Summary
이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.
Abstract
투과 전자 현미경 (TEM)은 단백질을 지역화하고 매우 높은 해상도에서 거대 분자 복합체를 시각화하기 위해 세포 미세 구조 연구를위한 특별한 도구입니다. 그러나, 기본 상태로 최대한 가까이 얻을, 완벽한 샘플 보존이 필요합니다. 알데히드와 기존의 전자 현미경 (EM) 고정은, 예를 들어, 좋은 미세 보존을 제공하지 않습니다. 고정 제의 느린 침투 세포 조직 개편 및 다양한 세포 구성 요소의 손실을 유도한다. 따라서, 종래의 고정은 EM 구조 및 항원의 순간 안정성 및 보존을 허용하지 않는다. 세포 내 이벤트를 검사하기위한 최선의 선택은 그 나라의 상태로 세포를 유지 동결 대체 고정 방법 다음 cryofixation을 사용하는 것입니다. 고압 냉동 세포 미세 구조의 무결성을 보존 / 동결 대체, 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 expensi이 필요장비를했습니다. 여기서, 현탁 세포 배양을위한 동결 교체 다음에 사용하기 쉽고 저렴한 동결 고정 방법이 제공된다.
Introduction
샘플 준비는 전자 현미경 연구의 성공을 위해 중요하다. 종래 EM 고정은 투과형 전자 현미경 (TEM) 1 조직 또는 세포를 고정하기위한 주요 방법이다. 먼저, 알데히드 및 산화 오스뮴 화학적 실온에서 재료를 고정하기 위해 사용된다. 그 후, 재료는 유기 용매 탈수 함침 한 에폭시 수지에 포함된다. 이 방법은 셀에 고정 제의 침투 속도에 의존한다. 따라서, 세포 내용물의 생성물 추출은 일반적으로 2가 관찰된다.
Cryofixation 명확 세포 구조 3의 보존을위한 더 나은 대안 그대로를 유지하고있다. 얇은 수지 부분의 TEM 이미지 (4)의 높은 품질은 cryofixation / 동결 대체 방법을 사용하여 얻을 수있다. 이 기술의 목적은 유리화 BI를 얻는 것입니다얼음 결정 형성 또는 세포의 미세 구조가 손상되지 않도록 충분히 작은 포함 된 얼음 결정이없는 론적 샘플. 고압 동결 (HPF) 또한 (PF)을 동결 런지라고 매우 빠른 cryofixation는 샘플 cryofix 두 가지 방법이다. HPF 순간적 셀 분자를 고정화 종래 EM 고정에 의한 피해를 방지한다. 냉동 기계 및 자동 대체 장치의 몇 가지 유형의 5 개발되었다. 냉동 시스템 및 소모품 (액체 질소, 등 캐리어 표본) 비싸지 만 고품질의 전자 현미경 (6, 7)를 제조 할 수 있습니다. PF는 1950 년대에 사용되었으며 간단하고 PF 절차 .During 8 싸고 준비된 샘플을 얼음 결정 미만 3 내지 5 nm의 크기를 획득하기 위해 빠른 속도로 동결 같은 문헌에 기재되어있는 기술이다. 이를 위해, 샘플입니다에탄, 프로판, 에탄 또는 프로판 혼합물과 같은 액체 냉각제로 하락. 1950 년대 이후, PF의 개선은 더 많은 수의 사용자에이 기술을 사용할 수 있도록하기 위해 수행되었다. PF 넓게 (화상 작은 물체에 사용되는 반면, 고압 동결 현재 두꺼운 50㎛보다 5 (디스크 형 샘플은 200 ㎛의 두께까지) 샘플들의 큰 다양성을 고정 할 수있는 유일한 실용적인 방법이다 <100 nm의 ), 비결정질 얼음 9의 박막에 현탁 고분자 복합체 등. 큰 샘플은 진핵 세포, 예를 들면, PF로 cryofixed하지만 모세관 구리 관 또는 샌드위치 시스템 8, 10, 11 등의 시험편 홀더를 필요로 할 수있다.
여기에, 빠른, 사용하기 쉬운 다양한 서스펜션 세포 배양에 사용 가능한 저가의 급락 동결 / 동결 대체 기술이 제공됩니다.
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Protocol
Formvar 그리드 필름 1. 준비
참고 : 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 안경)를 사용하여 흄 후드 클로로포름 조작을 수행합니다. 400 메쉬 전자 현미경 구리 그리드를 사용합니다. 다른 그리드 유형 (다른 메쉬 크기, 금과 니켈 그리드)으로 동결의 품질이 나쁘다.
- 클로로포름 0.3 % formvar의 100 mL의 용액을 제조 하였다. 이 동요없이 하룻밤을 용해 할 수 있습니다.
- 400 메쉬 전자 microscopycopper 그리드 (직경 3.05 mm) 유리 바이알 (높이 3cm 직경 2cm)을 함유하는 아세톤 (제곱 인치당 구멍 수)을 넣어. 손의 순환 이동에 유리 바이알을 교반한다. 플라스틱 전송 피펫으로 아세톤을 제거합니다. 용매를 5 분 동안 증발하도록 허용. 여과지 상에이를 부어 그리드 전송하고 5 분 동안 건조 할 수있다.
- 미끄러운 / 반짝이까지 보풀이없는 천으로 닦아 76 X 26mm 2 유리 슬라이드 폴란드어.
- 결정 화기 (직경 15cm, 높이 7cm 용량 1,200 ㎖)에 취하여 증류수 가장자리에 채운다. 먼지를 제거하기 위해 두 표면 위에 유리 막대를 통과시킴으로써 물 표면을 청소한다.
- 두 손가락 사이의 유리 슬라이드를 잡고 몇 초 동안 formvar 솔루션에 담근다. 이 똑바로 5 분 동안 거꾸로 비커에서 건조 잡습니다.
- 필름이 건조하면, 필름의 한계 슬라이드에서 탈락 할 정의 날카로운 면도날 유리 슬라이드의 가장자리 점수.
- 심호흡을 가지고에 약간 불투명 필름을 렌더링하고 가시성을 향상시키기 위해 필름에서 수증기 층을 얻을 수있는 슬라이드에 크게 내쉬고.
- 즉시 약 30 °의 각도로 슬라이드의 바닥을 터치하여 정석 물 표면에 막을 로트. 슬라이드에서 개봉을하자 정석 물 표면에 그것을 벗겨. 부드럽게와 필름을 떼어핀셋, 필요한 경우.
- 부드럽게 그리드는 적절한 두께 (약 10 ㎚)의 주름이없는 영역에있는 수면에 부유 막 위에 뒤집어서 누워.
- 그들은 정석 물 표면에 부유 조셉 종이 그리드 감싸는 필름 픽업.
- 한 손으로 요셉 용지를 잡고 필름의 한쪽 끝을 요셉 종이의 한쪽 끝을 누릅니다. 조셉 용지가 완전히 젖었을 때까지 기다립니다. 에 붙어 그리드와 요셉의 용지를 제거합니다.
- 최종 건조하고, 실온에서 사용하기 전에 저장하는 덮여 페트리 접시에서 24 시간 동안 그리드를 놓는다.
동결 교체 매체의 제조 2
참고 : 오스뮴 테트 록 사이드 (OSO 4)와 우라 닐 아세테이트는 유해 화학 물질이다. 실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 흄 후드를 처리합니다. FOLL취급의 안전 경고 (OSO 4) 우라 닐 아세테이트 오우. OSO 4의 누설을 방지하기 위해 O 링 크리오 바이알 (cryovial)를 사용합니다.
- 미세 구조 연구
- 유리 플라스크에 유리 OSO 4 앰플을 넣어.
- 플라스크를 흔들어 앰플 휴식.
- 4 %의 최종 농도를 얻기 위해 아세톤의 적합한 양을 100 % 추가.
- 저어 1.8 ML의 크리오 바이알 (cryovial)에 1.5 mL의 씩 분배.
- 단백질 immunolabeling
- 유리 플라스크 우라 닐 아세테이트 0.05 g을 놓는다.
- 100 % 아세톤 50 mL를 추가.
- 자기 교반기로 교반 용액. 용액 분명 해지면, 0.2 ㎛의 필터를 사용하여 필터링.
- 1.8 ML의 크리오 바이알 (cryovial)에 1.5 mL의 분취 량을 분배.
참고 : 플 런지 냉동 처리하기 위하여 동결 대체 매체를 포함하는 크리오 바이알 (cryovial)를 준비하고 -84 ° C 형 냉장고에 보관하십시오. 멀리 던져 유리 플라스크를 반전하려면유해 폐기물의 OSO 4 앰플.
3. 셀의 제조
참고 :이 단계는 방법의 성공을 위해 중요하다. 모든 세포 유형, 세포의 표시 번호를 얻기 위해 세포를 성장. 지정된 시간과 속도로 표시된 튜브에 원심 분리기.
- 다음과 같이 서로 다른 세포 유형에서 펠렛의 적절한 일관성을 얻기 위해, 세포 성장 :
- 사카 cerevisiae를하고, 분열을 pombe 들어 최소 또는 완전 액체 배지 5ml에 효모 접종. 28 ° C, 회전 (180 RPM)에서 밤새 인큐베이션. 밤새 배양 600nm의 (OD 600)에서의 광학 밀도를 측정한다. 0.2 ml의 50에 신선한 선택 배지의 OD 600 효모 세포를 희석. 1 × 109 효모 7을 얻었다 회전, 28 ° C에서 세포를 배양하는 것을 계속한다.
- 슈만 편모충의 편모를 들어, 가지마7.5 % FCS (소 태아 혈청)을 5 ㎖의 AM 매체 culate 기생충. 24 ° C, 회전 (180 RPM)에서 밤새 인큐베이션. 밤새 배양 OD (600)를 측정한다. 0.2 ml의 50에 신선한 선택 배지의 OD 600 기생충 세포를 희석. 5 × 108 기생충 셀 (12)을 얻기 위해, 회전, 24 ℃에서 세포를 배양하는 것을 계속한다.
- 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei 들면, 10 % FCS 및 30 ㎍ / mL의 하이 그로 마이신을 가진 SDM-79 배지 5ml에 접종 기생충. 27 ° C, 회전 (180 RPM)에서 밤새 인큐베이션. 밤새 배양 OD (600)를 측정한다. 50 mL의 신선한 선택 배지에 0.2의 OD 600 기생충 세포를 희석. 5 × 108 세포 기생충 13을 수득 회전, 27 ℃에서 세포를 배양하는 것을 계속한다.
- 대장균, 100 ㎍ / ㎖의 암피실린으로 DYT 배지 5ml에 접종 박테리아. (회전, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 180RPM). 밤새 배양 OD (600)를 측정한다. 0.2 ml의 50에 신선한 선택 배지의 OD 600 박테리아 세포를 희석. 5 × 10 14 박테리아 세포를 얻기 위해, 회전, 37 ℃에서 세포를 배양하는 것을 계속한다.
참고 밤새 항온 배양은 배양 세포 중 또는 정지 대수 성장기 일 수있다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 세포 균주는, 어느 날 밤, 또는 세포의 더 많은 수의 접종에 비해 배양 시간이 더 필요할 수 있습니다.
- 모든 세포 유형의 경우, 1,500 × g으로 3 분 동안 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 세포를 포함하는 배양 배지를 옮긴다.
- 상등액을 제거하고 적절한 세포 배양 배지 1 ml의 모든 종류의 세포 펠렛을 재현 탁.
- 원심 3,900 × g으로 1 분 동안 미세 원심 분리 튜브 내의 모든 세포 유형. 완전히 뜨는을 제거합니다.
- 얼음에 세포를 유지합니다.
참고 :주의 액체 질소를 처리합니다. cryogloves와 구글을 포함한 개인 보호 장비를 사용합니다. 프로판은 잠재적으로 폭발성이므로, 통풍이 잘 나 흄 후드 액화를 수행한다. 아니 불꽃이 허용되지 않습니다.
- 폴리스티렌 트레이에서 액체 질소의 약 150 ㎖을 넣어. 이를 동결 액체 질소에 황동 컵 (높이 3.6 cm, 직경 2cm, 두께 1.5 mm)를 놓는다. 액체 질소는 황동 컵에 침투하지 마십시오.
- 거품이 황동 컵이 고정되어 있는지 확인하기 위해 가라 앉을 때까지 기다리십시오.
- 황동 컵 벽과 접촉 프로판 실린더에 연결된 호스를 넣습니다.
- 부드럽게 프로판 실린더 밸브를 연다.
참고 :이 단계에서, 프로판은 황동 컵에 액화. - 프로판 실린더 밸브를 폐쇄하고 신속하게 가스 호스를 분리하여 액화를 중지.
- 액체 NI와 폴리스티렌 트레이 채우기황동 컵의 상단에서 5mm까지 트로겐. 액체 질소는 황동 컵에 침투하지 마십시오.
시료 5. 런지 동결
- 폴리스티렌 트레이에서 액체 질소의 약 200 ㎖을 넣어. 액체 질소에 이르렀 조금씩 황동 컵 (높이 1.5 cm 직경 2.5 cm, 두께 1mm)를 고정. 하나 개의 서스펜션 세포 샘플에 대해 하나의 컵을 넣습니다. 샘플을 혼합하지 않도록주의하십시오. 이를 위해, 등 컵 2에, 컵 1 샘플 2 샘플 1을 넣어.
- 액체 질소 중에서 그들의 팁 급락하여 핀셋 동결.
- 3.5에서 수득 된 펠릿에 더블 에지 해부 바늘 런지.
- 핀셋을 사용하여, 제 1 단계에서 제조 된 formvar로 코팅 된 400 메쉬 구리 현미경을 그리드.
- 해부 바늘을 사용하여, 그리드에 3.5에서 얻어진 펠렛 방울을 놓는다. 다른 드롭 크기 (예 : 2, 5, 10 μL)를보십시오.
- 매우 빠르게 액체 프로판 유전자에 의해 유지 핀셋 그리드 급락제 4 항에 보통 수 초 동안 원 운동으로 그리드 교반한다.
- 신속하게 5.1 절에 동결 작은 황동 컵에 핀셋으로 고정 된 격자를 전송합니다.
참고 : 각 샘플의 경우, 최소 3 그리드를합니다. 항상 구리 그리드를 촬영하기 전에 핀셋을 동결.
6. 동결 교체
참고 : 오스뮴 테트 록 사이드 잠재적으로 휘발성이기 때문에, 증기 카트리지와 공기 정화 호흡기를 사용합니다. 플 런지 동결 전에 액화 질소에서 냉동 정착액 또한 용액이다.
- 미세 구조 연구를 들어, 섹션 2.1에서 제조 한 동결 대체 배지를 함유하는 1.8 mL의 cryovial 튜브를 연다. 의 면역 시험은 섹션 2.2에서 제조 한 동결 대체 배지를 함유하는 1.8 mL의 cryovial 튜브를 연다. 크리오 바이알 (cryovial)에 뚜껑을 놓습니다.
- 액체 질소 중에서 그들의 팁 급락하여 핀셋 동결.
- 빠르게 캡을 제거하고 냉동 그리드에게 내가 전송핀셋을 사용하여 크리오 바이알 (cryovial)를 NTO.
- 다시 크리오 바이알 (cryovial)에 뚜껑을 넣습니다.
- 각 샘플의 각 격자에 대한 작업을 반복합니다.
- 샘플을 동결 교체 매체에 있도록 손의 원 운동으로 크리오 바이알 (cryovial)을 모두 캡을 닫고 교반 하였다.
- 동결 교체 과정에서 -84 ° C에 냉동 3 일 동안 밀폐 된 상자에 크리오 바이알 (cryovial)를 놓는다.
7. 샘플 온난화
- 미세 구조 연구
- 폴리스티렌 트레이에 크리오 바이알 (cryovial)를 나른다 -30 ° C에 냉동 (급격한 온도 상승을 방지하기 위해). 1 시간 동안 -30 ° C 냉장고에 넣습니다.
- 2 시간 동안 -15 ° C에 냉동의 크리오 바이알 (cryovial)를 놓는다. 실온에서 30 분 후, 2 시간 동안 4 ℃에서의 샘플을 놓고.
- 플라스틱 전송 피펫으로 동결 대체 매체를 제거합니다. 100 % 아세톤 약 500 μL를 추가합니다.
- 1.8 ml의 cryovial 볶음신속 원형 손의 움직임과 함께 유리 바이알에 그리드 (높이 3cm 직경 2cm)을 함유하는 아세톤 (1.5 ml)에 붓는다.
- 모든 그리드를 전송 한 반드시 100 % 아세톤 1 ㎖와 동일한 cryovial 린스. 손의 원형 움직임으로 cryovial 교반하고 유리 바이알에 cryovial의 내용을 붓는다.
- 10 분 동안 100 % 아세톤으로 3 회 3 mL로 각 유리 바이알을 헹군다.
- 기준 (15)에 기술 된 바와 같이 매립 및 포함 절차를 수행. 아세톤 (25 %, 50 %, 75 %), 에폭시 수지의 농도가 증가함에 따라, 샘플을 함침하고 젤라틴 캡슐에서 100 %의 에폭시 수지 시료를 포함.
- 연구를 Immunolabeling
- 폴리스티렌 트레이의 1.8 mL의 크리오 바이알 (cryovial)의 캐리 -30 ° C에 냉동 장치 (급격한 온도 상승을 방지하기 위해).
- -30 ° C의 냉동고에 2 시간에 대한 크리오 바이알 (cryovial)를 놓는다.
- -30 °에서 C 냉동기는 손의 원 운동으로 cryovial 교반 빠르게 폴리 프로필렌 바이알 (높이 5cm 지름 1.5 cm)에 동결 교체 매체를 붓는다.
- 신선 동결 대체 매체의 2 ml로 동결 대체 매체를 교체합니다.
- -30 ° C의 냉동고에 2 시간 동안 폴리 프로필렌 바이알을 놓는다.
- 100 %의 아세톤 용액 (2) 100 % 에탄올 2 mL를 1 시간 동안 3 회 1 시간 프로필렌 바이알을 헹군다.
- 기준 (15)에 기술 된 바와 같이 매립 및 포함 절차를 수행. 아크릴계 수지의 농도를 증가 (25 %, 50 %, 75 % 아세톤)로 샘플을 함침하고 젤라틴 캡슐에 100 % 아크릴 수지 시료를 포함.
시료 8. 시각화
- 삽입 후, 샘플을 Ultramicrotome으로 80 nm의 매우 얇은 부분을 만든다. 1 분 동안 실온에서 2 % 납 시트르산 섹션 대조엉덩이 = "외부 참조"> 15.
- 섹션 (15)을 관찰하기 위해 80 kV의 120 kV의 전자 현미경을 사용합니다.
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Representative Results
이 문서에서, 미세 구조 (도 1 및도 2)와 immunolabeling (도 3)에 대한 연구에 사용하기 쉽고 저렴한 런지 냉동 방법은 제시된다. 우리는 동결 대체 절차와 온난화 절차 대신 전용 시스템을 사용하여 24 시간 미만 6 시간 걸리는 특수 장비이 필요하지 않다는 점을 보여줍니다.
PF / 동결 교체 방법 사카 cerevisiae를 (도 1a 및도 1d-H), 분열 pombe의 (도 1b와의 세포 구조의 개선 된 보존을 초래 C), 리 슈만 편모충 편모 (도 2 및 B), 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei (도 2 C 및 D) 및 대장균 (도 2E). 구조는 위축되지 않고 세포질은 밀도가 나타납니다. 또한, 막 좋은 보존의 증거이다, 부드러운 있습니다. 이러한 핵 (도 1A, B 및 D -D도 2A), 미토콘드리아 (도 1A-C, E 및 H)과 액포 (도 1a, C, F 및 H)와 소기관 모두 완벽하게 식별 될 수있다 . 핵에서, 핵막, 핵공 스핀들 기둥 체 및 핵막의 외막에 부착 리보솜을 형성하는 이중 막 (도 1 뚜렷하게 볼 수 있습니다D 및도 2B, 2D). 미토콘드리아에서의 cristae라는 내부 세포막 함입은 (도 1E), 명확하게 볼 수있다. 액포는 큰 얼음 결정이 그들 내부에 쉽게 개발할 수 있기 때문에 중요한 소기관이다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 액포 완벽한 얼음 결정 손상 (도 1a, C, F 및 H)없이 보존된다. 미세 구조가 잘 보존되어 마지막으로, 다른 생물학적 사건은 자식 작용 (도 1C, F 및 H), 미토콘드리아 형태 (도 1E), 분비 소포 (도 1G) 및 핵 분열 (도 1a와 같이 관찰하고 분석 할 수있다 도 2 B하는차의 2C).
특정 항체와 단백질의 현장 현지화에서 세포 생물학에서 가장 강력하고 인기있는 기술 중 하나입니다. PF는 단백질의 면역을 수행하는 방법으로서 사용될 수있다. , 상술 소기관의 정체성을 언급 한 바와 같이이 절차는 단백질의 항원 성을 유지합니다. 안티 ATP 신타 제 (7), (15) (도 3A, 3C 및 3D), 항 GFP (도 3b), 안티 porine (16) (도 3 E), 17 항 fox2 (도 같은 다른 효모 단백질을 표적으로하는 다른 항체 3 층), 이미 테스트되었습니다. 그러한 슈만 편모충 (12)와 같은 다른 유기체에 대한 실험을 수행하는 것도 가능하다.
그림 1 : 효모 사카 사카로 마이 세스 세레 비시 애하고, 분열의 pombe의 미세 구조 연구의 TEM 이미지. S. cerevisiae의 용의 (A) 개요. S. pombe에서의 (B) 개요. S. pombe의 세포질 (C) 부품. (D) 핵의 고배율. 명확하게 볼의 cristae와 미토콘드리아의 (E) 세부 사항. 자식 작용 중 (F) 공포 성 형태. 내부 분비 소포와 (G) 효모 새싹. 자식 작용 과정 액포 미토콘드리아 간의 친밀한 접촉의 (H) 실시 예. N, 핵; V, 공포; m, 미토콘드리아; SV, 분비 VESI사이클 사용; R, 리보솜. 스케일 바는 200 나노 미터 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2의 슈만 편모충 amazonesis, 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei 및 E. 콜라이의 미세 구조 연구의 TEM 화상. 슈만 편모충의 (A) 개요. 핵공 및 소포체와 슈만 편모충 세포질의 (B)의 세부 사항. T. brucei의 (C) 개요. (D) T. brucei의 핵의 고배율. 대장균의 (E) 개요. N : 핵; V, 공포; m, 미토콘드 리온; NP, 핵 기공; F, 편모; FP, 편모 주머니; K, 키네 플라 틱; r, 리보솜. 스케일 바 = 200 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 단클론 항체와 다 클론 항체를 이용한 단백질 표식의 예. ( A ) S. cerevisiae의 개요. ( B ) 항 -GFP 항체로 아밀로이드 -β의 면역 표지. ( CD ) 항 ATP 합성 효소 항체를 이용한 미토콘드리아 표지의 예. ( E ) mitochondrion의 외부 막에 Porin 지방화. ( F ) Fox2 단백질은 immunolabeling에 의해 mitochondrion에서 검출됩니다. Ld Flabarin의 ( G ) 현지화리 슈만 편모충의 amazonesis의 편모의 종단면도. 항체는 모두 10 nm의 금 폴리 클로 날 항체를 사용하여 검출된다. N, 핵; V, 공포; m, 미토콘드리아. 스케일 바는 200 나노 미터 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TEM은 소기관, 세포 및 조직의 미세 구조의 관찰을위한 강력한 방법이다. Cryofixation / 동결 대체는 현재 모두 미세 구조 및 단백질 항원의 보존을위한 최선의 방법입니다. 화학 고정 제를 침투 및 미세 구조 (2)의 전체 구조 안정화되기 전에 재 배열을 가능하게함으로써 매우 천천히 작동한다. 반대로, cryofixation / 동결 대체 즉시 세포 구조 (4)를 안정화시킨다. 그러나 cryofixation / 동결 대체 기술함으로써 응용 프로그램의 자신의 범위를 제한하는 제약과 어려움의 수를 포함한다. 이 샘플 동결 유물, 기술, 비용, 장비의 실현에 관한 것이다. 고압 동결 / 동결 대체 기술은 셀룰러 상세 (6)의 보존, (7)의 높은 수준을 가능하게했다. 대조적으로, PF 이미 OBS에 사용얼음 9 비정질 박막에 현탁 작은 물체를 어빙. 여기서, 미세하고 immunolabeling 연구 PF / 동결 교체 방법은 고압 동결 이미지 비교 효모, 기생충, 세균 및 미세 구조의 고품질 화상을 제공한다.
고정 품질은 냉각 속도 (18)에 따라 달라집니다. 높은 냉각 속도로, 물은 유리질 상태에 있고, 전자 현미경 레벨에서 보이는 결정 구조를 보여주지 않는다. 유리화 따라서, 양호한 두께 동결 서서히 안쪽 층 (4) 검체의 표면에서 감소되며, 매우 얇은 표면층 (일반적으로 200 μm의)로만 발생. 식물 세포에있어서, 가스 충전 왁스 코팅 또는 공간은 냉각 속도를 느리게 할 수있다. PF와 함께, 놀랍게도, 냉동 성능의 품질이 더 감소는 관찰되지 않았다. 모든 실험에서 잘 냉동 세포의 비율은 g이다 50 %보다 reater. 이 비율이 90 % 이상 50 % 사이에서 변화하고 각종 파라미터 (배지, 세포의 생리 학적 상태, 실외 온도, 수분 함량)에 의존한다. 전술 한 바와 같이, 얼음 결정의 형성은 세포 구조를 파괴하고 얼음 결정 액포에서 특히 볼 수 있습니다. PF / 동결 대체 과정에서 특별한주의가 동결 온도에 지불해야합니다. 동결 교체 단계는 -82 ° C에서 이상 수행하지 않아야하고, 그 이외의 경우, 본 유리체 물은 결정 물로 변환한다. 얼음 결정 손상의 형성을 방지하기 위해, 동결 방지제는 현재 사용되지만, 그 셀 (19)의 미세 구조의 변화로 이어집니다. 효모, 박테리아, 기생충 문화 매체는 cryoprotective 에이전트 구성 요소를 포함 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 실제 셀룰러 상태에 가능한 한 근접하도록하기 위해 추가로 동결 방지제를 사용하지 않기로 결정 하였다.
ve_content는 "> PF / 동결 대체의 성공은 방법의 개발 단계에서 많은 중요한 단계에 따라 달라집니다. 첫째, 중요한 점은 펠렛의 적절한 일관성을 확보하는 것입니다. 원심 분리 후 얻어진 펠렛은 충분히 소형 압연 할 수 있어야합니다 펠렛이 너무 컴팩트 경우, 동결 대체 솔루션 드롭을 침투 할 수없고, 펠릿 충분히 컴팩트없는 경우 미세 구조는, 반대로. 잘 보존되지 않습니다 전자 현미경 그리드에서., 남은 배양액을 개발할 수 있습니다 얼음 결정 및 세포 미세 구조를 손상. 여러 세포 유형에서 펠렛의 적절한 농도를 얻기 위해서는, 모두 (위 참조) 프로토콜에 나타낸 세포 원심 파라미터의 표시 한 수를 얻기 위해 배양 조건을 존중해야 세포 유형. 그러나, 구리 그리드에 넣어 재료의 양은 중요하지 않다. 다른 액적 크기를 검사 할 수있다. 둘째, 격자 형 그쪽지원이 중요하다으로 t이 사용됩니다. 다른 메쉬 크기가 몇 금, 니켈, 구리 그리드 테스트했다. 가장 좋은 결과는 얇은 막대 400 메쉬 구리 그리드 얻었다. 셋째, 냉동 공정에 관해서, 황동 컵 프로판 액화하는 것이 바람직하다. 구리 컵에 액체 프로판, 따라서 실험을 복잡하게, 동결 경향이 있고. 마지막으로, 조작 실수로 샘플 워밍업을 방지하기 위해 신속하고 추운 환경에서 작동해야합니다. 이 발생하면, 샘플을 폐기해야합니다. 예를 들어, 샘플 온난화를 방지하기 위해 핀셋을 사용하기 전에 미리 냉각되어야하며 동결 대체 매체는 물론 앞서 절차 전에 준비를해야합니다. 냉장 핀셋도 뛰어 동결 becauseif 돌입 동결 과정에서 사용되어야는 핀셋 동결없이 실현은 핀셋 (열에 의한 / 냉 교환) 프로판 급락대로 연기 형태의 많은. 이것은 필연적으로 냉각 속도에 영향을 미친다. SAMPL와 테스트고정되지 않은 핀셋으로 고정 ES가 제대로 고정되지 나타납니다.또한, 이러한 동결 교체 매체 O의 S의 O 4, 우라 닐 아세테이트와 같은 유해 화학 물질의 사용은 용액의 제조시, 필요 동결 교체 프로세스를 적절한 PPE와 흄 후드 작동. 증기의 OSO 4의 누설 및 흡입을 방지하기 위해, 크리오 바이알 (cryovial)는 튜브가 동결 대체 과정에서 밀봉 유지하려면 하드 O 링이 있어야합니다. 동결 교체 매체의 제조 중에 오스뮴 증기 불필요한 노출을 방지하기 위해, OSO 4 앰플 유리 플라스크로 나누어 질 수있다. 포함 후의 수지 블록에 유리 파편의 존재 acetones 린스 및 삽입 단계 동안 미세 팁 전달 피펫을 사용하여 회피 될 수있다. 양안 루프 아래의 단계를 포함 세미 얇은 부분의 구현을 수행하면, 유리 파편이 없는지 확인을 허용한다.실험은 (특히 냉동 대체 공정의 제 1 단계에서) 흄 후드에서 수행 할 수없는 경우, 증기 카트리지 공기 정화 호흡기를 사용한다. 액체 질소 또는 동결 단계 동안 추운 환경에서 작업 할 때 조작은주의해야합니다. 장갑과 안경의 사용을 권장합니다. 액화 통풍이 잘되는 곳에서 또는 흄 후드에서 수행되어야하며, 어떤 불꽃이 허용되지 않도록 또한, 프로판, 폭발 위험이있다.
몇몇 문서들은 뇌 조직, 아이비 리프 또는 A. 장대와 N.의 benthamiana의 뿌리 끝과 같은 샘플의 다양한에서, 미세 구조의 보존 화학 정착 20, 21에 비해 HPF 기술 향상되어 있음을 보여 주었다. PF으로, 실험은 현탁액 중의 세포에 대해 수행 하였다. 따라서, 라에이 기술의 성공의 표시가 없습니다rger는 조직처럼 표본. 또한 실험은이 점을 해결하기 위해 수행 될 필요가있다. 그러나,이 방법은 성공적으로 세포를 고립이 아니라 균사체 양식 (22)입니다되지 사상균 Podospora의 anserina 테스트되었습니다.
본 문서에 제공된 방법은 화학 고정 또는 HPF의 현재의 방법에 비해 상당한 개선을 나타낸다. 예를 들어, PF는 HPF (23)와 달리 고가의 장비 나 소모품을 필요로하지 않습니다. HPF 기술은 액체 질소의 큰 양 (실험 당 80 L)를 사용하기 때문에 관리도주의해야한다. 제안 된 기법으로, 하나의 큰 장점은 더 중요한 장비 (23) 필요가 없다는 것입니다. 따라서, 실험의 비용은 훨씬 낮은 (약 백 배 저렴)입니다. 또 다른 장점은 기술을 쉽게 사용할 수 있기 때문에 특별한 전문 지식이 필요하지 않습니다 것입니다. 또한, 시료 처리 오F PF / 동결 교체로 인해, 24 시간 (24) 대신에 이하의 6 시간을 얻어 보온 공정 HPF / 동결 교체보다 훨씬 짧다. 그것은 기존의 화학 고정보다 소모하지 더 많은 시간이다. 장점은 세포의 미세 구조가 완벽하게 최소한의 유물로 보존하고, 세포의 원래 상태로 매우 가까운 점이다. 이 기술의 응용 프로그램은 확실히 같은 곰팡이 균사 (22)로 다른 빠른 생물학적 이벤트를 연구하거나 정지 성장 세포에 대한 몇 마이크로 미터 두께의 샘플 높은 해상도로 단백질을 현지화 사용이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 관심의 충돌이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 원고에 대한 그들의 도움과 의견을 M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, 그리고 A. 데빈에 대한 우리의 감사를 표현한다. 우리는 이미지가 촬영 한 보르도 이미징 센터의 전자 영상 극에 감사하고 있습니다. 이 작품은 센터 국립 드 라 공들인 과학원에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8.5 mL | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
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