Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Published: May 5, 2017 doi: 10.3791/54874
Automatic Translation
1, 1
1Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires, Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5095, Université de Bordeaux

Summary

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

Abstract

הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) הוא כלי יוצא דופן לחקר ultrastructure תא, כדי למקם חלבונים ולדמיין מתחמי macromolecular ברזולוציה גבוהה מאוד. עם זאת, כדי להתקרב ככל האפשר אל למצב הטבעי, שימור מדגם מושלם נדרש. קיבוע במיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונאלי (EM) עם אלדהידים, למשל, אינו מספק שימור ultrastructural טוב. החדירה האיטית של fixatives גורמת ארגון מחדש תאים ואובדן מרכיבי תא שונים. לכן, קיבוע EM קונבנציונאלי אינו מאפשר התייצבות מיידית ושימור מבנים antigenicity. הבחירה הטובה ביותר לבחינת אירועים תאיים היא להשתמש cryofixation ואחריו שיטת קיבוע הקפאה-ההחלפה שמחזיקה תאים במצב הטבעי שלהם. בלחץ גבוה הקפאה / להקפיא-החלפה, השומרת על שלמות ultrastructure הסלולר, היא השיטה הנפוצה ביותר, אך דורשת expensive ציוד. הנה, שיטת קיבוע הקפאה קלה לשימוש וזול ואחריו-החלפת הקפאה עבור תרביות תאי השעיה מוצגת.

Introduction

לדוגמא ההכנה היא קריטית להצלחה של כל מחקר במיקרוסקופ אלקטרונים. קיבוע קונבנציונלי EM היה השיטה העיקרית לתיקון רקמות או תאים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) 1. ראשית, אלדהידים ו tetroxide אוסמיום משמשים כדי לתקן את חומר כימי בטמפרטורת החדר. ואז, החומר הוא מיובש עם ממיסים אורגניים, חדרו, ומוטבעים שרף אפוקסי. שיטה זו תלויה בשיעור החדירה של fixatives לתוך התא. כתוצאה מכך, הממצאים והפקת תכני הסלולר בדרך כלל הם נצפו 2.

Cryofixation הוא בבירור אלטרנטיבה טובה יותר לשימור מבנים הסלולר 3, להשאיר אותן ללא פגע. האיכות הגבוהה ביותר של תמונות TEM 4 בסעיפי שרף דקים ניתן להשיג באמצעות שיטת החלפת cryofixation / ההקפאה. מטרת טכניקה זו היא להשיג דו מזוגגתדגימות ological ללא היווצרות גבישי קרח או גבישי קרח המכילים קטנים מספיק כדי לא לפגוע ultrastructure של התאים. בלחץ גבוה הקפאה (HPF) ו cryofixation אולטרה-מהירה, אשר נקרא גם לצלול מקפיא (PF), הן שתי שיטות cryofix דגימות. HPF שמגביל מולקולות בתא מיידי ונמנע את הנזק שנגרם על ידי קיבוע EM קונבנציונאלי. ישנם מספר סוגים של מכונות הקפאה והתקני החלפה אוטומטיות פותחו 5. מכונות ההקפאה ומתכלה (החנקן נוזלי, דגימת ספקים, וכו ') הם יקרים, אבל הם מאפשרים הפקת micrographs אלקטרונים איכותי 6, 7. PF היא טכניקה ששימשה בשנת 1950 המוקדמות והוא מתואר בספרות פשוטה וזולה 8 .During ההליך PF, המדגם מוכן קפוא בקצב מהיר כדי להשיג גבישי קרח במידות פחות מ 3 עד 5 ננומטר. לשם כך, המדגם הואצלל לתוך קריוגן נוזלי, כגון אתאן, פרופאן, או תערובת אתנית- propane. מאז 1950, שיפורים של PF נעשו כדי להפוך את הטכניקה הזו זמינה למספר גדול יותר של משתמשים. הקפאה בלחץ גבוה היא כרגע הדרך קיימא רק להקפיא מגוון רחב של דגימות עבה יותר מ 50 מיקרומטר (עד עובי של 200 מיקרומטר עבור דגימות בצורת דיסק) 5 , ואילו PF נעשה שימוש נרחב על התמונה אובייקטים קטנים (<100 ננומטר ), כגון קומפלקסים macromolecular מושעה בסרט דק של קרח אמורפי 9 . דגימות גדולות יותר, למשל תאים אוקריוטים, יכולים להיות cryofixed על ידי PF, אבל דורש מחזיקי הדגימה, כגון צינורות נחושת נימי או מערכות כריך 8 , 10 , 11 .

