Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

आंतों-26 कार्सिनोमा ट्यूमर असर कर्क कैचेक्सिया के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में माउस

doi: 10.3791/54893 Published: November 30, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

मांसपेशी बर्बाद जैसे कैंसर, सेप्सिस, जिगर, सिरोसिस, दिल और गुर्दे की विफलता, क्रोनिक प्रतिरोधी फेफड़े के रोग, और एड्स के रूप में विभिन्न नैदानिक ​​स्थितियों की एक गंभीर समस्या है। विशेष रूप से, मांसपेशी बर्बाद कैंसर 1 के साथ रोगियों के लिए कम से कम 50% में स्पष्ट है। कंकाल की मांसपेशी प्रोटिओलिटिक सिस्टम और / या से की ओवर-सक्रियण के कारण बढ़ प्रोटीन गिरावट से कैंसर परिणामों में कंकाल की मांसपेशियों की हानि प्रोटीन संश्लेषण 6 कमी आई है। Lipolysis भी स्पष्ट है, वसा ऊतकों की कमी के लिए अग्रणी। चिकित्सकीय, दुर्बलता कम गुणवत्ता और जीवन की लंबाई के साथ जुड़ा हुआ है और 20 में मौत का कारण होने का अनुमान है - कैंसर रोगियों 7 का 30%। प्रयोगात्मक मॉडल है कि मानव रोग के रूप में बारीकी से संभव के रूप में समान का उपयोग फायदेमंद होगा। एक इष्टतम पशु मॉडल उच्च reproducibility, साथ ही द्वारा विभिन्न उपचारों से सीमित हस्तक्षेप और की अप्रत्याशित कारकों की विशेषता हैआहार, लिंग, और आनुवंशिक पृष्ठभूमि है कि आमतौर पर नैदानिक हालत 8 के साथ जुड़े रहे हैं। अब तक, कैंसर दुर्बलता, कैंसर की कोशिकाओं या कार्सिनोजन के इंजेक्शन के प्रत्यारोपण की विशेषता पशु मॉडल में मुख्य रूप से अध्ययन किया गया है, हालांकि एक नई विधि कैंसर के विकास के लिए अतिसंवेदनशील आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करने के लिए है।

असर C26 कार्सिनोमा चूहे (भी रूप में पेट के -26 और ग्रंथिकर्कटता करने के लिए कहा गया है) कैंसर दुर्बलता 2,5 की एक अच्छी तरह से विशेषता और बड़े पैमाने पर इस्तेमाल मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। शरीर और मांसपेशियों के वजन घटाने में C26 ट्यूमर परिणामों के विकास, मुख्य रूप से बढ़ाया वसा और प्रोटीन अपचय 9 के माध्यम से। आम तौर पर, बनाम शरीर के कुल वजन एक 10% ट्यूमर वजन कंकाल की मांसपेशी वजन में 20-25% की कमी और वसा 3,10 की एक बड़ी कमी के साथ जुड़ा हुआ है। हिपेटोमिगेली और तिल्ली का बढ़ना भी, ट्यूमर के विकास के साथ मनाया जाता है तीव्र चरण प्रतिक्रिया के सक्रियण और समर्थक infla की पदोन्नति के साथ साथmmatory साइटोकाइन स्तरों 3,11। इन के अलावा, यह सर्वविदित है कि आईएल -6 C26 मॉडल में मांसपेशी बर्बाद मध्यस्थता में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, भले ही इस साइटोकाइन शायद दुर्बलता 12 में से सिर्फ inducer नहीं है। बुलंद आईएल -6 जे ए / Stat3 मार्ग के सक्रियण के माध्यम से पेशी शोष का कारण बनता है, और इस प्रतिलेखन कारक बाधा मांसपेशी बर्बाद 3,4 रोका जा सकता है।

C26 प्रेरित मांसपेशी बर्बाद दौरान मांसपेशियों शोष के कई परिस्थितियों में के रूप में, मांसपेशियों को काफी हद तक मांसपेशी फाइबर भर में पेशी प्रोटीन सामग्री में कटौती के माध्यम से, कोशिका मृत्यु या फाइबर 13 की हानि के माध्यम से नहीं खो दिया है। C26 दुर्बलता में, छोटे पार के अनुभागीय क्षेत्रों की दिशा में एक पारी में दोनों glycolytic और ऑक्सीडेटिव फाइबर 2 में मनाया जाता है। यह भी कम मांसपेशियों की ताकत 5 के साथ संगत है। दुनिया भर में कई समूहों के आदेश कैंसर सीएसी के लिए मांसपेशी बर्बाद करने के नए मध्यस्थों या चिकित्सकीय प्रासंगिक दवाओं की खोज करने में C26 मॉडल का लाभ ले लिया हैhexia। हालांकि, इस मॉडल के उपयोग के लिए कई अलग अलग प्रक्रियाओं सूचित किया गया है, प्राप्त आंकड़ों की स्थिरता के बारे में चिंता बढ़ गई है और विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों में reproducibility के लिए बाधाओं को प्रस्तुत। यहाँ हम कैंसर दुर्बलता है कि मानकीकृत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा पैदावार के अध्ययन के लिए इस मॉडल की एक विशिष्ट प्रयोग की रिपोर्ट।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

आचार कथन: सभी अध्ययनों में वर्णित थॉमस जेफरसन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों और चिकित्सा के इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. C26 सेल के विकास और तैयारी

  1. C26 कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं (ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (OSUMC)) प्राप्त करते हैं और पूर्ण विकास मध्यम तैयार (यानी, उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS युक्त), 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% glutamine, और 1% स्ट्रेप्टोमाइसिन / पेनिसिलिन)।
    नोट: आदेश में बेहतर अंतर-प्रयोगात्मक reproducibility अनुमति देने के लिए, यह संभव के रूप में के रूप में कम एक मार्ग पर C26 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए बेहतर है।
  2. पूरा मध्यम विकास के साथ बोतल में 50,000 कोशिकाओं / 2 सेमी थाली के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल काउंटर का प्रयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified वातावरण में उन्हें सेते हैं और 5% तक उप मिला हुआ सीओ 2। उन्हें उच्च घनत्व में संवर्धन के पीछे करने से बचेंईएनटी भेदभाव और सेल phenotypes की बहती।
  3. पहले पारित होने के बाद, थाली पर्याप्त कक्षों जानवरों की योजना बनाई संख्या में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। सेल आरोपण के दिन, 2 सेमी प्रति 0.02 0.25 मिलीलीटर% trypsin EDTA समाधान के साथ trypsinization द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना trypsin के प्रति मिलीलीटर ताजा माध्यम से कम से कम 3 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर कोशिकाओं / एमएल में सेल एकाग्रता का निर्धारण और प्रयोग (माउस प्रति 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) बाँझ पीबीएस में की जरूरत के लिए कोशिकाओं की संख्या resuspend।
    नोट: C26 कोशिकाओं confluency तक पहुँचने जब घनत्व के बारे 500,000 कोशिकाओं / 2 सेमी है।

2. चूहे

  1. समूहों में वयस्क CD2F1 चूहों (उम्र के कम से कम 8 सप्ताह) अनियमित (आम तौर पर नियंत्रित करता है और ट्यूमर पदाधिकारियों) के साथ कम से कम n = 6 समूह के प्रति।
    नोट: C26 ट्यूमर Balb / ग चूहों में बढ़ने के रूप में अच्छी तरह से। हालांकि, हमारे अनुभव के आधार पर, CD2F1 चूहों इस विशेष ट्यूमर मॉडल के लिए एक और बहुमुखी और आर्थिक मेजबान प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा,नैदानिक सेटिंग को और बर्बाद कर 14-16, C26 दुर्बलता के जवाब में लिंग भेद भी 17 देखा जा सकता है कैंसर से जुड़े पेशी के अन्य प्रयोगात्मक मॉडल में रिपोर्ट के निष्कर्षों के समान (भी 1 टेबल देखें)।
  2. माउस साँस लेना (ऑक्सीजन में 3%) द्वारा isoflurane का उपयोग anesthetize। विशेष रूप से समय ट्यूमर टीका करने के लिए आवश्यक के लिए संज्ञाहरण के तहत पशु बनाए रखें। यकीन है कि माउस आदेश शरीर की गर्मी के नुकसान को रोकने के लिए एक गर्म पैड पर झूठ बनाओ। ट्यूमर इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, धीरे पीछे पैर की उंगलियों pinching द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें।
    नोट: इस प्रक्रिया (आम तौर पर कुछ सेकंड) की अवधि के कारण, पशु चिकित्सा आंख मरहम के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। उसी कारण से, दिखावा ऑपरेशन के दौर से गुजर नियंत्रण जानवरों के लिए वजन कम करने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं।
  3. एक 26 गेज सुई के साथ एक बाँझ 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, जल्दी समाधान टी युक्त के 250 μl इंजेक्षनumor subcutaneously और intrascapularly माउस की वसा पैड में कोशिकाओं।
    नोट: नियंत्रण जानवरों intrascapularly वसा पैड में बाँझ खारा समाधान के 250 μl प्राप्त होगा।
  4. अपने पिंजरे में पशु वापस प्लेस। सीधे माउस कम से कम एक बार हर 15 मिनट के निरीक्षण जब तक यह कोमल हेरफेर करने के लिए जवाब कर सकते हैं और एक ठीक पलटा आ गया है।
    नोट: माउस छोड़ पहुंच से बाहर नहीं है, और एक गर्म वसूली पिंजरे कि एक ठोस सब्सट्रेट शामिल में इसे रख लो। इसके अलावा, जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद किया है पशु कमरे में माउस वापस नहीं है। आम तौर पर, चूहों को व्यक्तिगत रूप से रखे जाने के लिए जब तक अन्वेषक व्यक्ति भोजन का सेवन का आकलन करना है जरूरत नहीं है। इस मामले में और स्वचालित चयापचय पिंजरों का उपयोग उपलब्ध है नहीं, तो भोजन की खपत के मैनुअल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया जाना चाहिए, संभवतः दैनिक और प्रत्येक दिन एक ही समय में।
  5. दैनिक चूहों की जाँच करें और अपने शरीर के वजन रिकॉर्ड है।
    नोट: शरीर हालत स्कोर रिकॉर्डिंग औरघर पिंजरे व्यवहार दुर्बलता और बीमारी व्यवहार है, जो उपचार के अध्ययन 18 के लिए उपयोगी है की डिग्री अंतर कर सकते हैं।

3. इच्छामृत्यु और रक्त संग्रह

  1. नियंत्रण बनाम ट्यूमर मेजबान टीम में शरीर के वजन घटाने 5%, 10%, या 15% (हल्के, मध्यम, और गंभीर दुर्बलता, क्रमशः) अपने शुरुआती शरीर के वजन की तुलना में पहुंचता है जब चूहों euthanize।
    नोट: एक ठेठ प्रयोग बाहर किया जाएगा जब तक एक समूह 10% वजन घटाने, जो समय पर सभी समूहों euthanized हैं पहुंचता है। शरीर के वजन घटाने शरीर के वजन के ट्यूमर का समावेशी मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है।
  2. isoflurane सामान्य संज्ञाहरण (ऑक्सीजन में 3%) के तहत माउस रखें। (- 1.5 मिलीग्राम लगभग 1) एक कार्डियक पंचर के माध्यम से रक्त ड्रा।
  3. कश्मीर 2 -EDTA (18 मिलीग्राम) खाली ट्यूब में रक्त ले लीजिए और बर्फ पर उन्हें जगह है। अपकेंद्रित्र रक्त (4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 2,000 XG) और प्लाज्मा / सीरम इकट्ठा।
  4. ग के माध्यम से माउस euthanizeervical अव्यवस्था। ऊतक छांटना और अंग संग्रह करने के लिए आगे बढ़ें।

4. ऊतक और अंग छांटना

नोट: जैव रासायनिक या आणविक जीव विज्ञान assays में ऊतकों के उपयोग के लिए, प्रत्येक अंग और ऊतक वजन और एक टुकड़ा पूर्व लेबल cryotubes में तुरंत जगह करने की योजना है। स्नैप -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्रीज।

  1. आदेश फर के साथ ऊतकों के नमूनों के संक्रमण से बचने के लिए, स्प्रे पूरे शरीर पर 70% इथेनॉल।
  2. एक विच्छेदन बिस्तर पर माउस एक लापरवाह स्थिति में रखें और एक ऊंचा buret दबाना को पैर संलग्न करके खड़ी एक अंग का विस्तार।
  3. Dumont संदंश के साथ कम अंग की त्वचा समझ और घुमावदार ठीक कैंची का उपयोग धीरे, त्वचा और प्रावरणी दूर करने के लिए कम अंग की अंतर्निहित मांसपेशियों पेट उजागर।
  4. पीछे फीमर पर पार्श्व और औसत दर्जे का condyles और अपनी प्रविष्टि पर अपने मूल से पीछे कम अंग पर gastrocnemius मांसपेशियों को पहचानेंCalcaneal कण्डरा के माध्यम से calcaneus।
    1. gastrocnemius Calcaneal कण्डरा में कटौती करने के लिए आगे बढ़ें। Dumont संदंश के साथ gastrocnemius के बाहर का अंत समझ और अपने मूल की ओर मांसपेशियों पेट खींच। कैंची का प्रयोग, मूल रूप में संभव के रूप में बंद करने के लिए फीमर में पेशी काटा। एक थाली में पेशी रखें। इसे तुरंत वजन और तरल नाइट्रोजन में एक ट्यूब में यह फ्रीज।
      नोट: सुनिश्चित करें कि gastrocnemius के साथ soleus मांसपेशी आबकारी के लिए नहीं हो। यदि ऐसा होता है, ध्यान से धीरे इसे खींच बंद संदंश के साथ द्वारा soleus को हटा दें।
  5. पहचान और टिबिया और उसके बाहर का पट्टा के माध्यम से औसत दर्जे का Cuneiform पर अपनी प्रविष्टि के अग्रपाश्विक सतह पर अपने मूल से tibialis पूर्वकाल मांसपेशी आबकारी लिए आगे बढ़ें।
    1. आदेश में लाभ उठाने की है करने के लिए, तर्जनी और अंगूठे के साथ अंक लोभी द्वारा पैर पकड़। तुरंत tibialis की सतही बाहर का पट्टा के तहत Dumont संदंश की नोक डालें और संदंश के लिए कदम है कि इस तरह बीएलUNT पक्ष अंतर्निहित संयोजी ऊतक से tibialis पेशी पेट अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. बाहर का पट्टा ठीक घुमावदार कैंची का उपयोग कर काट, और फिर मूल में मांसपेशियों में कटौती, संभव के रूप में बंद टिबिया के लिए।
  6. एक बाण चीरा ह्य्पोगास्त्रिक क्षेत्र में शुरू होने वाले प्रदर्शन और अधिजठर क्षेत्र के लिए ऊंचा चलती है, सिर्फ डायाफ्राम से ऊपर चीरा को रोकने के द्वारा उदर गुहा खोलें।
    नोट: चीरा की गहराई केवल पेट की मांसपेशियों दीवार और अंतर्निहित पेरिटोनियल प्रावरणी भंग करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  7. ध्यान से कुंद इत्तला दे दी संदंश के साथ लोभी द्वारा जिगर को हटाने, और किसी भी रक्त वाहिकाओं या संयोजी ऊतक है कि गुहा को जिगर पालन दूर टुकड़े करना ठीक घुमावदार कैंची का उपयोग करें। देखभाल के पीछे किसी भी पालियों छोड़ने के लिए नहीं ले लो। वजन और तरल नाइट्रोजन में एक ट्यूब में जिगर फ्रीज तस्वीर।
  8. , कुंद इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग दूर आंत ले जाते हैं, और फिर बेनकाब और नाजुक हटानेउदासी। कुंद इत्तला दे दी संदंश के साथ धीरे तिल्ली समझ और वापस या ठीक घुमावदार कैंची की कुंद पक्ष का उपयोग किसी भी संयोजी ऊतक या रक्त वाहिकाओं गुहा के लिए तिल्ली पालन दूर टुकड़े करना। वजन और तरल नाइट्रोजन में एक ट्यूब में यह फ्रीज तस्वीर।
  9. जननांगों वसा पैड, अधिवृषण से सटे (पुरुषों में) या गर्भाशय (महिलाओं में) को पहचानें। धीरे कुंद इत्तला दे दी संदंश के साथ अधिवृषणी वसा पैड समझ और गुहा के बाहर ऊतक खींच। ठीक घुमावदार कैंची का उपयोग करना, किसी भी जननांगों ऊतक कि वसा पैड से जुड़ा जा सकता है दूर कटौती। वसा पैड वजन और तस्वीर तरल नाइट्रोजन में एक ट्यूब में यह फ्रीज।
    नोट: आम तौर पर, यह वसा ऊतकों चूहों में समग्र शरीर में वसा द्रव्यमान का प्रतिनिधि माना जाता है और दुर्बलता के साथ वजन में गिरावट आती है। अन्य वसा पैड इसी तरह, पहचान की जा सकती है विच्छेदित, हटा दिया, और तौला।
  10. पशु की छाती को खोलने के लिए घुमावदार ठीक कैंची का प्रयोग करें। दूर कट पसलियों सेंट के दोनों पार्श्व सीमाओं से जुड़ीernum। उरोस्थि निकालें। संदंश के दो जोड़े का उपयोग करना, रिब पिंजरे के प्रत्येक पक्ष समझ और वक्ष गुहा को खोलने के लिए laterally प्रत्येक पक्ष खींच।
  11. नाजुक संदंश के साथ दिल खींच। ध्यान से बाएं आलिंद में महाधमनी विच्छेद करके घुमावदार ठीक कैंची के साथ दिल आबकारी। नाजुक कुछ शोषक कागज के खिलाफ यह सोख्ता द्वारा किसी भी अवशिष्ट रक्त का अंग खाली करने के लिए सुनिश्चित करें। वजन और तरल नाइट्रोजन में एक ट्यूब में यह फ्रीज तस्वीर।

5. स्नायु बर्फ़ीली और बढ़ते

  1. एक छोटे से प्लास्टिक बीकर (50 एमएल) के तरल नाइट्रोजन में isopentane युक्त के नीचे आधा विसर्जित कर दिया। जब यह थोड़ा चिपचिपा हो जाता है और एक ठोस सफेद टुकड़े टुकड़े अस्तर बीकर के अंदर रूपों isopentane का उपयोग करने के लिए तैयार है (तापमान: -160 डिग्री सेल्सियस)।
    नोट: हमेशा पीतल या एल्यूमीनियम हाथ उपकरण nonsparking का उपयोग करें। साँस लेने में उत्पाद वाष्प से बचें। पर्याप्त वेंटीलेशन के साथ प्रयोग करें। एक फैल से निपटने और वेंटिलेशन असंभव या impractic हैअल, एक उपयुक्त श्वासयंत्र पहनते हैं।
  2. इसे संक्षेप में isopentane में (10 सेकंड) सूई से एक चक (कॉर्क) पर कुछ embedding मध्यम रुक।
  3. कण्डरा, खड़ी काग के सापेक्ष द्वारा इसे धारण, आदेश में फाइबर की ओर रुख बनाए रखने के लिए और पार वर्गों के लिए अनुमति देने के लिए पेशी से (जैसे।, Tibialis या gastrocnemius) संभाल लेना।
  4. ध्यान से जमे हुए एम्बेडिंग माध्यम के शीर्ष पर ताजा पेशी के अंत भाग की स्थिति।
    ध्यान दें: पेशी रहना होगा। यह महत्वपूर्ण है कि पूरी तरह से नहीं मध्यम embedding के साथ मांसपेशियों को चारों ओर। यह भी पार के अनुभागीय क्षेत्र के बाद के निर्धारण के लिए खड़ी की ओर रुख बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. isopentane स्नान में संलग्न मांसपेशियों के साथ चक (- 15 सेकंड, नमूना आकार और संरचना के आधार पर हमेशा की तरह ठंड समय 7) डुबकी।
    नोट: ठंड के समाधान में विसर्जन से भी अधिक पूरी तरह से नमूना फ्रीज करने की जरूरत है पिछले नहीं होना चाहिए। बहुत लंबा इच्छा इन्हीं बर्फ़ीलीऊतक ब्लॉक संरचना, जबकि बहुत कम समय बर्फ क्रिस्टल के गठन का कारण होगा। एक अच्छी तरह से जमे हुए नमूना चूने का सफेद हो जाएगा।
  6. नमूना ठंड के बाद, एक छोटे से प्लास्टिक बैग या नमूना ट्यूब (50 मिलीलीटर) में डाल दिया है और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर या तरल नाइट्रोजन में एक डीप फ्रीजर में स्टोर।

6. कच्चे डेटा का विश्लेषण

  1. आदेश, (FBW) चूहों के आकार में बदलाव के लिए नियंत्रण अंतिम शरीर के वजन को सामान्य करने में; ट्यूमर मुक्त शरीर के वजन; और शव, अंग, और ऊतक वजन (ग्राम में व्यक्त) प्रारंभिक शरीर के वजन (आईबीडब्ल्यू) के अनुसार, और "के रूप में वजन / 100 मिलीग्राम आईबीडब्ल्यू" उन्हें व्यक्त करते हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, कुछ जांचकर्ताओं टिबिअ लंबाई करने के लिए मांसपेशियों को मानक के अनुसार।
  2. डेटा विश्लेषण के लिए एक सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। मतलब और सामान्यीकृत वजन के एसडी प्राप्त करें। नियंत्रण और C26 असर चूहों के बीच unpaired छात्र टी-परीक्षण के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं।
    नोट: परिणाम शरीर के सापेक्ष प्रस्तुत किया जा सकता है (आईबीडब्ल्यूऔर ट्यूमर से मुक्त FBW), ट्यूमर, अंग, और ऊतक वजन।

7. स्नायु सेक्शनिंग

  1. चारों ओर -23 डिग्री सेल्सियस के लिए cryostat भीतरी कक्ष का काम कर रहे तापमान सेट करें।
  2. कार्य तापमान (कुछ घंटों के लिए पर्याप्त होना चाहिए) में जलवायु के अनुकूल बनाना करने के लिए नमूना (पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) की अनुमति दें।
  3. कट कई नमूना (अधिमानतः tibialis पूर्वकाल या gastrocnemius मांसपेशियों) और गिलास स्लाइड पर उन्हें लेने के 8 माइक्रोन मोटी वर्गों।
    ध्यान दें: पेशी के मध्य पेट क्षेत्र में खंड कट। इसके अलावा, सटीकता की खातिर, वर्गों लंबरूप बढ़ते अक्ष में कटौती।
  4. cryostat कक्ष के अंदर कांच स्लाइड रखें। उन्हें पिघलना अगर उद्देश्य IF / आईएचसी अध्ययन या एंजाइमी धुंधला प्रदर्शन करना है मत देना।
  5. आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर।

Laminin immunofluorescence द्वारा की Myofiber आकार 8. मूल्यांकन (वैकल्पिक 1)

19 निर्धारित करने के लिए। हालांकि एच ई पेशी वर्गों का धुंधला आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए एक मूल्यवान और सुविधाजनक तरीका का प्रतिनिधित्व करता है, अगर एक दृष्टिकोण 14 का उपयोग काफी तेजी से और एच ई-आधारित पद्धति से विनय अधिक सटीक है। एच एंड ई तरीके से नीचे वर्णित हैं।

  1. या तो cryostat या -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से ऊतक वर्गों निकालें और उन्हें कमरे के तापमान को संतुलित करने की अनुमति (लगभग 5 - 10 मिनट)।
    नोट: चूहों में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जुड़े गैर विशिष्ट बातचीत से बचने के लिए, यह या तो उपयोग एंटीबॉडी अन्य प्रजातियों में उठाया करने के लिए या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "माउस पर माउस" immunodetection किट का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।
  2. पूर्व ठंडी में विसर्जित कर दिया वर्गोंएड मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) के लिए 10 मिनट।
  3. 5 मिनट के लिए पीबीएस 1x कमरे के तापमान में वर्गों को धो लें।
  4. पीबीएस निकालें और स्लाइड पर वर्गों घेरना प्रतिरक्षाऊतकरसायन अनुप्रयोगों के लिए एक पेन का उपयोग करें। किसी भी बिंदु पर वर्गों पूरी तरह से सूखे ऐसा नहीं करते।
  5. आरटी पर 1 घंटे के लिए वर्गों पर - (पीबीएस में 8% FBS या पीबीएस में 5% बकरी सीरम 5) एक उपयुक्त अवरुद्ध बफर लागू करें।
  6. अवरुद्ध बफर निकालें।
  7. एक नम कक्ष में लागू करें या तो एक खरगोश विरोधी laminin (1:30) या आरटी पर 2 घंटे के लिए वर्गों के लिए बफर अवरुद्ध में एक माउस विरोधी dystrophin (1:30) प्राथमिक एंटीबॉडी (या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर)।
  8. 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों को धो लें।
  9. धोने बफर निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में फिर वर्गों धो लें।
  10. धोने बफर निकालें और एक उचित फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लागू होते हैं: आरटी पर 1 घंटे के लिए एक नम कक्ष में वर्गों के लिए (1 अवरुद्ध बफर में 1,000)।
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और 5 के लिए 1x पीबीएस के साथ वर्गों धोनेमि।
  12. धोने बफर निकालें और 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ धोने दोहराएँ। धोने बफर निकालें और एक जलीय आधारित माध्यम का उपयोग कर एक गिलास को कवर के साथ वर्गों को कवर किया।
  13. दाग खंड के डिजिटल छवियों का उपयोग करके पेशी के रूपात्मक सुविधाओं को पहचानें। आदेश में ऐसा करने के लिए, के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं वर्गों (एक 10X या 20X बढ़ाई उद्देश्य उपयुक्त है), एक डिजिटल कैमरा और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर के साथ। प्रत्येक डिजिटल छवि में एक पैमाने पर पट्टी की जगह (20 - 30 यादृच्छिक क्षेत्रों प्रत्येक मांसपेशी अनुभाग के लिए सिफारिश कर रहे हैं) सीएसए की मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए। छवियाँ .TIF प्रारूप में बचाया जाना चाहिए ImageJ प्रोग्राम का उपयोग कर छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संगत होना करने के लिए।
  14. एंडोमाइशियम 20 में फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी की उपस्थिति के माध्यम से सिकुड़ा ऊतक (myofiber आकार) से संयोजी ऊतक भेद करने के लिए एक ImageJ मैक्रो का प्रयोग करें।
    नोट: स्थूल और निर्देश प्रमाणन से उपलब्ध हैंओआरएस, रिचर्ड Lieber और शैनन Bremner।
  15. डेस्कटॉप पर चिह्न डबल-क्लिक करके ImageJ कार्यक्रम खोलें।
  16. एक बार "प्लगइन्स" टैब पर क्लिक करके सीएसए मैक्रो लोड। यह एक बार क्लिक करके "स्थापित करें" विकल्प का चयन करने के लिए कर्सर नीचे ले जाएँ।
  17. फ़ोल्डर में सहेजा गया है से चयन करके पार के अनुभागीय मैक्रो लोड, और फिर क्लिक करें "ओपन"।
  18. एक बार जब मैक्रो खोल दिया गया है, ImageJ उपकरण पट्टी से "फाइल" और फिर "ओपन" पर क्लिक करके पैमाने पर पट्टी युक्त ऊतकीय छवि को खोलने के।
  19. एक बार छवि खोला जाता है, सीधी रेखा के साथ आइकन पर क्लिक करके "सीधी रेखा उपकरण" ImageJ कार्यक्रम में चयन करें।
  20. एक बार "सीधे लाइन उपकरण" चुना जाता है, पैमाने पर पट्टी के बाएं सबसे अंत पर एक बार क्लिक करें और फिर पैमाने पर पट्टी का अधिकार सबसे अंत पर एक बार क्लिक करें। जब सही ढंग से किया है, वहाँ एक पीले रंग की लाइन पैमाने पर पट्टी पर मढ़ा होना चाहिए।
  21. कि Yello बनाने यकीन है किडब्ल्यू लाइन अभी भी पैमाने पर पट्टी पर मढ़ा जाता है, यह एक बार क्लिक करके ImageJ उपकरण पट्टी से "विश्लेषण" टैब का चयन करें।
  22. "विश्लेषण" टैब में, नीचे कर्सर ले जाने और "सेट पैमाने" का चयन यह एक बार क्लिक करके।
  23. "पैमाने पर सेट" विंडो में, नहीं "पिक्सेल में दूरी" बॉक्स में मान बदल सकता हूँ। "ज्ञात दूरी" बॉक्स में पैमाने पर पट्टी के नाम से जाना जाता दूरी दर्ज करें। पैमाने पर पट्टी इकाइयों (यानी, माइक्रोमीटर = माइक्रोन) के साथ पत्र व्यवहार करने के लिए "लंबाई की इकाई" बॉक्स में इकाइयों को बदलें। अंत में, चुनें "वैश्विक" "ग्लोबल" एक बार के बाईं ओर बॉक्स पर क्लिक करके।
  24. "पैमाने पर सेट" विंडो बंद करें।
  25. पहली छवि खोलें कीबोर्ड पर "हे" बटन दबाने से मापा जाएगा। एक खिड़की पॉप-अप उपयोगकर्ता खोजने के लिए और छवि का चयन करने के लिए फ़ोल्डर में सहेजा गया है से मापा जा करने की अनुमति देता है कि निरीक्षण करें। एक बार उस पर क्लिक करें और तब क्लिक करके छवि का चयन करें "खोलें।"
  26. <li> एक बार खोला, एक खिड़की सीएसए के मापन के लिए और घेरा के लिए स्वीकार्य सीमा के चयन के लिए प्रकट करना चाहिए।
    नोट: ये सेटिंग्स आमतौर पर अपने मूलभूत मूल्यों के लिए छोड़ दिया जाता है। हालांकि, अगर एक इन सेटिंग में बदलाव करना चाहती है, प्रत्येक लगातार छवि के लिए एक ही मूल्यों रखने के लिए यकीन है कि प्रयोग में मापा जा करने के लिए किया जाना है।
  27. सीएसए रेंज और घेरा स्थापित करने के बाद, एक "सीमा" खिड़की के साथ छवि लाल पिक्सल में शामिल किया निरीक्षण करते हैं। जब तक मांसपेशी फाइबर सही लाल पिक्सल के साथ में भर रहे हैं "सीमा" विंडो में छवि की दहलीज सलाखों का उपयोग कर समायोजित करें।
    नोट: फाइबर कि एक दूसरे को छू नहीं कर रहे हैं की सबसे बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए प्रयास करना; यदि तंतुओं को छू रहे हैं, वे एक बड़े फाइबर, जो नीचे की ओर से संपादित किया जा करने की आवश्यकता होगी के रूप में मापा जाएगा।
  28. सीमा की स्थापना के बाद, मांसपेशी फाइबर को मापने के लिए कीबोर्ड पर "1" बटन दबाएँ।
  29. एक पीले रंग की लाइन के साथ अलग-अलग मांसपेशी फाइबर चक्र।छवि के माध्यम से ले जाएँ और कलाकृतियों या डबल फाइबर कि इस कार्यक्रम के द्वारा चयनित किया गया है हटा दें। ऐसा करने के लिए, संरचनाओं कि उन्हें एक बार क्लिक करके फाइबर नहीं हैं का चयन करें, और फिर कीबोर्ड पर "डी" बटन दबाएँ। इससे उन्हें माप से हटाना होगा।
  30. का चयन करें और माप से कॉपी "माप मूल्य खिड़की," और उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट में पेस्ट करें।
    नोट: मूल्यों प्राप्त भी फाइबर वितरण विश्लेषण है, जो आम तौर पर यह निर्धारित करने के ट्यूमर के विकास को छोटे मांसपेशी फाइबर की दिशा में एक पारी को बढ़ावा देता है कि क्या एक उपयोगी पैरामीटर का प्रतिनिधित्व आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  31. खिड़कियों के ऊपर-बाएँ कोने में "एक्स" पर क्लिक करके ImageJ में खुले खिड़कियों के सभी बंद करें।
  32. 8.29 - एक नई छवि खोलें "ओ" दबाने और दोहरा कदम 8.24 से मापा जा सकता है।

9. एच एंड ई दाग वर्गों से Myofiber आकार का मूल्यांकन (वैकल्पिक 2)

  1. कांच की जगहCoplin जार में स्लाइड 8 मिनट के लिए हैरिस hematoxylin फ़िल्टर हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, मेयर hematoxylin अगर एक कम तीव्र दाग वांछित है इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. विआयनीकृत पानी में स्लाइड्स कुल्ला।
  3. अप करने के लिए 5 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड्स डुबकी।
  4. उन्हें जल्दी विआयनीकृत पानी में कुल्ला, और फिर कम से कम 2 मिनट के लिए फ़िल्टर 1% eosin समाधान में उन्हें सेते हैं।
    नोट: एक और अधिक तीव्र दाग वांछित है, में से 1 - eosin समाधान के लिए एसिटिक एसिड के 2 बूँदें (0.01% या उससे कम)।
  5. निर्जलीकरण कदम शुरू। कम से कम 1 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में स्लाइड्स कुल्ला।
  6. 1 मिनट के लिए 90% इथेनॉल में स्लाइड्स डुबकी।
  7. 1 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में स्लाइड्स डुबकी।
  8. 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्लाइड्स डुबकी।
  9. 2 मिनट के लिए xylene में स्लाइड्स डुबकी। 2 मिनट के लिए और अधिक ताजा xylene युक्त एक और कोप्ले जार करने के लिए स्लाइड ले जाएँ।
    नोट: (अब 1 घंटा से) xylene में स्लाइड रखें जब तक वे coverslipped रहे हैं।
  10. coversli रखेंPermount या पसंद का एक ज़ाइलीन आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर पेशी वर्गों पर भज।
  11. एक 20X बढ़ाई साथ एक खुर्दबीन के नीचे एच ई-कांच स्लाइड का निरीक्षण करें, और पूरे पेशी खंड क्षेत्र के चित्रों के अधिग्रहण। एक उज्ज्वल प्रकाश माइक्रोस्कोप, डिजिटल कैमरा, और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों प्राप्त करते हैं।
    नोट: पैमाने बार या एक माइक्रोमीटर ही बढ़ाई लिया की छवि की उपस्थिति सीएसए निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। जैसा कि ऊपर, रिकॉर्ड कम से कम 20 - 30 प्रत्येक मांसपेशी अनुभाग के लिए यादृच्छिक खेतों।
  12. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग myofiber आकार का मूल्यांकन। हर डिजिटल छवि खोलें। जैसा कि ऊपर पैमाने पर सेट। उपाय मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग पेशी अनुसार कम से कम 1,500-2,000 मांसपेशी फाइबर, एक माउस के साथ फाइबर परिधि अनुरेखण या, तेजी से इनपुट के लिए, एक गोली इनपुट डिवाइस और कलम के साथ।

10 डेटा संग्रह और विश्लेषण

  1. आदेश मांसपेशी फाइबर आकार की स्थापना के लिए औसत फाइबर "क्षेत्र का आकलन करें।"क्या प्रयोगात्मक सेटिंग या तो छोटा या बड़ा मांसपेशी फाइबर की दिशा में एक बदलाव के साथ जुड़ा हुआ है मूल्यांकन करने के लिए दोनों क्षेत्र और Feret व्यास सहित प्रत्येक मांसपेशी, के लिए प्राप्त की माप के लिए साधन और एसडी गणना। इसके अलावा, क्रम में, विश्लेषण" फाइबर वितरण । "
  2. दो समूहों के लिए एक unpaired टी परीक्षण के प्रदर्शन से परिणाम के महत्व का मूल्यांकन। C26 चूहों के समूह के लिए और नियंत्रण समूह के लिए प्राप्त मूल्यों के बीच के अनुपात का निर्धारण करते हैं। एक ग्राफ रिपोर्टिंग साधन एसडी और आवृत्ति वितरण / हिस्टोग्राम फाइबर आकार में बदलाव का प्रदर्शन करने के उद्देश्य पर मूल्यों प्लॉट।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इंजेक्शन के बाद 8 डी, घातीय सेल के विकास के द्वारा पीछा (4 - - 5 घ) C26 ट्यूमर के विकास कैनेटीक्स के लिए पहले 7 एक अंतराल चरण दिखा। ट्यूमर जन अंततः (चित्रा 1 ए-बी के बारे में 2 जी) पहुँचता है ~ शरीर के वजन का 10%। पहले चरण के दौरान, ट्यूमर केवल टटोलने का कार्य करके जा सकता है और त्वचा के एक छोटे फलाव के रूप में प्रकट होता है। दूसरे चरण में, ट्यूमर त्वचा के नीचे एक जन के रूप में मनाया जाता है। शायद ही कभी, ट्यूमर एक खुला घाव है, जिसके परिणामस्वरूप ulcerated बन जाता है; इस मामले में, माउस प्रयोगात्मक समूह से बाहर रखा गया है और नम्रता से euthanized है।

शरीर का वजन पहले चरण में कोई बदलाव नहीं है, लेकिन यह भी महत्वपूर्ण है, दूसरे चरण में कम हो जाता है, जब यह पहुँचता है 10 - प्रारंभिक शरीर के वजन के 15% (ट्यूमर मुक्त वजन के मामले में 30%, चित्रा 1 ए)। ट्यूमर असर चूहों बर्बाद और के अंत में बिखेरा फर दिखाया दिखाई देते हैंप्रयोगात्मक अवधि, एक शरीर हालत (बीसी) के साथ 1 18 (चित्रा 1 सी) के बराबर स्कोर। BC1 एक गंभीर रूप से क्षीण माउस, जहां कंकाल संरचनाओं स्पष्ट कर रहे हैं और कशेरुकाओं साफ़ खंडों प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। शरीर के वजन घटाने मुख्य रूप से दोनों कंकाल की मांसपेशियों और वसा ऊतकों को बर्बाद कर (चित्रा 1 बी) के लिए जिम्मेदार है। Gastrocnemius में कंकाल की मांसपेशी वजन में 30%, विशेष रूप से, tibialis पूर्वकाल, और quadriceps (चित्रा 2) - शरीर के वजन घटाने के बारे में 20 की कमी के साथ संगत है। हृदय की मांसपेशी भी काफी हद तक कम करने के लिए हालांकि वजन में कम हो जाता है, जब अन्य कंकाल की मांसपेशियों (चित्रा 2) की तुलना में। (-70%, पी दिलचस्प है, हिपेटोमिगेली (+ 16%, पी <0.01) और तिल्ली का बढ़ना (+ 110%, पी <0.01) आम तौर पर, ट्यूमर मेजबानों में पता चला रहे हैं, जबकि वसा द्रव्यमान, कंकाल की मांसपेशी के समान है, गंभीर रूप से समाप्त हो गया है <0.001 चित्रा 3)।

(चित्रा -4 ए-बी) के माध्यम से मांसपेशी फाइबर सीएसए के morphometric मूल्यांकन के बाद मनाया जाता है। विशेष रूप से, आवृत्ति वितरण विश्लेषण C26 असर चूहों में छोटे आकार के तंतुओं की दिशा में एक पारी से पता चला है, इस प्रकार का सुझाव है कि पूरे मांसपेशी एक C26 ट्यूमर (चित्रा 4C) की उपस्थिति में शोष आए। इसी तरह के परिणाम, फाइबर आकार की मात्रा का ठहराव के लिए एक पारंपरिक एच ई-आधारित पद्धति का लाभ लेने से मनाया जा सकता है, हालांकि कैंसर के विकास के साथ जुड़े पेशी सीएसए में परिवर्तन की भयावहता थोड़ा (38% नियंत्रण बनाम, अगर अलग के लिए पी <0.01 है आधारित विधि; नियंत्रण बनाम -18%, पी <एच ई-आधारित पद्धति के लिए 0.01, चित्रा 5)।

आकृति 1
चित्रा 1: नियंत्रण और C26 असर चूहों में शरीर के वजन। ए) नियंत्रण और पूरे प्रयोगात्मक अवधि में C26 होस्ट (14 दिन ट्यूमर इंजेक्शन के बाद)। बी) के प्रारंभिक शरीर के वजन (आईबीडब्ल्यू), अंतिम ट्यूमर मुक्त शरीर के वजन (FBW), और नियंत्रण और C26- में ट्यूमर वजन में शरीर के वजन वक्र असर पशुओं। सी) ट्यूमर टीका के बाद बलिदान (14 दिन के समय में नियंत्रण और C26 पदाधिकारियों के प्रतिनिधि तस्वीरें)। डेटा के रूप में मतलब एसडी व्यक्त कर रहे हैं। एन = 6 मतभेदों के महत्व: * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001 छात्र की टी परीक्षण का उपयोग नियंत्रण समूह की तुलना में। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: नियंत्रण और सी में स्नायु बाट26 असर चूहों। Tibialis, gastrocnemius, quadriceps, और दिल नियंत्रण और C26 ट्यूमर पदाधिकारियों में वजन वजन / 100 मिलीग्राम आईबीडब्ल्यू के रूप में सूचित कर रहे हैं। डेटा के रूप में मतलब एसडी व्यक्त कर रहे हैं। एन = 6 मतभेदों के महत्व: ** पी <0.01 और *** पी <0.001 छात्र की टी परीक्षण का उपयोग नियंत्रण समूह की तुलना में।

चित्र तीन
चित्रा 3:। नियंत्रण और अंग में बाट C26 असर चूहों जिगर, नियंत्रण और C26 ट्यूमर पदाधिकारियों में तिल्ली, और अधिवृषणी वसा पैड वजन वजन / 100 मिलीग्राम आईबीडब्ल्यू के रूप में सूचित कर रहे हैं। डेटा के रूप में मतलब एसडी व्यक्त कर रहे हैं। एन = 6 मतभेदों के महत्व: ** पी <0.01 नियंत्रण समूह की तुलना में।

चित्रा 4
चित्रा 4: के लिए Myofiber आकार immunofluorescence द्वारा Morphometry। ए) नियंत्रण और C26 मेजबान से एक विरोधी dystrophin एंटीबॉडी (वेक्टर प्रयोगशालाओं) का उपयोग tibialis वर्गों के फ्लोरोसेंट प्रतिरक्षाऊतकरसायन प्रतिक्रिया। बढ़ाई: 10X। आकार पट्टी:। 100 माइक्रोन बी) tibialis मांसपेशियों पर नियंत्रण और C26 असर चूहों की tibialis मांसपेशियों में सीएसए के ImageJ मैक्रो सी) आवृत्ति वितरण के साथ मापा में सीएसए की मात्रा।। डेटा ± एसडी मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। एन = प्रत्येक समूह के लिए 6। मतभेद का महत्व: ** पी <0.01 छात्र की टी परीक्षण का उपयोग नियंत्रण समूह की तुलना में।

चित्रा 5
चित्रा 5: एच ई द्वारा Myofiber आकार के लिए Morphometry। ए) Hematoxylin और eosin नियंत्रण और C26 मेजबान से tibialis वर्गों के धुंधला हो जाना। बढ़ाई: 20X। आकार पट्टी:। 100 माइक्रोन बी) की मात्रा और आवृत्ति वितरणtibialis मांसपेशियों में सीएसए। डेटा के रूप में मतलब एसडी व्यक्त कर रहे हैं। एन = 6 मतभेद का महत्व: *** पी <0.001 छात्र की टी परीक्षण का उपयोग नियंत्रण समूह की तुलना में।

लेखक माउस तनाव माउस लिंग मोबाइल नम्बर मूल ठोस ट्यूमर के रूप में प्रत्यारोपित किया? इंजेक्शन के स्थल दिन
लाजर एट अल।, 1999 CD2F1 एम 5 एक्स 10 5 NCI नहीं पृष्ठीय क्षेत्र 17
अल-माजिद और मैकार्थी, 2001 CD2F1 एफ 2.5 x 10 6 OSUMC नहीं पृष्ठीय क्षेत्र 17
सैमुअल्स एट अल।, 2001 Balb / सी एम 0.5 ट्यूमर निलंबन की ग्राम / मिलीलीटर एनएस हाँ पृष्ठीय क्षेत्र अप करने के लिए 11
Acharyya एट अल।, 2004 CD2F1 एम 1 10 x 7 OSUMC नहीं सही दिशा अप करने के लिए 24
Aulino एट अल।, 2010 Balb / सी एनएस 0.5 मिमी 3 NCI हाँ पृष्ठीय क्षेत्र 21
बेनी-Klimek एट अल।, 2010 CD2F1 एफ 1 एक्स 10 6 OSUMC नहीं पृष्ठीय क्षेत्र 14
Bonetto एट अल, 2011। 2012 CD2F1 एफ 1 एक्स 10 6 OSUMC नहीं पृष्ठीय क्षेत्र
Cosper और Leinwand, 2010 CD2F1 M + F 5 एक्स 10 5 एनएस नहीं सही दिशा अप करने के लिए 27
मर्फी एट अल।, 2012 CD2F1 एनएस 5 एक्स 10 5 NCI / OSUMC नहीं पृष्ठीय क्षेत्र 14
कॉर्नवेल एट अल।, 2014 CD2F1 एम 5 एक्स 10 5 NCI नहीं सही और बायीं ओर अप करने के लिए 26
अस्सी एट अल।, 2016 Balb / सी एनएस 1 एक्स 10 6 सेल लाइन सेवा नहीं पृष्ठीय क्षेत्र अप करने के लिए 22

तालिका 1:। विभिन्न C26 आरोपण के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल की तुलना एडवेंचर्सC26 आरोपण के लिए टी प्रोटोकॉल माउस इस्तेमाल किया तनाव के विशेष संदर्भ में, प्रदान की जाती हैं, सेल नंबर और ट्यूमर के प्रकार टीका, सेल मूल, इंजेक्शन की साइट है, और प्रयोगात्मक अवधि की लंबाई। OSUMC: ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर। NCI: राष्ट्रीय कैंसर संस्थान। वाणिज्यिक सेल लाइन सेवा NS: निर्दिष्ट नहीं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

विशेष रूप से अपनी नवीनतम दौर में, कोलोरेक्टल कैंसर दुर्बलता का विकास है, जो गरीब परिणामों और जीवन के मरीज की गुणवत्ता में कटौती के लिए जिम्मेदार है के साथ जुड़ा हुआ है। कई अध्ययनों से कैंसर के लिए माध्यमिक शर्तों के उपचार पर ध्यान केंद्रित किया है; हालांकि, इस दिशा में कई प्रयासों के बावजूद, वहाँ अभी भी कैंसर दुर्बलता 21 के लिए कोई अनुमोदित चिकित्सा है। इस प्रकार, यह जरूरी है कि पशु मॉडल आदेश निष्कर्षों का अनुवाद अधिकतम करने के लिए निकट के रूप में संभव के रूप में मानव विकृति जैसे लगते हैं।

C26 ट्यूमर असर चूहों कैंसर दुर्बलता 22-24 का आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगात्मक मॉडल हैं। इस मॉडल को बारीकी से मानव रोग जैसा दिखता है शरीर, मांसपेशियों, और वसा द्रव्यमान, साथ ही मांसपेशी फाइबर शोष में कटौती और भड़काऊ जीन और प्रोटीन उल्लेखनीय hypercatabolism 2,5 के साथ संगत कर यूबीक्यूटिन ligases की वृद्धि की अभिव्यक्ति दिखा। इस के बावजूद, डेटा के साथ कुछ असमानताओं कैंसर patie में प्राप्तएनटीएस 25,26 सूचना दी गई है। दरअसल, गैर शारीरिक विकास पर्यावरण सहित मॉडल की कुछ सुविधाओं, अन्य मॉडलों के (जैसे, आनुवंशिक या ओर्थोटोपिक इंजेक्शन की तुलना में (जैसे, एक अस्थानिक ट्यूमर subcutaneously के बजाय बड़े हो orthotopically सैनिक पथ में प्रत्यारोपित), अपेक्षाकृत कम अवधि प्रयोगात्मक ट्यूमर), आईएल -6 कार्रवाई पर निर्भरता, और CD2F1 या Balb / ग चूहों की आवश्यक उपयोग गंभीर सीमाओं का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं और परिणाम की व्याख्या को विवश कर सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल कई, हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन ही विशेषताओं को बनाए रखने और अलग अलग समय पर प्राप्त परिणामों के बीच तुलना की अनुमति के प्रयोगों भर में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साबित हो गया है, विभिन्न भौगोलिक स्थानों में, और विभिन्न शोधकर्ताओं 3,10 द्वारा। हालांकि, के लिए डेटा के reproducibility बढ़ावा देने के लिए, यह महत्वपूर्ण स्पष्ट और आम दिशा निर्देशों की स्थापना है।

gathere के रूप मेंसाहित्य से डी, कई निरंतर दो अलग प्रयोगशालाओं में एक ही डेटा के प्रजनन को रोकने सकता है। एक ही कारण के लिए, अलग प्रोटोकॉल का उपयोग परस्पर विरोधी और संदिग्ध परिणाम के लिए अलग phenotypes और परिणामों के साथ-साथ नेतृत्व उत्पन्न हो सकता है। दरअसल, इस पशु मॉडल प्रदर्शन में मतभेद, सूचित किया गया है मुख्य रूप से तनाव (Balb / सी या CD2F1) 2,5,27-29 या चूहों के यौन संबंध से उत्पन्न 17 का इस्तेमाल किया, ट्यूमर के प्रकार है कि प्रत्यारोपित किया गया था (एक सेल निलंबन 3 29 के बजाय एक भ्रष्टाचार 2,30) में एक ठोस ट्यूमर, ट्यूमर स्रोत (NCI, ATCC, या OSUMC), C26 कोशिकाओं की संख्या कि इंजेक्शन थे, और इंजेक्शन या आरोपण की साइट (flanks 6,17, 31 या पृष्ठीय क्षेत्र 3,10,32)। C26 सेल विभिन्न स्रोतों (मुख्य रूप से NCI बनाम OSUMC) से प्राप्त लाइनों का आरोपण के साथ जुड़े प्रभाव का कोई प्रत्यक्ष तुलना कभी प्रदर्शन किया गया है, इस प्रकार हमें कोई निश्चित conclusi ड्राइंग से रोकनेons। हालांकि, यह संभावना है कि कोशिकाओं के स्रोत का चुनाव भी काफी उम्मीद परिणामों को प्रभावित कर सकते है। जब महिलाओं की तुलना में पुरुषों के विकल्प पर विचार कर, जांचकर्ताओं परिणामों में महत्वपूर्ण मतभेद की याद दिला दी जानी चाहिए। दरअसल, के रूप में Cosper और Leinwand 17 द्वारा रिपोर्ट, पुरुष ट्यूमर असर चूहों, एस्ट्रोजेन के अभाव के कारण महिलाओं की तुलना में एक अधिक गंभीर phenotype, अधिक से अधिक हृदय जन हानि और मृत्यु दर, ट्यूमर के लिए एक और अधिक मजबूत समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया सहित दिखा सकते हैं , और अधिक से अधिक हृदय भोजी।

खासकर उन लोगों के जांचकर्ताओं है कि इस मॉडल से परिचित नहीं हैं और शुरू में दोनों एक शक्ति विश्लेषण और हमारे पिछले अनुभव, प्रयोगात्मक हालत के अनुसार कम से कम 6 जानवरों (एन = 6) आदेश सांख्यिकीय रूप से पता लगाने के लिए सलाह दी जाती है के उपयोग पर आधारित समस्याओं का सामना कर सकते हैं, के लिए महत्वपूर्ण मतभेद। यह भी महत्वपूर्ण है कि यादृच्छिकीकरण ध्यान से तो प्रायोगिक पशुओं में है कि प्रारंभिक शरीर के वजन, किया जाता हैसमूहों के बीच काफी अलग नहीं है। इसी प्रकार, यह सलाह दी जाती है कि, ताकि अंतर-ऑपरेटर परिवर्तनशीलता से बचने के लिए, एक ही अन्वेषक हर जानवर पर ऊतक और अंग संग्रह करते हैं। इसके अलावा, यह जरूरी है कि ऊतकों (विशेष रूप से मांसपेशी) के रूप में तेजी से संभव के रूप में आदेश, आरएनए और enzymatic संरचना और गतिविधि की रक्षा करने के लिए अध्ययन के लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए या enzymatic गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए है, खासकर अगर में जमे हुए हैं। इसके अलावा, मांसपेशियों सीएसए निर्धारित करने के प्रयास में, हम पता चला है कि फाइबर क्षेत्र रिपोर्टिंग आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं और मांसपेशियों के फाइबर आकार का प्रतिनिधि है। यहाँ, हम दो अलग-अलग तरीकों पेशी सीएसए का आकलन करने के लिए उपस्थित थे। के रूप में आंकड़े 4-5 में दिखाया गया है, दोनों तरीकों, नियंत्रण और ट्यूमर मेजबान के बीच myofiber आकार में एक महत्वपूर्ण कमी का पता लगाने में सक्षम थे, हालांकि बर्बाद कर के डिग्री अलग दिखाई दिया।

इस विसंगति तथ्य यह है कि, हालांकि दोनों तरीकों गधे को स्वीकार्य तरीके हैं से हो सकता हैएस मांसपेशी फाइबर आकार, एच एंड ई दाग स्लाइड से पेशी विशेषताओं की मात्रा का ठहराव अभी भी एक मैनुअल या अर्द्ध स्वचालित प्रक्रिया को सबसे अधिक बार श्रम प्रधान, समय लेने वाली है, और सीमित सटीकता से प्रभावित है। हमारे अनुभव के आधार पर, हम मानते हैं कि अगर आधारित पद्धति पेशी सीएसए रिपोर्ट करने के लिए एक अधिक सटीक तकनीक है। दरअसल, फाइबर कि इस तकनीक का लाभ लेने के द्वारा स्वचालित रूप से मापा जा सकता है की संख्या में काफी बड़ा है, इस प्रकार की माप की सटीकता बढ़ रही है। ध्यान से, दोनों तकनीकों के लिए, रिपोर्टिंग मांसपेशियों का आकार का एक वैकल्पिक तरीका Feret व्यास का आकलन है। दिलचस्प है, इस तथ्य यह है कि इस पैरामीटर सेक्शनिंग के कोण की काफी हद तक स्वतंत्र है की वजह से एक बहुत ही विश्वसनीय उपकरण माना जाता है। इस तरह के "कम से कम भीतरी व्यास" और "कम से कम बाहरी व्यास" के रूप में अन्य मानकों को भी सेक्शनिंग के विमान को असंवेदनशील हैं और मिथ्या के विकल्प के रूप में संकेत Feret व्यास के बजाय प्रयोग किया जा सकता हैएर आकार।

अंत में, हालांकि दुर्बलता समुदाय स्पष्ट रूप से ट्यूमर जुड़े मांसपेशी बर्बाद के अध्ययन के लिए अधिक शारीरिक मॉडल स्थापित करने की जरूरत है, हमें विश्वास है कि असर C26 बृहदान्त्र कार्सिनोमा चूहों आणविक परिवर्तन जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से मानकीकृत और आसान करने के लिए उपयोग मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं और शारीरिक असामान्यताएं आमतौर पर एक ट्यूमर की घटना के बाद पता चला। भविष्य अनुप्रयोगों बृहदान्त्र में C26 कोशिकाओं के ओर्थोटोपिक आरोपण कोलोरेक्टल कैंसर दुर्बलता का एक उचित और अधिक शारीरिक मॉडल का प्रतिनिधित्व हो सकता है कि क्या की जांच शामिल होगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Flasks Falcon - Becton Dickinson 35-5001
DMEM Cellgro 10-017-CV
FBS Gibco 26140
Streptomycin-Penicillin  Cellgro 30-002-CI
CD2F1 mice Harlan 060
Anesthesia apparatus EZ-Anesthesia EZ-7000
2-Methyl Butane Sigma-Aldrich M32631
OCT Tissue-Tek 4583
Cryostat Leica CM1850
Cork disks Electron Microscopy Sciences 63305
Superfrost plus glass slides VWR 48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody Vector Laboratories VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG Life Technologies A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG Life Technologies A21211
Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS216
Eosin Sigma-Aldrich HT110332
Xylene Acros Organics 422680025
Cytoseal-XYL Thermo 8312-4
Microscope Zeiss Observer.Z1 
Bamboo Tablet Wacom CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011 Microsoft Corp.
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer BD 365873

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
  2. Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
  3. Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
  4. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
  5. Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
  6. Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
  7. Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
  8. Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
  9. Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
  10. Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
  11. Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
  12. Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
  13. Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
  14. Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
  15. Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
  16. Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
  17. Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
  18. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
  19. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
  20. Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
  21. Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
  22. Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
  23. Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
  24. Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
  25. Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
  26. Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
  27. Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
  28. al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
  29. Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
  30. Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
  31. Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
  32. Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
आंतों-26 कार्सिनोमा ट्यूमर असर कर्क कैचेक्सिया के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में माउस
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).More

Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter