Introduction
Атрофия мышц является серьезным осложнением различных клинических состояний, таких как рак, сепсис, печени, цирроз печени, сердца и почечной недостаточности, хронической обструктивной болезни легких и СПИД. В частности, истончение мышц очевидно , по крайней мере , у 50% пациентов с раком 1. Потеря скелетных мышц в результатах рака с повышенной деградации белка из - за чрезмерной активации скелетных мышц системы протеолитических и / или из -за снижения синтеза белка 6. Липолиз также очевидно, что приводит к истощению жировой ткани. Клинически, кахексия связано со снижением качества и продолжительности жизни , и, по оценкам, причиной смерти в 20 - 30% раковых больных 7. Использование экспериментальных моделей, которые напоминают человеческую болезнь настолько близко, насколько это возможно было бы полезно. Оптимальная модель животного характеризуется высокой воспроизводимостью, а также ограниченного вмешательства со стороны различных терапий и непредсказуемых факторовдиеты, секс, и генетический фон, которые обычно связаны с клиническим состоянием 8. До сих пор, раковая кахексия изучено в основном в моделях на животных, характеризующихся трансплантацией раковых клеток или инъекции канцерогенов, хотя новый метод состоит в использовании генетически модифицированных мышей, восприимчивых к развитию рака.
Мыши , несущие C26 карциномы (также упоминается как двоеточие-26 и аденокарциномы) представляют собой хорошо охарактеризованных и широко используемой моделью раковая кахексия 2,5. Рост результатов опухоли С26 в организме и потере мышечной массы тела, в основном за счет расширения жира и белка катаболизма 9. Как правило, вес опухоли на 10% по отношению к общей массы тела ассоциируется с уменьшением на 20-25% в скелетной мышечной массы и большим истощением жира 3,10. Гепатомегалии и спленомегалии наблюдаются с ростом опухоли, наряду с активацией ответной реакции острой фазы и возвышения про-Inflammatory уровни цитокинов 3,11. Среди них, как хорошо известно , что IL-6 играет ключевую роль в опосредовании атрофию мышц в модели C26, даже если этот цитокин, вероятно , не только индуктором кахексии 12. Повышенные ИЛ-6 вызывает атрофию мышц за счет активации пути JAK / STAT3, и ингибирующих этот фактор транскрипции может предотвратить атрофии мышц 3,4.
Во время С26-индуцированной атрофии мышц, как и во многих условиях атрофии мышц, мышечная масса теряется в основном за счет сокращения содержания мышечного белка через мышечных волокон, а не через смерть или потерю волокон 13 клеток. В C26 кахексии, сдвиг в сторону меньших площадей поперечного сечения наблюдается в обоих гликолитических и окислительных волокон 2. Это также согласуется с пониженной мышечной силы 5. Многие группы по всему миру воспользовались модели C26 с целью выявления новых медиаторов атрофии мышц или клинически значимых препаратов для ККА ракаhexia. Тем не менее, множество различных процедур для использования этой модели было зарегистрировано, вызывает обеспокоенность по поводу согласованности полученных данных и создает барьеры для воспроизводимости в различных экспериментальных условиях. Здесь мы сообщаем типичное использование этой модели для изучения кахексии рака, который дает стандартизированные и воспроизводимые данные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все исследования, описанные были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитетов университета Томаса Джефферсона и Университета Индианы Школа Медицины.
1. C26 роста клеток и подготовка
- Получение C26 клеток колоректального рака (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) и подготовить полную ростовую среду (то есть с высоким содержанием глюкозы Дульбекко модифицированной Игла Средний (DMEM) , содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 1% глутамин и 1% стрептомицина / пенициллин).
Примечание: Для того, чтобы обеспечить более эффективное между экспериментальной воспроизводимости, то предпочтительно использовать клетки С26 при прохождении как можно более низкой. - Используйте имеющийся в продаже счетчика клеток на пластину 50000 клеток / см 2 в колбах с полной среде роста. Выдержите их в увлажненной атмосфере при температуре 37 ° С и 5% CO 2 , пока к югу от вырожденная. Избегайте их культивирования при высокой плотности к предлор дифференциация и дрейфующих клеточных фенотипов.
- После первого прохода, пластинчатые достаточное количество клеток, чтобы имплантировать в плановом количестве животных. В день имплантации клеток, диссоциирует клетки путем обработки трипсином с 0,02 мл 0,25% раствора трипсина-ЭДТА на см 2, нейтрализовать трипсина путем добавления , по меньшей мере , 3 мл свежей среды на мл трипсина, определяют концентрацию клеток в клетках / мл , и ресуспендируют количество клеток , необходимых для эксперимента (1 × 10 6 клеток на мышь) в стерильном PBS.
Примечание: C26 клетки достигают слитности , когда плотность составляет около 500 000 клеток / см 2.
2. Мыши
- Перемешайте взрослых CD2F1 мышей (по крайней мере, в возрасте 8 недель) на группы (обычно контролирует и опухолевые-носителями) с по меньшей мере, п = 6 в группе.
Примечание: C26 опухоли растут в Balb / с мышей, а также. Однако, основываясь на нашем опыте, мышей CD2F1 представляют собой более универсальный и экономический хост для данной конкретной модели опухоли. Более того,сходны с клиническими параметрами и результатами , сообщаемыми в других экспериментальных моделях рака ассоциированных с истончение мышц 14-16, половые различия в ответ на C26 кахексии также может наблюдаться 17 (см также таблицу 1). - Обезболить мышь, используя изофлуран при вдыхании (3% кислорода). Поддерживать животное под анестезией исключительно на время, необходимое для выполнения инокуляции опухоли. Убедитесь, что мышь лежит на нагретую площадку для того, чтобы предотвратить потерю тепла тела. Перед началом процедуры инъекции опухоли, подтверждают надлежащее обезболивание, осторожно щипать задние пальцы.
Примечание: Из-за длительности этой процедуры (обычно несколько секунд), использование ветеринарной глазной мази не требуется. По той же причине, контрольные животные, подвергающиеся операции фиктивный не ожидается, чтобы похудеть. - С помощью стерильной 1 мл шприц инсулина с 26-го калибра иглы, быстро вводят 250 мкл раствора, содержащего тumor клетки подкожно и intrascapularly в жировой ткани мыши.
Примечание: Контрольные животные получают 250 мкл стерилизованного физиологического раствора; intrascapularly в жировой ткани. - Поместите животное обратно в клетку. Непосредственно наблюдать мышь не реже одного раза каждые 15 мин, пока он не может ответить на пологом манипуляции и восстановила рефлекса выпрямления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте мышь без присмотра, и держать его в теплом восстановления клетки, которая содержит твердую подложку. Кроме того, не возвращают мышь к животному комнате, пока она не будет полностью оправился от наркоза. Как правило, у мышей не должны быть размещены по отдельности, если исследователь не направлен на оценку индивидуального потребления пищи. Если дело обстоит именно так, и использование автоматизированных клеток метаболических не доступно, запись в ручном режиме потребления пищи должно выполняться, возможно, ежедневно, и в то же время каждый день. - Проверьте мышей ежедневно и записывать их веса тела.
Примечание: Запись оценка состояния тела идомашняя клетка поведения могут дифференцировать степень кахексии и болезни поведения, что является полезным для изучения 18 лечения.
3. Эвтаназия и забора крови
- Когда потеря веса тела в опухолевых хозяев по сравнению с контролем достигает 5%, 10%, или 15% (легкая, умеренная и тяжелая кахексия, соответственно) по сравнению с их начальным весом тела, усыпить мышей.
Примечание: Типичный эксперимент будет проводиться до тех пор, одна группа не достигнет 10% потери массы, при которой время умерщвляют все группы. Тело потеря веса оценивается путем измерения веса тела включительно опухоли. - Поместите мышь под общим наркозом изофлуран (3% кислорода). Забор крови с помощью пункции сердца (примерно 1 - 1,5 мл).
- Собрать кровь в K 2 -ЭДТА (18 мг) пустые трубки и поместить их на лед. Центрифуга кровь (2000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С) и собирают плазмы / сыворотки.
- Эвтаназии мыши с помощью Cervical дислокации. Перейдите к иссечение тканей и органов коллекции.
4. тканей и органов Иссечение
Примечание: Для использования тканей в биохимических или молекулярно-биологических анализов, планируют взвесить каждый орган и ткань и поместить фрагмент непосредственно в предварительно меченных криопробирок. Мгновенного замораживания в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° C.
- Для того чтобы избежать загрязнения образцов ткани с мехом, спрей 70% этанола по всему телу.
- Поместите мышь на рассечение кровати в положении лежа на спине и продлить конечности вертикально путем прикрепления стопы к поднятому зажим бюретки.
- Захватите кожу нижней конечности с Дюмон пинцетом и использовать криволинейные тонких ножниц, чтобы аккуратно снять кожу и фасции, обнажая основные мышцы животы нижней конечности.
- Определить икроножной мышцы на задней нижней конечности по своему происхождению на латеральной и медиальной мыщелков на заднюю часть бедренной кости и его вставки впяточной через пяточная сухожилие.
- Перейдите к разрезал икроножной пяточную сухожилие. Возьмитесь дистального конца икроножной с Дюмон щипцами и тянуть мышцы живота к своему происхождению. Используя ножницы, вырезать мышцы в начале координат, как можно ближе к бедренной кости. Поместите мышцы в блюдо. Взвесить его сразу и заморозить ее в трубке в жидком азоте.
Примечание: Убедитесь, что не иссечь камбаловидной мышцы вместе с икроножной. Если это произойдет, осторожно удалите камбаловидной, осторожно потянув его с помощью пинцета.
- Перейдите к разрезал икроножной пяточную сухожилие. Возьмитесь дистального конца икроножной с Дюмон щипцами и тянуть мышцы живота к своему происхождению. Используя ножницы, вырезать мышцы в начале координат, как можно ближе к бедренной кости. Поместите мышцы в блюдо. Взвесить его сразу и заморозить ее в трубке в жидком азоте.
- Перейдем к выявлению и акцизным передней большеберцовой мышцы от места ее происхождения на переднебоковой поверхности голени и его вставки в медиальной клинописи через его дистального сухожилия.
- Для того, чтобы иметь рычаги, держать ногу, захватив цифры с указательным и большим пальцем. Вставьте кончик Дюмон пинцетом непосредственно под поверхностным дистального сухожилия большеберцовой и переместите пинцетом таким образом, что блUNT сторона может быть использована для отделения большеберцовой мышц живота от подлежащей соединительной ткани.
- Вырезать дистального сухожилия, используя тонкие изогнутые ножницы, а затем разрезают мышцы в начале координат, как можно ближе к большеберцовой кости.
- Откройте брюшной полости, выполняя сагиттальный разрез, начиная в подчревной области и перемещение главно в эпигастральной области, остановка надрез чуть выше диафрагмы.
Примечание: Глубина разреза должна быть только достаточно, чтобы нарушить брюшной стенки мышц и основной перитонеального фасции. - Осторожно удалите печень, держа его с тупым наконечником пинцет, и использовать тонкие изогнутые ножницы, чтобы отсечь любые кровеносные сосуды или соединительной ткани, которые прилипают печени полости. Будьте осторожны, чтобы не оставить позади мочки. Взвешивают и защелкнуть замораживать печень в трубке в жидком азоте.
- Использование тупым наконечником пинцет, отойдите в кишечник, а затем выявить и деликатно удалитьселезенка. Возьмитесь селезенку мягко с тупым наконечником пинцетом и использовать спину или тупой стороной тонких изогнутых ножниц, чтобы отсечь любые соединительной ткани или кровеносные сосуды, прилипшие к селезенку полости. Взвесить и оснастки заморозить ее в трубке в жидком азоте.
- Определение гонадных жировых отложений, прилегающих к придатка (у самцов) или матки (у женщин). Аккуратно возьмитесь за придатка жировой ткани с тупым наконечником пинцетом и вытащить ткани из полости. Используя тонкие изогнутые ножницы, отрезать любую гонадной ткани, которые могут быть присоединены к жировой ткани. Взвесить жировой ткани и оснастки заморозить ее в трубке в жидком азоте.
Примечание: Как правило, эта жировая ткань считается представителем общей массы жира тела у мышей и снижение веса с кахексии. Другие жировые подушечки могут быть аналогичным образом идентифицированы, рассекают, удаляют и взвешивают. - Используйте изогнутые тонких ножниц, чтобы открыть сундук животного. Срежьте ребра, прикрепленные к обеим боковым границам стernum. Удалить грудины. С помощью двух пар щипцов, понять каждую сторону грудной клетки и тянуть каждую сторону в поперечном направлении, чтобы открыть грудной полости.
- Деликатно тянуть сердце с пинцетом. Тщательно акцизным сердце с изогнутыми ножницами тонких путем разъединять аорту в левое предсердие. Убедитесь в том, чтобы очистить орган любой остаточной крови деликатно промокательной его против некоторых фильтровальной бумаги. Взвесить и оснастки заморозить ее в трубке в жидком азоте.
5. Мышцы Замораживание и монтаж
- Опустить нижнюю половину небольшой пластиковый стакан (50 мл), содержащего изопентан в жидкий азот. Изопентана готов к использованию, когда оно становится слегка вязкой и образует твердый белый ламинат, выстилающих внутреннюю поверхность стакана (температура: -160 ° С).
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте nonsparking бронзовые или алюминиевые ручные инструменты. Избегайте вдыхания паров продукта. Используйте с достаточной вентиляцией. Если имеем дело с разливом и вентиляция невозможна или impracticАль, носить респиратором. - Замораживание некоторое вложение среды на патроне (пробки) путем погружения его на короткое время (10 сек) в изопентан.
- Обрабатывать мышцы (например., Большеберцовой или икроножной), держа ее за сухожилие, в вертикальном направлении относительно пробки, с тем чтобы сохранить ориентацию волокон и обеспечить возможность сечений.
- Осторожно установите концевую часть свежей мышцы в верхней части замороженных вложение среды.
Примечание: Эта мышца будет прилипать. Это важно не полностью окружать мышцу вложение среды. Важно также, чтобы поддерживать вертикальную ориентацию для последующего определения площади поперечного сечения. - Погрузить патрон с зубчатым венцом приложенном мышцы в изопентан ванну (обычное время замораживания составляет 7 - 15 сек, в зависимости от размера образца и состава).
Примечание: Погружение в растворе замерзания не должна длиться больше, чем необходимо, чтобы полностью заморозить образец. Замораживание слишком долго ГРПTURE блок ткани, в то время как слишком короткое время приведет к образованию кристаллов льда. Хорошо замерзшие образец будет меловой белый. - После замораживания образца, поместите его в небольшой пластиковый пакет или образца трубы (50 мл) и сразу же хранить его в морозильной камере глубокого при -80 ° C или в жидком азоте.
6. Анализ исходных данных
- Для контроля за различий в размерах мышей, нормализуют окончательный вес тела (FBW); без опухоли массы тела; и каркас, орган, и вес ткани (выраженную в граммах) в зависимости от исходной массы тела (IBW), и выразить их в качестве "вес / 100 мг ИВТ".
Примечание: В качестве альтернативы, некоторые исследователи нормализации мышечной массы к длине берцовой кости. - С помощью программного обеспечения для анализа данных. Найти среднее и SD нормированных весов. Провести статистический анализ с расчетами Т-тестами непарный Студента между контрольной и C26 мышей, несущих.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты могут быть представлены по отношению к телу (ИВТи веса без опухоли FBW), опухоли, органов и тканей.
7. Мышцы Секционирование
- Установите рабочую температуру криостата внутренней камеры до около -23 ° С.
- Разрешить образец (ранее хранили при -80 ° C), чтобы акклиматизироваться при рабочей температуре (пару часов должно быть достаточно).
- Вырезать кратно 8-мкм срезы образца (предпочтительно передней большеберцовой или икроножных мышц) и собрать их на стеклах.
Примечание: Отрезать участок в районе середины живота мышцы. Кроме того, для большей точности, вырезать секции перпендикулярно по отношению к монтажной оси. - Держите стеклянные слайды внутри криостата камеры. Не позволяйте им оттаять, если цель состоит в том, чтобы выполнить IF / исследования IHC или ферментативного окрашивания.
- Храните слайды при температуре -80 ° С для дальнейших анализов.
8. Оценка мышечное волокно Размер по Laminin иммунофлуоресценции (Вариант 1)
19. Несмотря на то, Н & Е окрашивание срезов мышц представляет собой ценный и удобный метод анализа морфологии, использование ПЧ подход 14 значительно быстрее , и скромно более точным , чем способ Н & Е основе. H & E способы описаны ниже.
- Удалить срезы ткани либо из криостата или хранения -80 ° C и позволяют им уравновешиваться до комнатной температуры (приблизительно 5 - 10 мин).
Примечание: Для того чтобы избежать неспецифических взаимодействий, связанных с первичными антителами, индуцированными у мышей, то целесообразно использовать либо антитела, индуцированные в других видов или использовать коммерчески доступные "мышь-на-мышь" иммунодетекции комплекты. - Погрузитесь секции в предварительном прохладые изд метанол (-20 ° С) в течение 10 мин.
- Вымойте секций в комнатной температуре 1x PBS в течение 5 мин.
- Удалите PBS и использовать перо для иммуногистохимического приложений, чтобы окружить разделы на слайде. НЕ допускайте разделы полностью высохнет в любой точке.
- Нанесите подходящую блокирующий буфер (5 - 8% FBS в PBS или 5% сыворотки козы в PBS), на участках в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Удалите блокирующий буфер.
- Применять либо кролика против ламинина (1:30) или мышиного анти-дистрофина (1:30) первичное антитело в блокирующем буфере в секциях в течение 2 ч при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 ° С) во влажной камере.
- Промыть участки с 1x PBS в течение 5 мин.
- Удалите промывочный буфер и промыть секции снова в 1x PBS в течение 5 мин.
- Удалите промывочный буфер и применять надлежащего флуоресцентного вторичного антитела (1: 1000 в блокирующем буфере) в секциях во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Удалите вторичное антитело и промойте участки с 1x PBS в течение 5минимум
- Удалите промывочный буфер и повторить промывку с 1x PBS в течение 5 мин. Удалите промывочный буфер и охватывают участки с покровным стеклом с использованием водной среде на основе.
- Определить морфологические особенности мышцы с помощью цифровых изображений окрашенном секции. Для того чтобы сделать это, используйте перевернутую флуоресцентного светового микроскопа для IF секции (мы получили увеличение цель 10X или 20X уместно), наряду с цифровой камерой и захвата изображения программного обеспечения. Поместите масштабную линейку в каждом цифровом изображении (20 - 30 случайных полей рекомендуются для каждой секции мышцы), чтобы облегчить определение количества CSA. Изображения должны быть сохранены в формате .TIF, чтобы быть совместимым с программным обеспечением для анализа изображений с помощью программы ImageJ.
- Используйте ImageJ макрокоманду , чтобы отличить соединительную ткань от сократительной ткани (размер мышечное волокно) через наличие флуоресцентного вторичного антитела в эндомизии 20.
Примечание: Макрос и инструкции доступны из AUTHПРС, Ричард Либера и Шеннон Бремнер. - Откройте программу ImageJ, дважды щелкнув значок на рабочем столе.
- Загрузите CSA макрос, щелкнув вкладку "Плагины". Переместить курсор вниз, чтобы выбрать опцию "Установить", нажав на него один раз.
- Загрузите макрос поперечного сечения, выбрав его из папки она была сохранена в, а затем нажмите кнопку "Открыть".
- После того, как макрос был открыт, откройте гистологическое изображение, содержащее масштабную линейку, нажав кнопку "Файл" и затем "Открыть" на панели инструментов ImageJ.
- После того, как изображение открыто, выберите "прямой линии" инструмент в программе ImageJ, нажав на иконку с прямой линией.
- После того, как "Прямая линия инструмент" выбран, нажмите один раз на крайнем левом конце шкалы бара, а затем один раз нажать на крайнем правом конце шкалы. Если все сделано правильно, должна быть желтая линия наложена на шкале дистанций.
- Убедившись, что Yelloш линия по-прежнему наложены на масштабной линейки, выберите вкладку "Анализ" на панели инструментов ImageJ, нажав на него один раз.
- На вкладке "Анализ", переместите курсор вниз и выберите "Установить масштаб", нажав на него один раз.
- В окне "Настройка масштаба", не изменяйте значение в "Расстояние в пикселях" окне. Введите известное расстояние от шкалы в поле "известном расстоянии". Изменение единиц в "единицу длины" окна , чтобы соответствовать стержневых единиц шкалы (т.е. микрометров = мкм). И, наконец, выберите "глобальный", нажав на поле слева от "Global" один раз.
- Закройте окно "Установить масштаб".
- Откройте первое изображение необходимо измерить, нажав на кнопку "O" на клавиатуре. Обратите внимание на всплывающее окно, которое позволяет пользователю найти и выбрать изображение, которое будет измерено из папки она была сохранена. Выберите изображение, нажав на него один раз, а затем нажмите кнопку "Открыть". <li> После открытия окна должен появиться для выбора приемлемого диапазона для измерений CSA и для округлости.
- После установки диапазона CSA и округлость, наблюдать изображение в покрытую красными пикселями с окном "Threshold". Отрегулируйте порог изображения с помощью линеек в окне "Порог" до тех пор, пока мышечные волокна аккуратно заполнены с красными пикселями.
Примечание: Попытка получить наибольшее количество волокон, которые не соприкасаются друг с другом; если волокна соприкасаются, они будут измеряться в виде одного большого волокна, которое необходимо будет отредактирован вниз по течению. - После установки порогового значения, нажмите кнопку "1" на клавиатуре, чтобы измерить мышечные волокна.
- Обведите отдельные мышечные волокна с желтой линией.Перемещение по изображению и удалить артефакты или двойные волокна, которые были выбраны программой. Для этого нужно выбрать структуры, которые не являются волокна, щелкая по ним один раз, а затем нажмите кнопку "D" на клавиатуре. Это приведет к удалению их из измерений.
- Выбрать и скопировать измерения из "окна значений измерений" и вставить их в таблицу для дальнейшего анализа.
Примечание: Значения, полученные также могут быть использованы для оценки анализа распределения волокон, что в общем случае представляет собой полезный параметр, чтобы определить, способствует ли рост опухоли сдвиг в сторону более мелких мышечных волокон. - Закройте все открытые окна в ImageJ, нажав кнопку "X" в верхнем левом углу окна.
- Откройте новое изображение, чтобы измерить, нажав кнопку "O" и повторяя шаги 8.24 - 8.29.
Примечание: Эти параметры обычно остаются их значения по умолчанию. Однако, если кто-то хочет, чтобы изменить эти настройки, не забудьте сохранить значения одинаковы для каждого последовательного изображения измеряется в эксперименте.
9. Оценка мышечное волокно Размер от H & E окрашенных срезах (Вариант 2)
- Поместите стаканслайды в Коплин баночки фильтруется Harris гематоксилином в течение 8 мин.
Примечание: В качестве альтернативы, Mayer гематоксилин может быть использована, если менее интенсивное пятно желательно. - Промыть слайды в деионизированной воде.
- Dip слайды в водопроводной воде в течение 5 мин.
- Быстро промыть их в деионизированной воде, а затем инкубируют их в отфильтрованной 1% раствора эозина в течение менее чем за 2 мин.
Примечание: Если более интенсивное пятно желательно добавить 1 - 2 капли уксусной кислоты (0,01% или меньше) в раствор эозина. - Начните шаги обезвоживания. Промыть слайдов в 70% этаноле в течение менее 1 мин.
- Dip слайдов в 90% этаноле в течение 1 мин.
- Dip слайдов в 95% этаноле в течение 1 мин.
- Dip слайды в 100% этаноле в течение 2 мин.
- Dip слайды в ксилоле в течение 2 мин. Перемещение слайдов в другую банку Копли, содержащую свежий ксилол в течение еще 2 мин.
Примечание: Храните слайды в ксилоле (не более 1 часа), пока они не покрывали. - Поместите coversliPS на участках мышцы с использованием предметный столик Permount или Ксилол основе крепежное средством выбора.
- Обратите внимание на H & E-витражных слайды под микроскопом с увеличением 20X, и приобрести картины всей площади мышцы раздела. Получение изображений с помощью ярко-световой микроскоп, цифровая камера и программное обеспечение захвата изображения.
Примечание: Наличие масштабной линейки или изображением микрометра, принятым на том же увеличении необходимо будет определить CSA. Как указано выше, запись по меньшей мере, 20 - 30 случайные поля для каждой секции мышц. - Оценить размер мышечное волокно с помощью программного обеспечения ImageJ. Откройте любое цифровое изображение. Установите масштаб, как описано выше. Мера по меньшей мере 1500-2000 мышечных волокон на мышцы с помощью инструмента выделения Freehand, прослеживая окружность волокна с помощью мыши или, для более быстрого ввода, с устройством ввода планшета и пера.
10. Сбор и анализ данных
- Для того чтобы установить размер мышечных волокон, оценить среднее волокно "область."Рассчитать средства и SD для измерений, полученные для каждой мышцы, в том числе как в области и диаметра Фере. Более того, для того, чтобы оценить, является ли экспериментальная установка, связанный со сдвигом в сторону либо меньших или больших мышечных волокон, анализируют" распределение волокон ".
- Оценки значимости результата, выполняя непарного Т-теста для двух групп. Определение соотношения между значениями, полученными для группы мышей С26 и для контрольной группы. Участок значения на графике отчетности средствах SD и частоты распределения / гистограммы, направленной на демонстрацию сдвиг в размерах волокон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кинетика роста опухоли С26 показывают лаг-фазу в течение первых 7 - 8 дней после инъекции, с последующим ростом показательной клеток (4 - 5 г). Масса опухоли в конце концов достигает ~ 10% от массы тела (около 2 г; Фигура 1А-В). Во время первой фазы, опухоль может быть расположена только пальпации и выглядит как небольшой выступ кожи. На втором этапе, опухоль наблюдается как масса под кожей. Редко, опухоль становится изъязвление, в результате открытой раны; в этом случае мышь исключается из экспериментальной группы и гуманно умерщвлены.
Вес тела не изменяется на первом этапе, но она значительно снижается во второй фазе, когда она достигает 10 - 15% от исходной массы тела (30% в случае веса без опухолей; фигура 1А). Опухоли мышей, несущих кажутся развалинами и показали растрепанный мех в концеэкспериментальный период, с условием тела (БК) балл равен 1 18 (фиг.1С). ВС1 представляет собой сильно истощенную мышь, где скелетные структуры очевидны и позвонки отчетливо сегментирован. Тело потеря веса в основном объясняется как скелетной атрофии мышц и жировой ткани (рис 1B). Потеря массы тела соответствует снижению примерно на 20 - 30% в скелетных мышечной массы, в частности в икроножных, передней большеберцовой и четырехглавой мышцы бедра (рисунок 2). Сердечной мышцы также значительно снижается в весе, хотя и в меньшей степени по сравнению с другими скелетными мышцами (рисунок 2). Интересно, что гепатомегалия (+ 16%, р <0,01) и спленомегалия (+ 110%, р <0,01), как правило, обнаруживаются в опухолевых хозяев, в то время как масса жировой ткани, похожий на скелетные мышцы, сильно истощены (-70%, р <0,001 ; Рисунок 3).
(рис 4A-B). В частности, анализ распределения частот показал сдвиг в сторону меньшего размера волокон в С26 мышей , несущих, таким образом , предполагая , что вся мышца подвергается атрофии в присутствии опухоли С26 (рис 4в). Аналогичные результаты можно наблюдать, пользуясь традиционной H & E на основе методологии для количественного определения размера волокон, хотя величина изменения в мышечной CSA, связанный с ростом рака несколько отличается (38% по сравнению с контролем, р <0,01 для IF метод основанное; -18% в сравнении с контролем, р <0,01 для метода Н & Е основе; рисунок 5).
Рисунок 1: масса тела в контроле и C26 мышей , несущих. А) кривой массы тела в управлении и С26 хозяев за весь экспериментальный период (14 дней после инъекции опухоли). B) Начальный вес тела (ИВТ), конечная без опухоли массы тела (FBW), и вес опухоли в контроле и C26- Меховые. C) Типичные картины управления и С26-носителей во время жертвоприношения (14 -й день после прививки опухоли). Данные выражены как среднее значение SD. п = 6. Значимость различий: * р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001 по сравнению с контрольной группой , используя Т-тест Стьюдента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Мышечные Веса в контроле и C26 мышей , несущих. Большеберцовой, икроножной, четырехглавой мышцы, и вес сердца в контроле и С26 опухолевые носителей представлены как вес / 100 мг IBW. Данные выражены как среднее значение SD. п = 6. Значимость различий: ** р <0,01 и *** р <0,001 по сравнению с контрольной группой, используя Т-тест Стьюдента.
Рис . 3: Орган весов в контроле и C26 мышей , несущих печень, селезенка, и эпидидимальных веса жировой ткани в области контроля и С26 опухолевых носителей представлены как вес / 100 мг ИВТ. Данные выражены как среднее значение SD. п = 6. Значимость различий: ** р <0,01 по сравнению с контрольной группой.
Рисунок 4: Морфометрия для мышечное волокно Размер иммунофлюоресценции. A) Флуоресцентные иммуногистохимического реакция секций большеберцовой с использованием анти-дистрофина антитела (Vector Laboratories) от управления и С26 хостов. Увеличение: 10х. Размер бар:. 100 мкм B) Количественная CSA в большеберцовой мышцы , измеренной с помощью ImageJ макроса C) частотного распределения CSA в большеберцовой мышцы контроля и C26 мышей , несущих.. Данные выражены в виде среднего значения ± SD. N = 6 для каждой группы. Значимость различий: ** р <0,01 по сравнению с контрольной группой, используя Т-тест Стьюдента.
Рисунок 5: Морфометрия для мышечное волокно Размер по H & E. А) гематоксилин и эозин окрашивание большеберцовой секций от управления и С26 хостов. Увеличение: 20х. Размер бар:. 100 мкм B) Количественная и частота распределенияCSA в большеберцовой мышцы. Данные выражены как среднее значение SD. п = 6. Значимость различий: *** р <0,001 по сравнению с контрольной группой, используя Т-тест Стьюдента.
| Авторы | штамм мыши | пол мышь | Номер мобильного | происхождения | Живя в солидной опухоли? | Сайт инъекции | дней |
| Лазарь и др., 1999 | CD2F1 | M | 5 х 10 5 | NCI | НЕТ | Спинной край | 17 |
| Аль-Маджид и Маккарти, 2001 | CD2F1 | F | 2,5 х 10 6 | OSUMC | НЕТ | Спинной край | 17 |
| Сэмюэлс и др., 2001 | Balb / с | M | 0,5 г / мл суспензии опухоли | нс | ДА | Спинной край | До 11 |
| Ачарья и др., 2004 | CD2F1 | M | 1 х 10 7 | OSUMC | НЕТ | правый фланг | До 24 |
| Aulino и др., 2010 | Balb / с | нс | 0,5 мм 3 | NCI | ДА | Спинной край | 21 |
| Бенни-Klimek и др., 2010 | CD2F1 | F | 1 х 10 6 | OSUMC | НЕТ | Спинной край | 14 |
| Бонетто и др 2011. 2012 | CD2F1 | F | 1 х 10 6 | OSUMC | НЕТ | Спинной край | |
| Cosper и Leinwand, 2010 | CD2F1 | М + Ж | 5 х 10 5 | нс | НЕТ | правый фланг | До 27 |
| Мерфи и др., 2012 | CD2F1 | нс | 5 х 10 5 | NCI / OSUMC | НЕТ | Спинной край | 14 |
| Корнуэлл и др., 2014 | CD2F1 | M | 5 х 10 5 | NCI | НЕТ | Правый и левый фланг | До 26 |
| Асси и др., 2016 | Balb / с | нс | 1 х 10 6 | Клеточная линия Сервис | НЕТ | Спинной край | До 22 |
Таблица 1:. Сравнение различных протоколов , используемых для C26 Имплантация диффереT протоколы для C26 имплантации обеспечиваются, с особой ссылкой на штамме мышей, используемых, количество клеток и тип опухоли прививали, клетка происхождение, место инъекции, а продолжительность периода эксперимента. OSUMC: Университет штата Огайо медицинский центр. NCI: Национальный институт рака. Коммерческая клеточная линия службы NS: не указано.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Особенно в его поздних стадиях, колоректальный рак связан с развитием кахексии, которая отвечает за худшим результатам и снижению качества жизни пациентов. Многие исследования были сосредоточены на лечении состояний, вторичной по отношению к раку; Однако, несмотря на многочисленные усилия в этом направлении, до сих пор не утвержденных терапии рака кахексии 21. Таким образом, крайне важно, чтобы животные модели напоминают патологии человека настолько близко, насколько это возможно, с тем, чтобы максимизировать перевод выводов.
C26 опухолью мышей обычно используется экспериментальная модель кахексии рака 22-24. Эта модель очень близка к болезни человека, показывая снижение тела, мышечной и жировой массы, а также волокна , атрофии мышц и повышенную экспрессию воспалительных генов и убиквитинлигаза в соответствии с выраженным белка гиперкатаболизм 2,5. Несмотря на это, несколько различий с данными, полученными в patie ракаNTS было зарегистрировано 25,26. Действительно, некоторые особенности модели, в том числе не-физиологическом среде роста (например, внематочная опухоль выращивают подкожно вместо ортотопически имплантирован в желудочно - кишечном тракте), относительно короткий экспериментальный период по сравнению с другими моделями (например, генетической или ортотопической инъекции опухоли), зависимость от IL-6 действий, а также необходимое использование CD2F1 или Balb / с мышей может представлять серьезные ограничения и может ограничить интерпретацию результатов.
Текущий протокол доказал свою высокую воспроизводимость во многих экспериментах , проведенных в нашей лаборатории, сохраняя те же характеристики и позволяет провести сравнение между результатами , полученными в разное время, в разных географических точках, а также различными исследователями 3,10. Тем не менее, в целях содействия воспроизводимости данных, важно установить четкие и общие принципы.
Как gathered из литературы, несколько предостережений может предотвратить воспроизведение одних и тех же данных в двух разных лабораториях. По тем же причинам, использование различных протоколов может генерировать различные фенотипы и результаты, а также привести к противоречивым и сомнительных результатов. Действительно, различия в выполнении этой модели на животных сообщалось, главным образом , в результате деформации (BALB / C или CD2F1) 2,5,27-29 или пол мышей использовали 17, тип опухоли , которая была имплантирована (суспензию клеток 3 , 29 , а не твердой опухоли в трансплантате 2,30), источник опухоли (NCI, АТСС, или OSUMC), количество клеток С26 , которые были введены, и место инъекции или имплантации (торцы 6,17, 31 или спинной области 3,10,32). Нет прямое сравнение эффектов, связанных с имплантацией линий С26 клеток, полученных из разных источников (в основном OSUMC по сравнению с NCI) никогда не была выполнена, таким образом, мешает нам делать какие-либо окончательного conclusiдополнения. Тем не менее, вполне вероятно, что выбор источника клеток также может существенно влиять на ожидаемые результаты. При рассмотрении вопроса о выборе мужчин по сравнению с женщинами, следователи следует напомнить о существенных различий в результатах. В самом деле, как сообщает Cosper и Leinwand 17 самцов опухолью мышей, из - за отсутствия эстрогенов, может показать более тяжелый фенотип , чем у женщин, в том числе более сердечной потери массы и смертности, более надежной про-воспалительной реакции на опухоль и больше сердца аутофагии.
Специально для тех исследователей, которые не знакомы с этой моделью и, возможно, первоначально сталкиваются с проблемами, на основе как анализа мощности и нашего предыдущего опыта, с использованием по крайней мере, 6 животных на условия эксперимента (n = 6), желательно, чтобы обнаружить статистически значительные различия. Также очень важно, что рандомизация проводится тщательно, так что начальные веса тела в экспериментальных животныхсущественно не отличаются между группами. Точно так же он сообщил, что для того, чтобы избежать вариабельности между операторами, и тот же исследователь выполняет сбор тканей и органов на каждом животном. Кроме того, крайне важно, чтобы ткани (особенно мышцы) заморожены как можно быстрее, с тем чтобы сохранить структуру РНК и ферментативную активность и, в особенности, если цель исследования состоит в том, чтобы оценить экспрессию генов или для оценки ферментативной активности. Кроме того, в попытке определить мышечную ПМА, мы показали, что отчетность области волокна, как правило, принимается и представитель размера мышечных волокон. Здесь мы представляем два различных методов оценки мышечной CSA. Как показано на рисунках 4-5, оба метода удалось обнаружить значительное снижение размера мышечное волокно между элементами управления и опухолеподобных хостами, хотя степень тратить появились разные.
Это несоответствие может быть следствием того факта, что, хотя оба метода являются приемлемыми способы ословs мышцы размер волокна, количественное определение мышечных характеристик от H & E-окрашенных слайдов по-прежнему ручной или полуавтоматический процесс, наиболее часто трудоемкий, отнимает много времени и зависит от ограниченной точности. Исходя из нашего опыта, мы считаем, что метод IF на основе является более точным методом, чтобы сообщить мышечной CSA. В самом деле, количество волокон, которые могут быть измерены автоматически путем использования этой техники значительно больше, таким образом, повысить точность измерений. Следует отметить, что для обоих методов, альтернативный метод размера отчетности мышц является оценка диаметра Фере в. Интересно отметить, что это считается очень надежным инструментом, из-за того, что этот параметр в значительной степени зависит от угла секционирования. Другие параметры, такие как "минимальный внутренний диаметр" и "минимального внешнего диаметра" также нечувствительны к плоскости секционирования и может быть использован вместо диаметра Фере в качестве альтернативных признаков ФВБразмер эр.
В заключение, хотя кахексии сообщество явно нуждается в создании более физиологических моделей для исследования ассоциированных с опухолью атрофии мышц, мы считаем, что мыши, несущие рак толстой кишки C26 представляют собой хорошо стандартизированный и легкий в использовании модель для изучения молекулярных изменений и физиологические нарушения обычно обнаруживаются после появления опухоли. Будущие приложения будут включать исследование ли ортотопическая имплантации клеток С26 в толстую кишку, может представлять собой надлежащую и более физиологическую модель колоректального рака кахексии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek,, E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