הנה, מהיר לשימוש, קל לשימוש ו עלות נמוכה לצלול להקפיא / להקפיא, תחליף הטכנולוגיה שמיש עבור תרבויות תאים ההשעיה שונים מוצג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת Formvar Grid לקולנוע

הערה: בצע מניפולציה כלורופורם תחת במנדף שימוש בציוד מגן אישי (כפפות, חלוק מעבדה, משקפיים). השתמש 400 רשתות נחושת מיקרוסקופ אלקטרוני רשת. עם סוגי רשת אחרים (בגדלי רשת אחרים, זהב רשתות ניקל), איכות ההקפאה היא גרועה.

  1. כן פתרון 100 מיליליטר של 0.3% formvar כלורופורם. אפשר לו להתמוסס בין לילה ללא תסיסה.
  2. שים 400 רשת (מספר חורים לאינץ 'מרובע) רשתות אלקטרונים microscopycopper (בקוטר 3.05 מ"מ) בקבוקון זכוכית (בגובה 3 ס"מ קוטר 2 ס"מ) המכיל אצטון. מערבב את בקבוקון הזכוכית עם תנועה מעגלית של היד. הסר את אצטון עם טפטפת העברת פלסטיק. אפשר ממס להתאדות עבור 5 דקות. מעביר את הרשתות על ידי שפיכה אותם על גבי נייר סינון ולאפשר להם להתייבש במשך 5 דקות.
  3. פולנית זכוכית שקופית 76 x 26 מ"מ 2 על ידי מנגב אותו עם מטלית נטולת סיבים עד מבריק / חלקלק.
  4. קחו crystallizer (קוטר 15 ס"מ, גובה: 7 ס"מ קיבולת 1200 מ"ל) ולמלא אותו עד אפס מקום עם מים מזוקקים. נקו את משטח המים על ידי העברת בר זכוכית מעל פני השטח פעמיים כדי להסיר אבק.
  5. החזק את שקופית הזכוכית בין שתי אצבעות ולטבול אותו בתמיסת formvar במשך כמה שניות. החזק אותו זקוף לייבש תחת כוס הפוכה עבור 5 דקות.
  6. כאשר הסרט הוא יבש, להבקיע את הקצוות של שקופית הזכוכית עם סכין גילוח חד להגדיר את הגבולות של הסרט להיעקר משקופית.
  7. קח נשימה עמוקה מתנשף בכבדות לשקופית כדי לקבל שכבה של אדי מים על ומתחת לסרט להפוך את הסרט אטום מעט ולשפר את הנראות שלה.
    1. מיד לצוף הסרט על פני המים crystallizer ידי נגיעה בתחתית המגלשה עם בזווית של כ 30 מעלות. תן שחרור הסרט משקופית לקלף אותו על פני מי crystallizer. משוך בעדינות את הסרט עםפינצטה, במידת הצורך.
  8. בעדינות להניח את הרשתות עם פנים כלפי מטה על הסרט צף על פני המים באזורים שנמצאים של בעובי הנכון (כ 10 ננומטר) וללא קמטים.
  9. תרים את הסרט על ידי כיסוי הרשתות עם נייר יוסף כפי שהם צפים על פני מי crystallizer.
    1. החזקת הנייר יוסף ביד אחת, לגעת בקצה אחד של נייר יוסף אל קצה אחד של הסרט. חכה עד שהנייר יוסף הוא רטוב לגמרי. הסר את הנייר יוסף עם הרשתות התקועות על.
  10. מניח את הרשתות עבור 24 h בצלחת פטרי מכוסה לייבוש סופי ואחסון לפני השימוש בטמפרטורת חדר.

2. הכנת בינוני Freeze-החלפה

הערה: tetroxide אוסמיום (OSO 4) ו אצטט uranyl הם כימיקלים מסוכנים. טפל אותם במנדף תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כולל חלוק מעבדה וכפפות. fOLLאווה אזהרות הבטיחות לטיפול (OSO 4) ו יצטט uranyl. השתמשו cryovials O-Ring כדי למנוע דליפה של Oso 4.

  1. מחקרים ultrastructural
    1. שים אמפולה 4 כוס Oso בבקבוק זכוכית.
    2. לשבור את האמפולה ידי ניעור הבקבוק.
    3. הוספת נפח מתאים של אצטון 100% כדי להשיג ריכוז 4% סופי.
    4. מערבבים ומוציאים 1.5 aliquots מ"ל לתוך 1.8 מ"ל cryovials.
  2. immunolabeling חלבון
    1. מניחים 0.05 גרם של אצטט uranyl בבקבוק זכוכית.
    2. להוסיף 50 מ"ל של 100% אצטון.
    3. מערבבים את הפתרון עם בוחש מגנטי. כאשר הפתרון מתברר, לסנן אותו באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
    4. לוותר 1.5 aliquots מ"ל לתוך 1.8 cryovials מ"ל.
      הערה: הכן את cryovials המכיל בינוני הקפאה-החלפה לפני תהליך הקפאת הצעד ולשמור אותם במקפיא -84 מעלות צלזיוס. הפוך את בקבוק הזכוכית להשליך אתOSO 4 אמפולה של פסולת מסוכנת.

3. הכנת תאים

הערה: שלב זה הוא קריטי להצלחת השיטה. עבור כל סוגי התאים, לגדל תאים כדי לקבל את המספר המצוין של תאים. צנטריפוגה בצינור המצוין בזמן ומהירות שצוין.

  1. כדי להשיג את העקביות המתאימה של כדורי סוגי תאים שונים, גדלי תאים כדלקמן:
    1. עבור שמר האפייה ואת שמר החלוקה, לחסן שמרים ב 5 מ"ל של מדיום נוזלי מינימלי או מלאה. דגירה לילה בשעה 28 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של תרבות הלילה. לדלל תאים שמרים כדי OD 600 של 0.2 ב 50 מ"ל מדיום סלקטיבית טרי. המשיכו דגירת תאים ב 28 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 1 x 10 9 תאי שמרים 7.
    2. עבור השוטון שושנת יריחו, inoטפילים culate ב 5 מ"ל של AM בינוני עם 7.5% FCS (נסיוב עגל עוברית). דגירה לילה בשעה 24 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). למדוד את OD 600 של התרבות לילה. לדלל תאים טפילים ל OD 600 של 0.2 ב 50 מ"ל מדיום סלקטיבית טרי. המשיכו דגירת תאים ב 24 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 5 x 10 8 תאים טפילים 12.
    3. עבור Trypanosoma brucei, לחסן טפילים ב 5 מ"ל של מדיום SDM-79 עם 10% FCS ו 30 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin. דגירה לילה בשעה 27 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). למדוד את OD 600 של התרבות לילה. לדלל תאים טפילים ל OD 600 של 0.2 ב 50 בינוני סלקטיבית טריה מיליליטר. המשיכו דגירת תאים ב 27 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 5 x 10 8 תאים טפילים 13.
    4. עבור Escherichia coli, לחסן חיידקים 5 מ"ל של מדיום DYT עם 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין. דגירה לילה בשעה 37 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). למדוד את OD 600 של התרבות לילה. לדלל חיידקים תאים ל OD 600 של 0.2 ב 50 מ"ל מדיום סלקטיבית טרי. המשיכו דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 5 x 10 10 חיידקי תאים 14.
      הערה: לאחר דגירת הלילה, תאים בתרבית עשויה להיות בשלב צמיחה או לוגריתמים או נייח. מאוד גדל לאט זני תא עשויים לדרוש פעמי דגירה ליותר מלילה אחד, או הרכבה של מספר רב יותר של תאים, כפי שנקבעו באופן אמפירי.
  2. עבור כל סוגי התאים, להעביר בינוני תרבות המכיל את התאים צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל עבור 3 דקות ב 1500 x גרם.
  3. הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה של כל סוגי התאים ב 1 מיליליטר של תרבית תאים הבינונית הרלוונטית.
  4. צנטריפוגה כל סוגי התאים בצינור microcentrifuge עבור 1 דקות ב 3900 x ז. להסיר לחלוטין את supernatant.
  5. שמור את התאים על קרח.

s = "jove_title"> 4. עיבוי של פרופאן

הערה: טפל חנקן נוזל בזהירות. יש להשתמש בציוד מגן אישי כולל cryogloves ו גוגל. פרופן הוא נפיץ, כך לבצע העיבוי בחדר מאוורר היטב או תחת במנדף. אין לפתוח באש מותרת.

  1. שים על 150 מ"ל של חנקן נוזלי ב מגש קלקר. מניחים כוס פליז (גובה 3.6 ס"מ, קוטר 2 ס"מ מ"מ 1.5 עובי) בחנקן נוזלי להקפיא אותו. אל תתנו החנקן הנוזלי לחדור לתוך כוס פליז.
  2. מתן עד הבועות להתפוגג להיות בטוח כי כוס פליז מוקפאת.
  3. שים את הצינור מחובר גליל פרופאן במגע עם קיר כוס פליז.
  4. בעדינות לפתוח את שסתום פרופאן גליל.
    הערה: בשלב זה, את זרימת הגז לנוזל בגביע פליז.
  5. עצור את ההתנזלות ידי סגירת שסתום פרופאן הגליל במהירות הסרת צינור הגז.
  6. מלא את מגש הקלקר עם ני הנוזלtrogen עד 5 מ"מ מהחלק העליון של גביע פליז. אל תתנו החנקן הנוזלי לחדור לתוך כוס פליז.

מקפיא פלאנג 5. המדגם

  1. שים על 200 מ"ל של חנקן נוזלי ב מגש קלקר. להקפיא כוסות פליז קטנה (בגובה 1.5 ס"מ קוטר 2.5 ס"מ ועובי 1 מ"מ) על ידי הצבת אותם בחנקן נוזלי. שים כוס אחת עבור מדגם תא השעיה אחד. היזהר שלא לערבב דגימות. לשם כך, לשים מדגם 1 כוס 1, מדגם 2 בכוס 2, וכו '.
  2. להקפיא את פינצטה בצלילה טיפ שלהם בחנקן נוזלי.
  3. תתקע לו איזמל מנתחי קצה כפול הגלולה שהושגה 3.5.
  4. בעזרת פינצטה, לקחת לרשת מיקרוסקופיה נחושת 400 רשת מצופה formvar מוכן בסעיף 1.
  5. באמצעות איזמל המנתחים, במקום ירידה של הגלולה שהושגה 3.5 על הרשת. נסה גדל טיפה שונה (למשל 2, 5 ו 10 μL).
  6. מאוד במהירות לצלול לרשת שבידי פינצטה לתוך גן פרופן נוזלמדורג בסעיף 4 ומערבבים את הרשת עם תנועה מעגלית במשך כמה שניות.
  7. במהירות להעביר לרשת קפואה עם פינצטה אל הכוס הקטנה מפליז הקפוא בסעיף 5.1.
    הערה: עבור כל דגימה, לעשות לפחות 3 רשתות. תמיד להקפיא את פינצטה לפני לקיחת רשת נחושת.

6. החלפת Freeze

הערה: tetroxide אוסמיום הוא פוטנציאלי ידיף, כך להשתמש הנשמת טיהור אוויר עם מחסניות אדי. הקפאה מקבעת בחנקן נוזלי לפני הקפאת צעד היא גם פתרון.

  1. עבור מחקרי ultrastructure, לפתוח את צינורות cryovial 1.8 מיליליטר המכילים בינוני הקפאה-החלפה מוכנה בסעיף 2.1. עבור מחקרי immunolocalization, לפתוח את צינורות cryovial 1.8 מיליליטר המכילים בינוני הקפאה-החלפה מוכנה בסעיף 2.2. מניחים את הכובע על cryovials.
  2. להקפיא את פינצטה בצלילה טיפ שלהם בחנקן נוזלי.
  3. במהירות להסיר את הכובע ולהעביר את הרשתות קפואות in עד cryovials באמצעות פינצטה.
  4. שים את הכובע בחזרה על cryovials.
  5. חזור על הפעולה עבור כל רשת של כל דגימה.
  6. סגור את כל המכסים ומערבבי cryovials עם תנועה מעגלית של היד כדי להבטיח את הדוגמות הן במדיום הקפאה-ההחלפה.
  7. מניחים את cryovials בקופסה אטומה עבור 3 ימים במקפיא C -84 ° במהלך תהליך ההקפאה-החלפה.

7. התחממות לדוגמא

  1. מחקרים ultrastructure
    1. קח את cryovials ב מגש קלקר (כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה) במקפיא C -30 °. מניחים אותם במקפיא -30 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
    2. מניחים את cryovials במקפיא C -15 ° עבור 2 h. מניחים את דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ולאחר מכן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את מדיום החלפת הקפאה עם טפטפת העברת פלסטיק. להוסיף כ 500 μL של אצטון 100%.
    4. מערבבים את 1.8 מ"ל cryovialעם תנועה מעגלית של היד במהירות לשפוך אצטון (1.5 מ"ל) המכיל את רשתות בקבוקון זכוכית (בגובה 3 ס"מ ו ס"מ קוטר 2).
    5. יש לשטוף אותו cryovial עם 1 מ"ל של אצטון 100% כדי להיות בטוח שהעברת כל רשתות. מערבב את cryovial עם תנועה מעגלית של היד ושופך את תוכן cryovial לתוך בקבוקון זכוכית.
    6. יש לשטוף כל בקבוקון זכוכית עם 3 מ"ל של 100% אצטון 3 פעמים במשך 10 דקות.
    7. פעל על פי ההליכים הטבעה והכלה כמתואר התייחסות 15. להספיג את הדגימה עם ריכוז גדל והולך של שרף אפוקסי ב אצטון (25%, 50%, ו 75%) ולהטביע המדגם עם שרף אפוקסי 100% בכמוסות ג'לטין.
  2. immunolabeling מחקרים
    1. קח את 1.8 מ"ל cryovials ב מגש קלקר (כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה) למקפיא -30 מעלות צלזיוס.
    2. מניחים את cryovials עבור 2 h במקפיא C -30 °.
    3. In a -30 ° C במקפיא, לבחוש cryovial עם התנועה המעגלית של היד במהירות לשפוך את המדיום החלפה הקפאת בבקבוקון פוליפרופילן (גובה 5 ס"מ קוטר 1.5 ס"מ).
    4. החלף את מדיום החלפת הקפאה עם 2 מיליליטר של מדיום הקפאה-החלפה טריה.
    5. מניחים את הצנצנת פוליפרופילן למוצרי 2 h במקפיא C -30 °.
    6. יש לשטוף את הבקבוקון פוליפרופילן למוצרי 1 h עם 2 מ"ל של אצטון 100% ושלוש פעמים עבור 1 h עם 2 מ"ל של אתנול 100%.
    7. פעל על פי ההליכים הטבעה והכלה כמתואר התייחסות 15. להספיג את הדגימה עם ריכוזים גוברים של שרף אקרילי (25%, 50%, ו 75% ב אצטון) ולהטביע מדגם עם שרף אקרילי 100% בכמוסות ג'לטין.

ויזואליזציה 8. דוגמאות

  1. לאחר הטבעה, לעשות 80 חלקים דקים ננומטר של דגימות עם ultramicrotome. השוו את החלקים עם ציטרט להוביל 2% בטמפרטורת החדר למשך 1 דקההתחת = "Xref"> 15.
  2. שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים 80 קילו או 120 קילו להתבונן בסעיפים 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במאמר זה, שיטת הקפאה קלה לשימוש וזול צעד עבור ultrastructural (איורים 1 ו איור 2) ו immunolabeling (איור 3) מחקרים מוצגת. אנו מראים כי אין זה הכרחי כדי לקבל ציוד מיוחד עבור הליך הקפאה-ההחלפה וכי הליך ההתחממות לוקח פחות מ 6 ח במקום 24 h באמצעות מערכת ייעודית.

שיטת PF / הקפאה-החלפה הצליחה לשמר המשופר של המבנים התאיים של אפיית Saccharomyces (איור 1A ו 1D-H), שמר חלוקה (איור 1B ו C), השוטון שושנת יריחו (איור 2 א 'וב'), אי-קולי (איור 2 C ו- D), ו Escherichia Trypanosoma brucei (איור 2E). המבנים אינם מצומקים בציטופלסמה מופיעה צפופה. יתר על כן, את הקרומים יהיו חלקים, המהווה הוכחת שימור טוב. כל האברונים, כגון גרעין (איור 1A, B D ואיור 2A -D), המיטוכונדריה (איור 1A -C, E ו- H), ו וקואולות (איור 1A, C, F ו- H), ניתן לזהות באופן מושלם . בגרעין, קרום כפול ויוצר מעטפת גרעין, נקבוביות גרעין, גוף מוט ציר, ו ריבוזומים המצורפת על הקרום החיצוני של מעטפת הגרעין גלוי בבירור (איור 1D ואיור 2B, 2D). במיטוכונדריה, את invaginations הקרום הפנימי, הנקרא cristae (איור 1E), גלוי לעין. וקואולות הן אברונים קריטיים בגלל גבישי קרח גדולים יכולים לפתח בקלות בתוכם. כמו באיור 1, וקואולות נשמרים בצורה מושלמת בלי נזק גביש קרח (איור 1A, C, F, ו- H). לבסוף, כמו ultrastructure נשמר היטב, אירועים ביולוגיים שונים ניתן לראות ונותחו, כגון autophagy (איור 1C, F ו- H), מורפולוגיה המיטוכונדריה (איור 1E), שלפוחית הפרשה (איור 1G), וחלוקת גרעיני (איור 1A , איור 2 B, nd 2C).

בלוקליזציה באתרו של חלבונים עם נוגדנים ספציפיים הוא אחת הטכניקות החזקות והפופולריות ביותר בביולוגיה של תא. ניתן להשתמש PF גם כשיטה לבצע חלבון immunolocalization. הליך זה משמר antigenicity חלבון, כאמור לעיל, זהות אברון. נוגדנים שונים מיקוד חלבונים שמרים שונים, כגון 7 synthase אנטי-ATP, 15 (איור 3 א, 3 ג ו 3D), אנטי-GFP (איור 3B), 16 נגד porine (איור 3 E), ו 17 נגד fox2 (איור 3F), כבר נבדק. כמו כן ניתן לבצע את הניסויים האלה על אורגניזמים שונים, כגון שושנת יריחו 12.

נַעֲרָה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1: תמונות TEM של מחקרים ultrastructural של שמרים שמר האפייה ואת שמר החלוקה. (א) סקירה של אפיית ס. (ב) סקירה של pombe ס. (ג) חלק בציטופלסמה ס pombe. (ד) גדלה גבוהה של גרעין. (ה) פירוט של מיטוכונדריון עם cristae נראה בבירור. (F) מורפולוגיה vacuolar במהלך autophagy. (G) ניצן שמרים עם שלפוחית הפרשה בפנים. דוגמא (H) של קשר אינטימי בין וקואולות ואת המיטוכונדריה במהלך תהליך autophagy. N, גרעין; V, vacuole; מ ', מיטוכונדריון; SV, הפרשת vesiCles; r, ריבוזומים. ברים בקנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תמונות TEM של מחקרים ultrastructural של שושנת יריחו amazonesis, Trypanosoma brucei ו E. coli. (א) סקירה של שושנת יריחו. Detail (B) של הציטופלסמה שושנת יריחו עם נקבוביות הגרעין ואת reticulum endoplasmic. (ג) סקירה של ט brucei. (ד) הגדלה גבוהה של גרעין ט brucei. סקירה כללית (E) של תא חיידק. N: גרעין; V, vacuole; מ ', מיטוchondrion; NP, נקבוביות הגרעין; F, השוטון; FP, כיס flagellar; K, kinetoplast; r, ריבוזומים. ברים בקנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: דוגמאות של תיוג חלבון באמצעות נוגדן מונוקלונלי ו polyclonal. (א) סקירה של אפיית ס. (ב) immunolabeling של עמילואיד-β עם נוגדנים אנטי-GFP. (CD) דוגמה של תיוג המיטוכונדריה עם נוגדנים synthase אנטי-ATP. (ה) לוקליזציה Porin בקרום החיצוני של מיטוכונדריון. (F) חלבון Fox2 מזוהה מיטוכונדריון ידי immunolabeling. (G) לוקליזציה של LD Flabarin בבסעיף א אורך של השוטון של שושנת יריחו amazonesis. כל הנוגדנים מזוהים באמצעות 10 נוגדנים polyclonal זהב ננומטר. N, גרעין; V, vacuole; מ ', מיטוכונדריון. ברים בקנה מידה = 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TEM היא שיטה רבת עוצמה עבור תצפית ultrastructural של אברונים, תאים, רקמות. Cryofixation / הקפאה-החלפה היא כיום השיטה הטובה ביותר לשימור הוא antigenicity ultrastructure והחלבון. Fixatives הכימי לחדור ולפעול ובכך לאפשר שחלופים מבניים מאוד לאט לפני ההתייצבות המלאה של ultrastructure 2. לעומת זאת, cryofixation / הקפאה-החלפה מיידית מייצב מבנים הסלולר 4. עם זאת, cryofixation / טכניקות הקפאה-החלפה כוללות מספר האילוצים וקשיים ובכך מגבילים המגוון של יישום שלהם. זה נוגע מדגם, חפצי הקפאה, מימוש של הטכניקה, עלות, וציוד. טכניקת ההחלפה-הקפאה בלחץ גבוה הקפאה / אפשרה רמה גבוהה של שימור פרטים הסלולר 6, 7. לעומת זאת, PF כבר משמש OBSארווינג חפצים קטנים מושעים על שכבות דקות של קרח אמורפי 9. הנה, PF / שיטת הקפאה-החלפה ללימודי ultrastructural ו immunolabeling מספקת תמונות באיכות גבוהה של שמרים, טפילים, חיידקים ו ultrastructure להשוות תמונות הקפאה בלחץ גבוה.

איכות קיבוע תלויה שיעורי קירור 18. בשעת שיעורי קירור גבוהים, מים נמצאים במצב זגוגי אינו מציגים מבנה גבישים גלוי ברמה המיקרוסקופית אלקטרונים. Vitrification מתרחשת אך ורק בשכבה דקה מאוד שטחית (200 מיקרומטר בכלל), ולכן, הקפאת עובי טובה תקטן בהדרגה מפני השטח של הדגימה אל השכבות הפנימיות 4. בתאי צמח, ציפוי שעווה או חללים מלאים בגז יכול להאט את שיעורי קירור. עם PF, באופן מפתיע, לא חלה ירידה באיכות הביצוע מקפיא נצפתה. בכל הניסויים, באחוז התאים קפוא גם הוא גרם reater מ 50%. אחוז זה משתנה בין 50% ליותר מ 90%, והוא תלוי בפרמטרים שונים (בינוני תרבות, מצב פיסיולוגי של התאים, טמפרטורה חיצונית, ורמת לחות). כאמור לעיל, היווצרות גבישי קרח הורס את מבנה התא גבישי קרח גלויים במיוחד וקואולות. בתהליך החלפת PF / ההקפאה, תשומת לב מיוחדת יש לשלם את טמפרטורת הקיפאון. צעד החלפת ההקפאה אסור להתבצע מעל -82 ° C, אחרת, המים הזגוגי יהפכו מי גבישים. כדי למנוע היווצרות של נזק גביש קרח, cryoprotectant משמשת כיום, אבל זה מוביל שינויים ב ultrastructure של תאים 19. שמרים, חיידקים, טפילים מדיומים תרבות עשוי להכיל מרכיב כי הוא סוכן cryoprotective. בהקשר זה, הוחלט שלא להשתמש cryoprotectant נוסף על מנת להיות קרוב ככל האפשר למצב הסלולר בפועל.

ve_content "> ההצלחה של החלפת PF / הקפאה תלוי שלבים קריטיים רבים במהלך שלב הפיתוח של השיטה. ראשית, נקודה קריטית היא להשיג העקביות המתאימה של הכדורים. הגלולה שהושגה לאחר צנטריפוגה חייבת להיות קומפקטית מספיק כדי להיות מגולגל נערך על רשת במיקרוסקופ אלקטרונים. אם הגלולה היא קומפקטית מדי, הפתרון הקפאת-ההחלפה לא יכול לחדור הטיפה, ואת ultrastructure לא יהיה השתמר היטב. לעומת זאת, אם הגלולה אינה קומפקטית מספיק, מדיום תרבות השאריות עשוי להתפתח גבישי קרח ולפגוע ultrastructure התא. כדי להשיג את העקביות המתאימה של הכדורים מן סוגי התאים השונים, יש צורך לכבד את תנאי התרבות להשיג את המספר המצוין של תאים ופרמטרים צנטריפוגה בפרוטוקול (ראה לעיל) עבור כל סוגי תאים. עם זאת, כמות החומר לשים על הרשת הנחושת אינה קריטית. גדל אגל שונה ניתן לבדוק. שנית, tha סוג הרשתT משמש כתמיכה חשובה. זהב, ניקל כמה, ואת רשתות נחושת בגדלים רשת שונים נבדקו. התוצאות הטובות ביותר התקבלו עם רשת נחושת רשת 400 עם מוטות דקות. שלישית, לגבי הצעד המקפיא, כוס פליז עדיפה למוסס את פרופן. פרופן נוזלי בכוס נחושת נוטה להקפיא, ולכן, מסבכת את הניסוי. לבסוף, מניפולטור חייב לעבוד במהירות בתנאים קרים כדי למנוע מדגם מקרי חימום. אם זה קורה, המדגם חייב להיות מושלך. לדוגמא, כדי למנוע התחממות מדגמת, פינצטה חייב להיות טרום מקורר לפני השימוש בם מדיום החלפת ההקפאה חייב להיות מוכן היטב לקראת לפני ההליך. פינצטה מקורר גם חייב לשמש במהלך תהליך ההקפאה הצעד becauseif הקפאת הצעד ממומש בלי הקפאת פינצטה, הרבה צורות עשן כמו פינצטה הם צללו ב פרופאן (עקב חילופי חום / קור). זה בלתי נמנע יש השפעה על שיעורי הקירור. בדיקות עם samples קפוא עם פינצטה מההקפאה מופיע שלא יוקפא כראוי.

יתר על כן, שימוש בחומרים כימיים מסוכנים כגון O S O 4 ו אצטט uranyl במדיום הקפאת-החלפה דורש, במהלך תקופת ההכנה של פתרונות ולהקפיא-החלפה תהליך, לעבוד תחת במנדף עם PPE נאותה. כדי למנוע דליפה של Oso 4 ו שאיפת אדים, חייב להיות cryovials קשה O-Ring כדי להבטיח כי צינורות יישאר חתום במהלך תהליך ההקפאה-החלפה. כדי למנוע חשיפה מיותרת אדי אוסמיום במהלך תקופת ההכנה של מדיום הקפאה-החלפה, אמפולה OSO 4 ניתן לשבור בבקבוק זכוכית. הנוכחות של רסיסי זכוכית בגוש שרף לאחר הכללת יכול להימנע באמצעות קנס-טיפ טפטפות העברה במהלך שטיפות acetones וצעדים של הטבעה. ביצוע שלב ההכללה תחת לולאה המשקפת ואת מימוש הסעיפים חצי דקה גם מאפשר לאימות שאין רסיסי זכוכית.כאשר הניסויים לא יכולים להתנהל תחת במנדף (במיוחד בשלב הראשון של תהליך החלפת ההקפאה), להשתמש הנשמת טיהור אוויר עם מחסניות אדי. מניפולטור חייב גם להיות זהיר כאשר עובדים בתנאים קרים עם חנקן נוזלי או במהלך שלבים מקפיאים. שימוש כפפות ומשקפים מומלצים. יתר על כן, פרופאן הוא נפיץ, כך ההתנזלות חייבת להתבצע בחדר מאוורר היטב או תחת במנדף ולא לפתוח באש מותרת.

מאמרים אחדים הראו כי, על מגוון רחב של דוגמאות כגון רקמת מוח, עלה קיסוס, או טיפי שורש thaliana א ו נ benthamiana, לשימור ultrastructure משתפר עם טכניקת HPF לעומת קיבוע כימי 20, 21. עם PF, הניסויים בוצעו על התאים בתרחיף. לכן, אין אינדיקציה להצלחת הטכניקה הזו על larger דגימות כמו רקמות. ניסויים נוספים צריכים להתנהל להתייחס לנקודה זו. עם זאת, השיטה נוסתה בהצלחה עם פטריות filamentous Podospora anserina כי אינו מבודד תאיות אבל הוא דווקא של טופס תפטיר 22.

השיטה המוצגת במאמר זה מייצג שיפור משמעותי על פני השיטות הקיימות של קיבוע כימי או HPF. למשל, PF אינה דורשת ציוד או מתכלה יקרים בניגוד HPF 23. טיפול צריך גם לקחת בגלל טכניקת HPF משתמשת בכמות גדולה של חנקן נוזלי (כ 80 L לכל ניסוי). בעזרת הטכניקה המוצעת, אחד היתרונות הגדולים הוא שאף הציוד החשוב הוא הכרחי 23. לפיכך, העלות של ניסוי היא הרבה יותר נמוכות (כמאה פעמים זולות יותר). יתרון נוסף הוא כי אין מומחיות מיוחדת נדרשת מכיוון הטכניקה היא קלה לשימוש. יתר על כן, עיבוד מדגם Oו PF / הקפאה-החלפה קצרה בהרבה HPF / הקפאה-החלפה בשל תהליך ההתחממות שלוקח פחות מ 6 ח במקום 24 h 24. זה לא זמן רב יותר מאשר הקיבוע הכימי הקונבנציונלי. היתרון הוא כי ultrastructure הסלולר נשמר באופן מושלם עם חפצי מינימום הוא הרבה יותר קרוב למצב המקורי של התאים. היישום של טכנולוגיה זו בהחלט להועיל ללמוד אירועים ביולוגיים מהירים שונים או בתרגום חלבונים ברזולוציה גבוהה עבור תאים שגודלו השעיה ועל דגימות של עובי מיקרומטרים אחדים, כגון עובש פטרייתיים 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

תודתנו ל M. Bouchecareilh, E. Tétaud, ס Duvezin-Caubet, וא דווין לעזרה והערות שלהם על כתב היד. אנו מודים קוטב ההדמיה האלקטרוני של מרכז דימות בורדו איפה התמונות צולמו. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
Formvar Electron Microscopy Sciences 15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle Electron Microscopy Sciences 72947
Cryovials Electron Microscopy Sciences 61802-02
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19130
Glass vial 8.5 mL Electron Microscopy Sciences 64252
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 48851
Acetone Sigma 32201
Ethanol 100% Sigma 32221
Glass slides VWR international 631-9439
Tweezers
Acrylic resin Electron Microscopy Sciences 104371
Epoxy resin M Sigma 10951
Epoxy resin M hardener Sigma 10953
Dibutyl phtalate  Sigma 80102
Epoxy resin M accelerateur Sigma 10952
Crystallizer Fischer scientific 08-762-9
Joseph paper VWR international 111-5009
Brass cups do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight box Fischer scientific 7135-0001 
Air purifying respirator Fischer scientific 3M 7502 
Cartridge for respirator Fischer scientific 3M 6001
Particulate filter Fischer scientific 3M 5N11 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 123 פלאנג מקפיא להקפיא-החלפה שידור במיקרוסקופ אלקטרונים שמרים טפילים חיידקים ultrastructure immunolabeling
מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blancard, C., Salin, B. Plunge… More

Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter