبب بلورات الثلج الكبيرة يمكن أن تتطور بسهولة داخلها. كما هو موضح في الشكل رقم 1، يتم الاحتفاظ فجوات تماما دون ضرر وضوح الشمس الجليد (الشكل 1A، C، F، H و). أخيرا، وكما هو الحفاظ على التركيب الدقيق جيدا، والأحداث البيولوجية المختلفة ويمكن ملاحظة وتحليلها، مثل الالتهام الذاتي (الشكل 1C، F و H)، مورفولوجيا الميتوكوندريا (الشكل 1E)، الحويصلات الإفرازية (الشكل 1G)، والانقسام النووي (الشكل 1A الشكل 2 B، ل 2C الثانية).
في توطين الموقعي من البروتينات مع الاجسام المضادة المحددة هي واحدة من أقوى التقنيات والشعبية في بيولوجيا الخلية. PF يمكن أن تستخدم أيضا كوسيلة لأداء immunolocalization البروتين. هذا الإجراء يحفظ استضداد البروتين و، كما ذكر اأعاله، هوية العضيم. الأجسام المضادة مختلفة تستهدف بروتينات الخميرة مختلفة، مثل مكافحة ATP سينسيز 7 و 15 (الشكل 3A، 3C و 3D)، ومكافحة GFP (الشكل 3B)، ومكافحة porine 16 (الشكل 3 E)، ومكافحة fox2 17 (الشكل 3F)، وبالفعل تم اختبارها. ومن الممكن أيضا لتنفيذ هذه التجارب على الكائنات الحية المختلفة، مثل الليشمانيا 12.
معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 1: صور TEM الدراسات التركيبية من الخمائر خميرة الخباز والسكيراء pombe. (A) نظرة عامة حول S. الخباز. (B) نظرة عامة حول S. pombe. (C) جزء من S. السيتوبلازم pombe. (D) التكبير عالية من النواة. (E) التفاصيل من الحبيبات الخيطية مع أعراف واضحة للعيان. (F) رغوي التشكل خلال الالتهام الذاتي. (G) برعم الخميرة مع حويصلات إفراز الداخل. (H) مثال من الاتصالات الحميمة بين فجوات والميتوكوندريا أثناء عملية الالتهام الذاتي. N، النواة. V، فجوة، م، الحبيبات الخيطية. SV، VESI إفرازCLES. ص، الريبوسومات. الحانات النطاق = 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور TEM الدراسات التركيبية الليشمانيا amazonesis، المثقبية البروسية وE. القولونية. (A) نظرة عامة حول الليشمانيا. (B) التفاصيل الليشمانيا السيتوبلازم مع المسام النووي والشبكة الإندوبلازمية. (C) لمحة عامة عن T. البروسية. (D) التكبير عالية من T. البروسية النواة. (E) نظرة عامة حول E. الخلايا القولونية. N: نواة. V، فجوة، م، ميتوchondrion. NP، المسام النووي؛ F، السوط. FP، جيب سوطي. K، منشأ الحركة. ص، الريبوسومات. الحانات النطاق = 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): أمثلة لوضع العلامات البروتين باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وبولكلونل. (A) نظرة عامة حول S. الخباز. (B) Immunolabeling من اميلويد β مع أضداد GFP. (CD) مثال لوضع العلامات الميتوكوندريا مع الأجسام المضادة سينسيز المضادة للاعبي التنس المحترفين. (E) PORIN توطين في الغشاء الخارجي للالحبيبات الخيطية. تم الكشف عن بروتين (F) Fox2 في الحبيبات الخيطية التي كتبها immunolabeling. (G) توطين دينار Flabarin فيوالمقطع الطولي من السوط من الليشمانيا amazonesis. كل من الأجسام المضادة يتم الكشف باستخدام الأجسام المضادة 10 بولكلونل الذهب نانومتر. N، النواة. V، فجوة، م، الحبيبات الخيطية. الحانات النطاق = 200 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تيم هو وسيلة قوية لمراقبة التركيبية لعضيات الخلايا والأنسجة. Cryofixation / تجميد الاستبدال هو حاليا أفضل طريقة للحفاظ على حد سواء التركيب الدقيق والبروتين استضداد. المثبتات الكيميائية تخترق وتعمل ببطء شديد مما يتيح إعادة ترتيب الهيكلية قبل أن يتم تثبيت كاملة من التركيب الدقيق 2. على العكس من ذلك، cryofixation / تجميد استبدال يستقر على الفور الهياكل الخلوية (4). ومع ذلك، تتضمن تقنيات cryofixation / تجميد استبدال عدد من المعوقات والصعوبات مما يحد من مدى تطبيقها. وهذا يتعلق عينة، والتحف التجمد، تحقيق التقنية والتكلفة والمعدات. وقد مكنت هذه التقنية تجميد / تجميد استبدال الضغط العالي على درجة عالية من الحفاظ على تفاصيل الخلوية 6 و 7. في المقابل، يستخدم PF بالفعل لطب التوليدerving أشياء صغيرة علقت على أفلام رقيقة من الجليد غير متبلور 9. هنا، PF طريقة / تجميد استبدال للدراسات التركيبية وimmunolabeling يوفر صور ذات جودة عالية من الخمائر، والطفيليات، والتركيب الدقيق البكتيرية مقارنة بارتفاع ضغط الصور التجميد.
جودة تثبيت تعتمد على معدلات التبريد 18. في معدلات التبريد عالية والمياه في الدولة زجاجي ولا تظهر البنية البلورية مرئية على مستوى المجهر الإلكتروني. يحدث التزجيج فقط في طبقة سطحية رقيقة جدا (200 ميكرون في العام)، وبالتالي، فإن حسن سمك تجميد يقلل تدريجيا من سطح العينة إلى الطبقات الداخلية 4. في الخلايا النباتية، يمكن طلاء شمعي أو مسافات مملوءة بغاز تباطؤ معدلات التبريد. مع PF، والمدهش، لم يلاحظ أي انخفاض في جودة الأداء تجميد. في كل التجارب، والنسبة المئوية للخلايا المجمدة جيدا هو ز reater من 50٪. تتفاوت هذه النسبة بين 50٪ إلى أكثر من 90٪ وتعتمد على معايير مختلفة (مستنبت، وحالة الفسيولوجية للخلايا، ودرجة الحرارة في الهواء الطلق، ومستوى الرطوبة). وكما ذكر أعلاه، وتشكيل بلورات الثلج يدمر بنية الخلية وبلورات الثلج مرئية ولا سيما في فجوات. في عملية الاستبدال / تجميد PF، يجب إيلاء اهتمام خاص لدرجة حرارة التجمد. يجب عدم تنفيذ الخطوة تجميد استبدال فوق -82 ° C، وإلا، سيتم تحويل الماء الزجاجي في المياه البلورية. لتجنب تشكيل الضرر وضوح الشمس الجليد، يتم استخدام cryoprotectant حاليا، ولكن هذا يؤدي إلى تغييرات في التركيب الدقيق للخلايا (19). قد تحتوي على الخميرة والبكتيريا والطفيليات والثقافة وسائل المكون الذي هو عامل واق من البرد. وفي هذا السياق، تقرر عدم استخدام cryoprotectant إضافية من أجل أن تكون أقرب ما يمكن إلى الدولة الخلوية الفعلية.
ve_content "> نجاح PF / استبدال تجميد يعتمد على العديد من الخطوات الهامة خلال مرحلة تطوير الأسلوب. أولا، النقطة الحرجة هي للحصول على التناسق المناسب من الكريات. يجب أن يكون بيليه تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي المدمجة بما يكفي لتكون توالت من على الشبكة المجهر الإلكتروني. إذا كان بيليه هو الميثاق جدا، والحل تجميد الاستبدال لا يمكن أن تخترق هذا التراجع، وسوف التركيب الدقيق لا يتم الاحتفاظ بشكل جيد. على العكس من ذلك، إذا كان بيليه ليس المدمجة بما فيه الكفاية، مستنبت بقايا قد تتطور بلورات الثلج ويضعف التركيب الدقيق خلية. للحصول على التناسق المناسب من الكريات من أنواع مختلفة من الخلايا، فمن الضروري احترام الشروط الثقافة للحصول على عدد أشار الخلايا والمعلمات الطرد المركزي المشار إليها في البروتوكول (انظر أعلاه) لجميع أنواع الخلايا. ومع ذلك، فإن كمية المواد وضعه على الشبكة النحاسية ليست حرجة. يمكن اختبارها احجام مختلفة. ثانيا، ونوع الشبكة ثايستخدم ر كدعم مهم. تم اختبار العديد من الذهب والنيكل والنحاس وشبكات مع أحجام شبكة مختلفة. تم الحصول على أفضل النتائج مع 400 شبكة الشبكة النحاسية بقضبان رقيقة. ثالثا، فيما يتعلق الخطوة تجميد، ويفضل كوب من النحاس الأصفر لتسييل غاز البروبان. البروبان السائل في كوب النحاس يميل إلى تجميد، وبالتالي يعقد التجربة. وأخيرا، يجب أن تتلاعب العمل بسرعة وفي الظروف الباردة لتجنب عينة عرضية الاحماء. اذا حدث ذلك، يجب أن يتم تجاهل العينة. على سبيل المثال، لمنع ارتفاع درجة حرارة العينة، وملاقط يجب أن يكون قبل تبرد قبل استعمالها، ويجب أن تكون مستعدة المتوسط استبدال تجميد متقدما قبل الإجراء. يجب أيضا أن تستخدم ملاقط المبردة خلال عملية التجميد يغرق becauseif تجميد يغرق يتحقق دون تجميد ملاقط، والكثير من أشكال الدخان ووانخفض ملاقط في البروبان (بسبب درجة الحرارة المرتفعة / تبادل البارد). وهذا له حتما تأثير على معدلات التبريد. اختبارات مع sampl الدراسيويبدو أن وفاق المجمدة مع ملاقط رفع التجميد لا يتم تجميدها بشكل صحيح.وعلاوة على ذلك، واستخدام المواد الكيميائية الخطرة مثل O S O 4 و خلات اليورانيل في المتوسط تجميد استبدال يتطلب، أثناء إعداد الحلول وتجميد إحلال عملية، للعمل تحت غطاء الدخان مع PPE كافية. لمنع تسرب أوسو 4 واستنشاق الأبخرة، يجب أن يكون cryovials من الصعب O-عصابة للتأكد من أن أنابيب تبقى مغلقة أثناء عملية تجميد تبديل. لمنع التعرض غير الضروري إلى بخار الأوسيميوم أثناء إعداد المتوسطة تجميد الاستبدال، أمبولة أوسو 4 لا يمكن كسرها في قارورة زجاجية. وجود شظايا الزجاج في كتلة الراتنج بعد إدراج يمكن تجنبها باستخدام نقل الماصات غرامة طرف خلال يشطف acetones وخطوات دمج. أداء خطوة إدراج تحت مجهر حلقة وتحقيق أقسام شبه رقيقة تسمح أيضا للتحقق من أنه لا توجد شظايا الزجاج.عندما لا يمكن إجراء التجارب تحت غطاء الدخان (وخاصة في الخطوة الأولى من عملية الاستبدال تجميد)، استخدم جهاز للتنفس تنقية الهواء مع خراطيش بخار. كما يجب أن يكون مناور الحذر عند العمل في الظروف الباردة مع النيتروجين السائل أو خلال خطوات التجميد. ينصح استخدام القفازات والنظارات. وعلاوة على ذلك، البروبان قابلة للانفجار، لذلك يجب إجراء إسالة في غرفة جيدة التهوية أو تحت غطاء الدخان ويسمح أي اللهب المكشوف.
وأظهرت العديد من المقالات التي، على مجموعة واسعة من عينات مثل أنسجة المخ، ورقة اللبلاب، أو نصائح الجذرية للA. thaliana وN. benthamiana، تم تحسين الحفاظ على التركيب الدقيق مع تقنية HPF مقارنة تثبيت الكيميائية 20 و 21. مع PF، أجريت التجارب على الخلايا في تعليق. لذلك، ليس هناك ما يدل على نجاح هذه التقنية حول larger العينات مثل الأنسجة. هناك حاجة لإجراء لمعالجة هذه النقطة تجارب أخرى. ومع ذلك، فقد تم اختبار طريقة بنجاح مع الفطريات الخيطية Podospora الوز أنه لم يتم عزل الخلايا بل هو من شكل أفطورة 22.
يمثل الطريقة المعروضة في هذه المقالة تحسنا ملحوظا مقارنة مع الأساليب الحالية لتثبيت الكيميائي أو HPF. على سبيل المثال، PF لا تتطلب معدات أو المواد الاستهلاكية مكلفة على النقيض من HPF 23. كما يجب الحرص لأن تقنية HPF تستخدم كمية كبيرة من النيتروجين السائل (حوالي 80 L في التجربة). مع هذه التقنية المقترحة، ميزة رئيسية واحدة هي أن أي معدات مهمة ضرورية 23. وهكذا، فإن تكلفة التجربة هي أقل بكثير (حوالي مائة مره أرخص). وهناك ميزة أخرى هي أنه لا حاجة لخبرة خاصة لأن تقنية سهلة الاستخدام. وعلاوة على ذلك، وتجهيز العينات سو PF / تجميد استبدال أقصر بكثير من HPF / تجميد الاستبدال بسبب عملية الاحترار الذي يستغرق أقل من 6 ساعات بدلا من 24 ساعة 24. أنها ليست أكثر استهلاكا للوقت من التثبيت الكيميائية التقليدية. ميزة هي أن التركيب الدقيق الخلوي هو الحفاظ تماما مع الحد الأدنى من القطع الأثرية وهو أقرب بكثير إلى حالته الأصلية الخلايا. إن تطبيق هذه التكنولوجيا سيكون بالتأكيد من استخدام لدراسة مختلف الأحداث البيولوجية السريعة أو في توطين البروتينات بدقة عالية للخلايا المزروعة في التعليق ولعينات من سمك القليلة ميكرومتر، مثل خيوط فطرية 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم تضارب المصالح.
Acknowledgments
ونعرب عن امتناننا لM. Bouchecareilh، E. Tétaud، S. Duvezin-Caubet، وA. ديفين لما قدموه من مساعدة والتعليقات على المخطوطة. ونحن ممتنون إلى القطب التصوير الالكتروني للمركز التصوير بوردو حيث تم التقاط الصور. وأيد هذا العمل من قبل المركز الوطني الفرنسي للبحث العلمي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8.5 mL | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
