Introduction
Atrofia muscolare è una grave complicanza di varie condizioni cliniche, come il cancro, la sepsi, il fegato, la cirrosi, il cuore e insufficienza renale, malattia polmonare ostruttiva cronica, e l'AIDS. In particolare, atrofia muscolare è evidente in almeno il 50% dei pazienti con tumore 1. La perdita del muscolo scheletrico nei risultati di cancro da degradazione delle proteine aumentato a causa della sovra-attivazione dei sistemi scheletrici proteolitici muscolare e / o da diminuita sintesi proteica 6. Lipolisi è anche evidente, che porta alla deplezione del tessuto adiposo. Clinicamente, cachessia è associato ad una ridotta qualità e la durata della vita e si stima che sia la causa della morte a 20 - 30% dei pazienti affetti da cancro 7. L'utilizzo di modelli sperimentali che assomigliano malattia umana più vicino possibile sarebbe vantaggioso. Un modello animale ottimale è caratterizzato da elevata riproducibilità, nonché da interferenze limitata da terapie diverse ei fattori imprevedibilidieta, il sesso e il background genetico che sono di solito associati con la condizione clinica 8. Finora, cachessia cancro è stata studiata principalmente in modelli animali caratterizzati da trapianto di cellule tumorali o iniezione di sostanze cancerogene, anche se un nuovo metodo è quello di utilizzare topi geneticamente modificati sensibili alla sviluppo del cancro.
Topi portatori di carcinoma C26 (noto anche come colon-26 e adenocarcinoma) rappresentano un modello ben caratterizzato e ampiamente usato di cachessia neoplastica 2,5. La crescita dei risultati tumorali C26 nel corpo e perdita di peso muscolare, soprattutto attraverso una maggiore grassi e proteine catabolismo 9. Generalmente, il peso del tumore 10% contro peso corporeo totale è associato ad una riduzione del 20-25% in peso, muscolo scheletrico e una maggiore deplezione di grasso 3,10. Epatomegalia e splenomegalia sono osservate anche con la crescita del tumore, insieme con l'attivazione della risposta di fase acuta e l'elevazione di pro-Inflalivelli di citochine mmatory 3,11. Tra questi, è noto che IL-6 svolge un ruolo chiave nella mediazione atrofia muscolare nel modello C26, anche se questa citochina non è probabilmente l'unico induttore di cachessia 12. Elevati di IL-6 provoca atrofia muscolare attraverso l'attivazione del pathway JAK / STAT3, e inibendo questo fattore di trascrizione può prevenire l'atrofia muscolare 3,4.
Durante atrofia muscolare C26-indotta, come in molte condizioni di atrofia muscolare, la massa muscolare è perso in gran parte attraverso la riduzione del contenuto di proteine muscolari attraverso fibre muscolari, non attraverso la morte delle cellule o la perdita di fibre 13. In C26 cachessia, uno spostamento verso aree di sezione trasversale più piccoli si osserva in entrambi i glycolytic e ossidative fibre 2. Questo è anche coerente con ridotta forza muscolare 5. Molti gruppi in tutto il mondo hanno approfittato del modello C26, al fine di scoprire nuovi mediatori di atrofia muscolare o farmaci clinicamente rilevanti per il cancro cachexia. Tuttavia, sono stati riportati molti diverse procedure per l'uso di questo modello, sollevando preoccupazioni per la coerenza dei dati ottenuti e posa barriere riproducibilità in diverse condizioni sperimentali. Qui riportiamo un utilizzo tipico di questo modello per lo studio della cachessia cancro che produce dati standardizzati e riproducibili.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutti gli studi descritti sono stati approvati dai Comitati Istituzionali Animal Care e l'uso della Thomas Jefferson University e Indiana University School of Medicine.
1. C26 cellulare crescita e preparazione
- Ottenere cellule del cancro del colon-retto C26 (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) e preparare mezzo di crescita completo (cioè ad alta glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle (DMEM) contenente il 10% siero fetale bovino (FBS), 1 mM di sodio piruvato, 1% glutamina e 1% di streptomicina / penicillina).
NOTA: Al fine di consentire una migliore riproducibilità inter-sperimentale, è preferibile usare cellule C26 ad un passaggio più basso possibile. - Utilizzare un contatore di cellule disponibile in commercio al piatto 50.000 cellule / cm 2 in boccette con terreno di coltura completo. Li Incubare in atmosfera umidificata a 37 ° C e 5% CO 2 fino sub-confluenti. Evitare di coltura ad alta densità di prevdifferenziazione ent e deriva di fenotipi cellulari.
- Dopo il primo passaggio, piastra abbastanza cellule da impiantare nel numero previsto di animali. Il giorno di impianto di cellule, dissociare le cellule mediante tripsinizzazione con 0,02 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA per cm 2, neutralizzare la tripsina aggiungendo almeno 3 ml di mezzo fresco per ml di tripsina, determinare la concentrazione cellulare in cellule / ml e risospendere il numero di cellule necessarie per l'esperimento (1 x 10 6 cellule per topo) in PBS sterile.
NOTA: le celle C26 raggiungano la confluenza quando la densità è di circa 500.000 cellule / cm 2.
2. I topi
- Randomize adulti topi CD2F1 (almeno 8 settimane di età) in gruppi (di solito controlla e tumorali portatori) con almeno n = 6 per gruppo.
NOTA: tumori C26 crescono in topi Balb / c pure. Tuttavia, sulla base della nostra esperienza, i topi CD2F1 rappresentano una serie più versatile ed economico per questo particolare modello di tumore. Inoltre,simili alle impostazioni cliniche e di risultati riportati in altri modelli sperimentali di muscolo cancro-associata sprecare 14-16, differenze di sesso nella risposta alla C26 cachessia può anche essere osservato 17 (vedi anche tabella 1). - Anestetizzare il mouse con isoflurano per via inalatoria (3% di ossigeno). Mantenere l'animale in anestesia esclusivamente per il tempo necessario per eseguire l'inoculazione del tumore. Assicurarsi che il mouse si trova su un tampone riscaldato al fine di prevenire la perdita di calore corporeo. Prima di iniziare la procedura di iniezione del tumore, confermare il corretto anestesia pizzicando delicatamente le dita dei piedi posteriori.
NOTA: A causa della durata della procedura (generalmente pochi secondi), l'uso di veterinaria unguento oculare non è necessaria. Per lo stesso motivo, gli animali di controllo sottoposto all'operazione farsa non si prevede di perdere peso. - Usando una siringa da insulina sterile da 1 ml con un ago da 26 gauge, iniettare rapidamente 250 microlitri della soluzione contenente il tumor cellule per via sottocutanea e intrascapularly nel cuscinetto adiposo del mouse.
NOTA: Gli animali di controllo riceveranno 250 ml di soluzione salina sterile intrascapularly nel cuscinetto adiposo. - Posizionare la parte posteriore animale nella sua gabbia. Direttamente osservare il mouse almeno una volta ogni 15 minuti fino a che non può rispondere alla manipolazione dolce e ha riacquistato un riflesso di raddrizzamento.
NOTA: Non lasciare il mouse senza sorveglianza, e tenerlo in una gabbia di recupero caldo che contiene un substrato solido. Inoltre, non restituiscono il mouse per la stanza degli animali finché non è completamente recuperato da anestesia. In generale, i topi non hanno bisogno di essere alloggiati individualmente a meno che il ricercatore si propone di valutare l'assunzione di cibo individuale. Se questo è il caso e l'uso di gabbie metaboliche automatici non è disponibile, la registrazione manuale di consumo alimentare deve essere eseguito, possibilmente quotidiana e allo stesso tempo ogni giorno. - Controllare i topi quotidiana e registrare le loro peso corporeo.
NOTA: La registrazione il punteggio condizione fisica ecomportamenti gabbia di casa in grado di differenziare i gradi di cachessia e della malattia comportamento, che è utile per studi di trattamento 18.
3. L'eutanasia e il prelievo di sangue
- Quando la perdita di peso corporeo in i padroni di casa del tumore rispetto ai controlli raggiunge il 5%, 10%, o del 15% (lieve, moderata e grave cachessia, rispettivamente) rispetto al loro peso iniziale del corpo, eutanasia i topi.
NOTA: Un tipico esperimento sarà effettuato fino a quando un gruppo raggiunge perdita di peso del 10%, su cui vengono sacrificati tempo tutti i gruppi. perdita di peso corporeo è valutata misurando il peso corporeo comprensivo del tumore. - Posizionare il mouse in anestesia generale isoflurano (3% di ossigeno). Disegnare sangue mediante puntura cardiaca (circa 1 - 1,5 ml).
- Raccogliere il sangue in K 2 -EDTA (18 mg) tubetti vuoti e disporli sul ghiaccio. Centrifugare il sangue (2.000 xg per 15 min a 4 ° C) e raccogliere il plasma / siero.
- Euthanize il mouse mediante cdislocazione ervical. Procedere alla asportazione dei tessuti e la raccolta di organi.
4. tessuti e organi escissione
NOTA: Per l'utilizzo di tessuti in test di biologia molecolare o biochimici, prevede di pesare ogni organo e tessuto e posizionare immediatamente un frammento in CryoTubes pre-etichettati. Snap congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
- Per evitare la contaminazione di campioni di tessuto con pelliccia, spruzzare etanolo al 70% su tutto il corpo.
- Posizionare il mouse su un letto dissezione in posizione supina ed estendere un arto verticale fissando il piede per un morsetto buret elevata.
- Afferrare la pelle dell'arto inferiore con una pinza Dumont e utilizzare le forbici sottili curve per rimuovere delicatamente la pelle e la fascia, esponendo i ventri muscolari sottostanti dell'arto inferiore.
- Identificare il muscolo gastrocnemio sull'arto posteriore inferiore di origine nel condili mediale e laterale sul femore posteriore e il suo inserimentocalcagno tramite il tendine calcaneare.
- Procedere per tagliare il tendine gastrocnemio calcaneare. Afferrare l'estremità distale del gastrocnemio con una pinza Dumont e tirare il ventre muscolare verso la sua origine. Utilizzando le forbici, tagliare il muscolo all'origine più vicino possibile al femore. Posizionare il muscolo in un piatto. Pesare immediatamente e congelare in un tubo in azoto liquido.
NOTA: Assicurarsi di non asportare il muscolo soleo insieme al gastrocnemio. In tal caso, rimuovere con attenzione soleo tirando delicatamente fuori con le pinze.
- Procedere per tagliare il tendine gastrocnemio calcaneare. Afferrare l'estremità distale del gastrocnemio con una pinza Dumont e tirare il ventre muscolare verso la sua origine. Utilizzando le forbici, tagliare il muscolo all'origine più vicino possibile al femore. Posizionare il muscolo in un piatto. Pesare immediatamente e congelare in un tubo in azoto liquido.
- Procedere per identificare e asportare il muscolo tibiale anteriore dalla sua origine alla superficie antero-laterale della tibia e del suo inserimento nella cuneiforme mediale attraverso il suo tendine distale.
- Al fine di avere effetto leva, tenere il piede afferrando le cifre con il dito indice e il pollice. Inserire la punta di pinze Dumont immediatamente sotto il tendine distale superficiale del tibiale e spostare la pinza in modo tale che il bllato unt può essere utilizzato per staccare il ventre muscolare tibiale dal tessuto connettivo sottostante.
- Tagliare il tendine distale utilizzando le forbici curve sottili, e quindi tagliare il muscolo all'origine, il più vicino possibile alla tibia.
- Aprire la cavità addominale eseguendo un'incisione sagittale partire dalla regione ipogastrica e spostando superiormente alla regione epigastrica, fermando l'incisione appena sopra il diaframma.
NOTA: La profondità dell'incisione deve essere solo sufficiente a rompere la parete muscolare addominale e la fascia peritoneale sottostante. - Rimuovere con attenzione il fegato afferrandolo con le pinze smussato a punta, e usare le forbici curve sottili di sezionare via qualsiasi vasi sanguigni o del tessuto connettivo che aderiscono il fegato alla cavità. Fare attenzione a non lasciare alle spalle lobi. Pesare e scattare congelare il fegato in un tubo in azoto liquido.
- Utilizzando le pinze a punta smussata, allontanarsi l'intestino, e quindi esporre e delicatamente rimuoverela milza. Afferrare la milza delicatamente con la pinza a punta smussata e utilizzare la parte posteriore o laterale smussato delle belle forbici curve di sezionare via qualsiasi vasi sanguigni del tessuto connettivo o aderenti la milza alla cavità. Pesare e scatto congelare in un tubo in azoto liquido.
- Identificare i cuscinetti adiposi gonadici, adiacente al epididimo (nei maschi) o dell'utero (nelle femmine). afferrare delicatamente il cuscinetto adiposo dell'epididimo con la pinza a punta smussata e tirare il tessuto fuori della cavità. Utilizzando le forbici curve sottili, tagliare qualsiasi tessuto gonadico che può essere collegato al cuscinetto adiposo. Pesare il pad grasso e scattare congelare in un tubo in azoto liquido.
NOTA: In genere, questo tessuto adiposo è considerato rappresentativo della massa complessiva grasso corporeo nei topi e declina in peso con cachessia. Altri cuscinetti di grasso possono essere similmente identificati, sezionati, rimossi, e pesati. - Utilizzare le forbici sottili curve di aprire il petto dell'animale. Tagliare le costole collegati a entrambi i bordi laterali della sternum. Rimuovere lo sterno. Utilizzando due coppie di pinze, afferrare ciascun lato della gabbia toracica e tirare ogni lato lateralmente per aprire la cavità toracica.
- Delicatamente tirare il cuore con le pinze. asportare con cura il cuore con le forbici sottili curve tagliando l'aorta in atrio sinistro. Assicuratevi di svuotare l'organo di eventuali residui di sangue da delicatamente assorbente contro un foglio di carta assorbente. Pesare e scatto congelare in un tubo in azoto liquido.
5. muscolare congelamento e di montaggio
- Immergere la metà inferiore di un piccolo beaker di plastica (50 ml) contenente isopentano in azoto liquido. Il isopentano è pronto all'uso quando diventa leggermente viscosa e forma un solido rivestimento laminato bianco all'interno del bicchiere (temperatura: -160 ° C).
NOTA: utilizzare sempre nonsparking bronzo o alluminio utensili a mano. Evitare di respirare vapori del prodotto. Usare con ventilazione adeguata. Se si tratta di una fuoriuscita e la ventilazione è impossibile o impractical, indossare un respiratore adeguato. - Congelare qualche mezzo di inclusione su un mandrino (cork) immergendo brevemente (10 sec) in isopentano.
- Maniglia muscolo (ad es., Il tibiale o gastrocnemio) tenendolo dal tendine, verticalmente rispetto al tappo, in modo da mantenere l'orientamento delle fibre e consentire sezioni trasversali.
- Posizionare accuratamente la porzione terminale del muscolo fresco sulla parte superiore del mezzo di inclusione congelati.
NOTA: Il muscolo si attacchi. E 'importante non per circondare completamente il muscolo con mezzo di inclusione. E 'anche importante mantenere l'orientamento verticale per la successiva determinazione della sezione trasversale. - Immergere il mandrino con il muscolo allegato nel bagno isopentano (il solito tempo di congelamento è di 7 - 15 sec, a seconda delle dimensioni del provino e composizione).
NOTA: L'immersione nella soluzione di congelamento non dovrebbe durare più di quanto sia necessario per bloccare completamente il campione. Congelamento troppo lungo frac volontàture il blocco dei tessuti, mentre un tempo troppo breve causerà la formazione di cristalli di ghiaccio. Un campione ben congelati saranno bianco gessoso. - Dopo il congelamento del campione, posto in un sacchetto di plastica o provetta del campione (50 ml) ed immediatamente conservarlo in un congelatore a -80 ° C o in azoto liquido.
6. Analisi dei dati grezzi
- Al fine di controllare le variazioni di dimensione dei topi, normalizzare il peso corporeo finale (FBW); -Tumorale libera del peso corporeo; e la carcassa, organo, e il peso del tessuto (espresso in grammi) in funzione del peso corporeo iniziale (PCI), e li esprimono come "peso / 100 mg IBW".
NOTA: In alternativa, alcuni ricercatori normalizzare la massa muscolare per la lunghezza della tibia. - Utilizzare un software per l'analisi dei dati. Trova la media e la deviazione standard dei pesi normalizzati. Effettuare analisi statistiche con t-test di Student spaiato tra i controlli e topi C26-cuscinetto.
NOTA: I risultati possono essere presentati rispetto al corpo (PCIe pesi FBW) libera da tumore, tumore, di organi, e del tessuto.
7. muscolare sezionamento
- Impostare la temperatura di lavoro della camera interna criostato a circa -23 ° C.
- Lasciare il campione (precedentemente conservati a -80 ° C) per acclimatarsi alla temperatura di lavoro (un paio d'ore dovrebbe essere sufficiente).
- Taglio multiplo di 8 micron di spessore sezioni del campione (preferibilmente il tibiale anteriore o muscoli gastrocnemio) e alla loro raccolta su vetrini.
NOTA: Tagliare la sezione alla regione medio-ventre del muscolo. Inoltre, per amore di precisione, tagliare le sezioni perpendicolarmente all'asse di montaggio. - Tenere i vetrini all'interno della camera criostato. Non lasciare che scongelare se l'obiettivo è quello di realizzare se gli studi / IHC o colorazione enzimatica.
- Conservare i vetrini a -80 ° C per ulteriori analisi.
8. Valutazione di myofiber formato da laminina immunofluorescenza (Alternativa 1)
19. Sebbene la colorazione H & E di sezioni muscolari rappresenta un metodo valido e conveniente per l'analisi della morfologia, l'uso di un approccio IF 14 è significativamente più veloce e modestamente più accurata rispetto al metodo basato E H &. H & E i metodi sono descritti di seguito.
- Rimuovere sezioni di tessuto sia dal criostato oppure immagazzinamento -80 ° C e consentire loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 5 - 10 min).
NOTA: Per evitare interazioni non specifiche associate con anticorpi primari sollevate nei topi, è consigliabile utilizzare sia i anticorpi sollevati in un'altra specie o di avvalersi di kit disponibili in commercio immunorivelazione "mouse-on-mouse". - Immergere le sezioni in pre-cooled metanolo (-20 ° C) per 10 min.
- Lavare le sezioni in temperatura ambiente 1x PBS per 5 min.
- Rimuovere la PBS e utilizzare una penna per le applicazioni di immunoistochimica di circondare sezioni sul vetrino. Non lasciate che le sezioni completamente asciutto in qualsiasi punto.
- Applicare un tampone adatto bloccaggio (5 - 8% FBS in PBS o 5% siero di capra in PBS) sulle sezioni per 1 ora a RT.
- Rimuovere il tampone di bloccaggio.
- Applicare o un coniglio anti-laminina (1,30) o un topo anti-distrofina (1,30) anticorpo primario in tampone di bloccaggio sezioni per 2 ore a temperatura ambiente (o per una notte a 4 ° C) in una camera umida.
- Lavare le sezioni con PBS 1x per 5 min.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e lavare di nuovo le sezioni in PBS 1x per 5 min.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e applicare una corretta anticorpo secondario fluorescente (1: 1.000 in tampone bloccante) alle sezioni in una camera umida per 1 ora a RT.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare le sezioni con PBS 1x per 5min.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio con PBS 1x per 5 minuti. Rimuovere il tampone di lavaggio e coprire le sezioni con un vetro di copertura utilizzando un mezzo acquoso-based.
- Identificare le caratteristiche morfologiche del muscolo utilizzando immagini digitali della sezione macchiato. Per fare ciò, utilizzare un microscopio a luce fluorescente invertito per se le sezioni (un obiettivo 10X o 20X di ingrandimento è appropriato), insieme a un software della fotocamera e acquisizione di immagini digitali. Inserite una barra di scala in ogni immagine digitale (20 - 30 campi aleatori sono consigliati per ogni sezione muscolare) per facilitare la quantificazione del CSA. Le immagini devono essere salvati in formato TIF per essere compatibile con il software di analisi delle immagini utilizzando il programma ImageJ.
- Utilizzare una macro ImageJ distinguere tessuto connettivo dal tessuto contrattile (dimensione myofiber) attraverso la presenza di anticorpo secondario fluorescente dello nell'endomisio 20.
NOTA: La macro e le istruzioni sono disponibili presso l'autenticazioneors, Richard Lieber e Shannon Bremner. - Aprire il programma ImageJ facendo doppio clic sull'icona sul desktop.
- Caricare la macro CSA facendo clic una volta sulla scheda "Plugins". Spostare il cursore verso il basso per selezionare l'opzione "Installa" facendo clic una volta.
- Caricare il macro sezione trasversale selezionandolo dalla cartella è stato salvato, e quindi fare clic su "Apri".
- Una volta che la macro è stato aperto, aprire l'immagine istologico che contiene la barra di scala facendo clic su "File" e poi "Apri" dalla barra degli strumenti ImageJ.
- Una volta che l'immagine viene aperta, selezionare la "strumento linea retta" nel programma ImageJ cliccando sull'icona con la linea retta.
- Una volta selezionato il "strumento Retta", fate clic una volta sulla fine più a sinistra della barra di scala e quindi fare clic una volta sulla più a destra estremità della barra della scala. Se fatto correttamente, ci dovrebbe essere una linea gialla sovrapposto sulla barra di scala.
- Fare in modo che il Yellolinea di w è ancora sovrapposto sulla barra di scala, selezionare la scheda "Analizza" dalla barra degli strumenti ImageJ facendo clic una volta.
- Nella scheda "Analizza", spostare il cursore verso il basso e selezionare "scala set" facendo clic una volta.
- Nella finestra "Imposta scala", NON modificare il valore nella "distanza in pixel" scatola. Inserire la distanza nota della barra di scala nella casella "distanza nota". Cambiare le unità nella casella "Unità di lunghezza" per corrispondere con le unità barra di scala (cioè, micrometri = micron). Infine, selezionare "globale" facendo clic sulla casella a sinistra di "Global" una volta.
- Chiudere la finestra "Imposta scala".
- Aprire la prima immagine da misurare premendo il pulsante "O" sulla tastiera. Osservare una finestra pop-up che permette all'utente di trovare e selezionare l'immagine da misurare dalla cartella che è stato salvato in. Selezionare l'immagine facendo clic su di esso una volta e facendo clic su "Apri". <li> Una volta aperto, una finestra dovrebbe comparire per la selezione della gamma accettabile per misurazioni CSA e circolarità.
- Dopo aver impostato la gamma CSA e circolarità, osservare l'immagine coperta di pixel rossi con una finestra "Threshold". Regolare la soglia dell'immagine utilizzando le barre nella finestra "Threshold" finché le fibre muscolari sono riempiti accuratamente con pixel rossi.
NOTA: tentativo di ottenere il maggior numero di fibre che non si toccano l'un l'altro; se le fibre si toccano, verranno misurati come una grande fibra, che dovrà essere modificato a valle. - Dopo aver impostato la soglia, premere il tasto "1" sulla tastiera per misurare le fibre muscolari.
- Cerchia l'singole fibre muscolari con una linea gialla.Spostare attraverso l'immagine e rimuovere gli artefatti o fibre doppie che sono state selezionate dal programma. Per fare questo, selezionare le strutture che non sono le fibre di clic su di essi una volta, e quindi premere il tasto "D" sulla tastiera. Questo li cancellerà dalle misure.
- Selezionare e copiare le misurazioni dalla "finestra dei valori di misura", e incollarli in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
NOTA: I valori ottenuti possono anche essere utilizzati per valutare l'analisi della distribuzione delle fibre, che generalmente rappresenta un parametro utile per determinare se la crescita tumorale promuove il passaggio a fibre muscolari più piccoli. - Chiudere tutte le finestre aperte in ImageJ facendo clic sulla "X" nell'angolo in alto a sinistra delle finestre.
- Apri una nuova immagine da misurare premendo il tasto "O" e ripetendo i passaggi 8,24-8,29.
NOTA: Queste impostazioni vengono di solito lasciati ai valori predefiniti. Tuttavia, se si desidera modificare queste impostazioni, essere sicuri di mantenere i valori uguali per ogni immagine consecutiva da misurare nell'esperimento.
9. Valutazione di myofiber formato da H & E macchiato Sezioni (Alternativa 2)
- Posizionare il vetrodiapositive in vaschette Coplin contenente filtrati ematossilina di Harris per 8 min.
NOTA: In alternativa, Mayer ematossilina può essere utilizzato se una macchia meno intensa si desidera. - Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata.
- Immergere i vetrini in acqua di rubinetto per un massimo di 5 min.
- sciacquare rapidamente in acqua deionizzata, e poi incubare in soluzione filtrata eosina 1% per meno di 2 min.
NOTA: se una macchia più intenso si desidera, aggiungere 1 - 2 gocce di acido acetico (0,01% o meno) alla soluzione eosina. - Inizia la procedura di disidratazione. Sciacquare i vetrini in etanolo al 70% per meno di 1 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 90% per 1 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 95% per 1 min.
- Immergere i vetrini in etanolo al 100% per 2 min.
- Immergere i vetrini in xilene per 2 minuti. Spostare le diapositive in un altro vaso Copley contenente xilene fresco per altri 2 minuti.
NOTA: Mantenere le diapositive in xilene (non più di 1 ora) fino a quando non sono coprioggetto. - Posizionare il coverslips sulle sezioni muscolari utilizzando Permount o di un mezzo di montaggio a base di xilene di scelta.
- Osservare i vetrini H & E-colorati sotto un microscopio con un ingrandimento 20X, e di acquisire le immagini di tutta l'area sezione di muscolo. Ottenere immagini utilizzando un microscopio luminoso-luce, macchina fotografica digitale e software per la cattura delle immagini.
NOTA: La presenza di una barra di scala o l'immagine di un micrometro taken allo stesso ingrandimento sarà necessario per determinare la CSA. Come sopra, registrare almeno 20 - 30 campi casuali per ogni sezione muscolare. - Valutare la dimensione myofiber utilizzando il software ImageJ. Aperto tutti i immagine digitale. Impostare la scala come sopra. Misurare almeno 1.500-2.000 fibre muscolari al muscolo utilizzando lo strumento di selezione a mano libera, tracciando la circonferenza della fibra con il mouse o, per l'ingresso più veloce, con un dispositivo di input tablet e penna.
10. Raccolta e analisi dei dati
- Al fine di stabilire le dimensioni delle fibre muscolari, valutare la superficie media di fibra "."Calcola mezzi e SD per le misure ottenute per ciascun muscolo, comprendente sia l'area e il diametro di Feret. Inoltre, al fine di valutare se l'impostazione sperimentale è associato con uno spostamento verso fibre muscolari sia piccole o più grandi, analizzare la" distribuzione delle fibre ".
- Valutare il significato del risultato eseguendo una T-test non appaiati per due gruppi. Determinare i rapporti tra i valori ottenuti per il gruppo di topi C26 e per il gruppo di controllo. Tracciare i valori su un grafico segnalato la mezzi SD e la frequenza di distribuzione / istogramma che intende dimostrare il cambiamento nelle dimensioni in fibra.
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Representative Results
C26 cinetica di crescita tumorale mostrano una fase di latenza per la prima 7 - 8 d dopo l'iniezione, seguita da crescita cellulare esponenziale (4 - 5 d). La massa tumorale raggiunge infine ~ 10% del peso corporeo (circa 2 g; Figura 1A-B). Durante la prima fase, il tumore può essere localizzato solo palpazione e appare come una piccola sporgenza della pelle. Nella seconda fase, il tumore è osservato come una massa sotto la pelle. Raramente, il tumore diventa ulcerata, causando una ferita aperta; in questo caso, il mouse viene escluso dal gruppo sperimentale ed è umanamente eutanasia.
Il peso corporeo è invariato nella prima fase, ma è significativamente ridotta nella seconda fase, quando raggiunge 10 - 15% del peso corporeo iniziale (30% nel caso di peso libero-tumorale; Figura 1A). topi portatori di tumore appaiono sprecati e ha mostrato pelliccia spettinato, alla fine delperiodo sperimentale, con una condizione corporea (BC) punteggio pari a 1 18 (Figura 1C). BC1 rappresenta un mouse gravemente emaciato, in cui le strutture scheletriche sono evidenti e le vertebre sono decisamente segmentato. Perdita di peso corporeo si spiega soprattutto sia da atrofia muscolare scheletrico e tessuto adiposo (Figura 1B). Perdita di peso corporeo è compatibile con una riduzione di circa 20 - 30% in peso, muscolo scheletrico, in particolare nel gastrocnemio, tibiale anteriore e quadricipite (Figura 2). Il muscolo cardiaco è anche significativamente ridotto in peso, anche se in misura minore rispetto agli altri muscoli scheletrici (Figura 2). È interessante notare, epatomegalia (+ 16%, p <0,01) e splenomegalia (+ 110%, p <0,01) sono generalmente rilevato in ospiti tumorali, mentre la massa grassa, simile al muscolo scheletrico, è gravemente impoverito (-70%, p <0.001 Figura 3).
(Figura 4A-B). In particolare, l'analisi della distribuzione di frequenza mostrato uno spostamento verso fibre piccole dimensioni in topi C26-cuscinetto, suggerendo che il muscolo intero subisce l'atrofia in presenza di un tumore C26 (Figura 4C). Risultati simili possono essere osservati sfruttando una metodologia tradizionale H & E-based per la quantificazione della dimensione delle fibre, sebbene la grandezza della variazione CSA muscolare associata con la crescita del tumore è leggermente diversa (38% contro controllo, p <0,01 per l'IF metodo sede; -18% rispetto al controllo, p <0,01 per il metodo basato e H &; figura 5).
Figura 1: peso corporeo sotto controllo e topi C26-cuscinetto. A) Curva peso corporeo sotto controllo e ospita C26 per l'intero periodo di sperimentazione (14 giorni dopo l'iniezione del tumore). B) del peso corporeo iniziale (IBW), finale libera da tumore del peso corporeo (FBW), e il peso del tumore in controllo e C26- animali cuscinetto. C) le immagini rappresentative dei controlli e C26 portatori al momento del sacrificio (il giorno 14 dopo l'inoculazione del tumore). I dati sono espressi come media SD. n = 6. Importanza delle differenze: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 rispetto al gruppo di controllo utilizzando il test t di Student. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Pesi muscolari in controllo e C26-cuscinetto topi. Tibiale, gastrocnemio, quadricipiti, e pesi di cuore nel controllo e C26 tumorali portatori sono segnalati come il peso / 100 mg IBW. I dati sono espressi come media SD. n = 6. Importanza differenze: ** p <0.01 e *** p <0.001 rispetto al gruppo di controllo utilizzando il test t di Student.
Figura 3:. Peso degli organi di controllo e topi C26-cuscinetto Il fegato, la milza, e dell'epididimo pesi pad grasso nel controllo e C26 tumorali portatori sono riportati in quanto il peso / 100 mg IBW. I dati sono espressi come media SD. n = 6. Importanza differenze: ** p <0,01 rispetto al gruppo di controllo.
Figura 4: Morfometria per myofiber Dimensioni mediante immunofluorescenza. A) reazione immunoistochimica fluorescente delle sezioni tibiale utilizzando un anticorpo anti-distrofina (Vector Laboratories) dal controllo e ospita C26. Ingrandimento: 10X. Bar Dimensioni:. 100 micron B) Quantificazione del CSA nel muscolo tibiale misurata con la distribuzione di frequenza ImageJ macro C) del CSA nel muscolo tibiale di controllo e di topi C26-cuscinetto.. I dati sono espressi come media ± SD. n = 6 per ogni gruppo. Significatività delle differenze: ** p <0,01 rispetto al gruppo di controllo utilizzando il test t di Student.
Figura 5: Morfometria per myofiber Size da H & E. A) ematossilina e eosina sezioni tibiale di controllo e ospita C26. Ingrandimento: 20X. Bar Dimensioni:. 100 micron B) Quantificazione e la frequenza di distribuzione diCSA nel muscolo tibiale. I dati sono espressi come media SD. n = 6. Importanza delle differenze: *** p <0.001 rispetto al gruppo di controllo utilizzando il test t di Student.
| autori | ceppo di topi | mouse genere | Numero di cellulare | Origine | Impiantato come tumore solido? | Sito di iniezione | giorni |
| Lazzaro et al., 1999 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NSC | NO | regione dorsale | 17 |
| Al-Majid e McCarthy 2001 | CD2F1 | F | 2,5 x 10 6 | OSUMC | NO | regione dorsale | 17 |
| Samuels et al., 2001 | Balb / c | M | 0,5 g / ml di sospensione tumorale | ns | SÌ | regione dorsale | Fino a 11 |
| Acharyya et al., 2004 | CD2F1 | M | 1 x 10 7 | OSUMC | NO | fianco destro | Fino a 24 |
| Aulino et al., 2010 | Balb / c | ns | 0,5 millimetri 3 | NSC | SÌ | regione dorsale | 21 |
| Benny-Klimek et al., 2010 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NO | regione dorsale | 14 |
| Bonetto et al, 2011.; 2012 | CD2F1 | F | 1 x 10 6 | OSUMC | NO | regione dorsale | |
| Cosper e Leinwand 2010 | CD2F1 | M + F | 5 x 10 5 | ns | NO | fianco destro | Fino a 27 |
| Murphy et al. 2012 | CD2F1 | ns | 5 x 10 5 | NCI / OSUMC | NO | regione dorsale | 14 |
| Cornwell et al. 2014 | CD2F1 | M | 5 x 10 5 | NSC | NO | Destra & fianco sinistro | Fino a 26 |
| Assi et al., 2016 | Balb / c | ns | 1 x 10 6 | Servizio Cell Line | NO | regione dorsale | Fino a 22 |
Tabella 1:. Il confronto dei diversi protocolli utilizzati per la C26 impianto Differenprotocolli t di C26 impiantazione sono forniti, con particolare riferimento al mouse ceppo utilizzato, il numero di cellule e tipo di tumore inoculato, l'origine delle cellule, il sito di iniezione, e la lunghezza del periodo sperimentale. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NSC: National Cancer Institute. linea cellulare commerciale servizio NS: non specificata.
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Discussion
Soprattutto nelle ultime fasi, cancro colorettale è associato con lo sviluppo di cachessia, che è responsabile per poveri risultati e riduzione della qualità della vita del paziente. Molti studi si sono concentrati sul trattamento di condizioni secondarie al cancro; Tuttavia, nonostante i numerosi sforzi in questa direzione, non c'è ancora una terapia approvato per cachessia neoplastica 21. Pertanto, è imperativo che i modelli animali assomigliano alla patologia umana più vicino possibile al fine di massimizzare la definizione di risultati.
C26 topi portatori di tumore sono un modello sperimentale comunemente usato di cachessia neoplastica 22-24. Questo modello è molto simile alla malattia umana, mostrando riduzioni del corpo, dei muscoli, e la massa grassa, così come fibra atrofia muscolare e una maggiore espressione dei geni infiammatori e ubiquitina ligases coerenti con marcata proteine ipercatabolismo 2,5. Nonostante questo, alcune disparità con i dati ottenuti in Patie cancronti sono stati segnalati 25,26. In effetti, alcune caratteristiche del modello, tra cui l'ambiente di crescita non fisiologica (ad esempio, un tumore ectopica coltivate per via sottocutanea, invece di ortotopicamente impiantato nel tratto GI), il periodo sperimentale relativamente breve rispetto agli altri modelli (ad esempio iniezione, genetica o ortotopico di tumori), la dipendenza da iL-6 azione e il necessario impiego di topi CD2F1 o Balb / c possono rappresentare gravi limitazioni e potrebbe vincolare l'interpretazione dei risultati.
Il protocollo attuale ha dimostrato di essere altamente riproducibile attraverso molti esperimenti eseguiti nel nostro laboratorio, mantenendo le stesse caratteristiche e consentendo il confronto tra i risultati ottenuti in tempi diversi, in differenti posizioni geografiche, e da diversi ricercatori 3,10. Tuttavia, al fine di promuovere la riproducibilità dei dati, è importante stabilire orientamenti chiari e comuni.
come riuniscono suld dalla letteratura, parecchi avvertimenti potrebbe impedire la riproduzione degli stessi dati in due laboratori diversi. Per gli stessi motivi, l'uso di diversi protocolli può generare diversi fenotipi e risultati, nonché condurre a risultati contraddittori e discutibili. Infatti, sono state riportate differenze di eseguire questo modello animale, derivanti principalmente dal ceppo (Balb / c o CD2F1) 2,5,27-29 o sesso topi utilizzati 17, il tipo di tumore che è stato impiantato (una sospensione cellulare 3 , 29 piuttosto che un tumore solido in un innesto 2,30), la sorgente del tumore (NCI, ATCC o OSUMC), il numero di celle C26 che sono stati iniettati, e il sito di iniezione o impianto (fianchi 6,17, 31 o regione dorsale 3,10,32). Nessun confronto diretto degli effetti associati all'impianto di linee cellulari C26 ottenute da diverse fonti (principalmente OSUMC contro NCI) è mai stato eseguito, impedendo così noi da trarre qualsiasi conclusi definitivaons. Tuttavia, è probabile che la scelta della fonte di cellule può anche influenzare significativamente i risultati attesi. Quando si considera la scelta dei maschi contro femmine, gli investigatori dovrebbero essere ricordato differenze significative nei risultati. Infatti, come riportato da Cosper e Leinwand 17, topi portatori di tumore maschi, a causa della mancanza di estrogeni, possono mostrare un fenotipo più grave delle femmine, compresa una maggiore perdita di massa cardiaca e la mortalità, una più robusta risposta pro-infiammatoria al tumore , e una maggiore autofagia cardiaco.
Soprattutto per quei ricercatori che non hanno familiarità con questo modello e potrebbe inizialmente affrontare problemi, sulla base sia un'analisi potenza e nostra esperienza precedente, l'uso di almeno 6 animali per condizione sperimentale (n = 6) è consigliabile per rilevare statisticamente differenze significative. E 'anche importante che la randomizzazione viene eseguito con cura, in modo che i pesi corporei iniziali negli animali sperimentalinon differiscono in modo significativo tra i gruppi. Analogamente, è consigliabile che, al fine di evitare la variabilità inter-operatore, lo stesso sperimentatore eseguire la raccolta dei tessuti e organi su ogni animale. Inoltre, è imperativo che i tessuti (particolarmente muscolari) sono congelati il più rapidamente possibile al fine di preservare le RNA e la struttura e l'attività enzimatica, soprattutto se l'obiettivo dello studio è di valutare l'espressione genica o per valutare le attività enzimatiche. Inoltre, nel tentativo di determinare CSA muscolare, abbiamo dimostrato che la segnalazione della zona fibra è generalmente accettato e rappresentante di dimensione delle fibre muscolari. Qui, vi presentiamo due metodi distinti per valutare CSA muscolare. Come mostrato nelle figure 4-5, entrambi i metodi sono stati in grado di rilevare una significativa riduzione delle miofibre dimensioni tra controlli e gli host tumorali, anche se il grado di sprecare apparso differente.
Questa discrepanza può derivare dal fatto che, anche se entrambi i metodi sono modi accettabili per culidimensioni delle fibre muscolari s, la quantificazione delle caratteristiche muscolari di diapositive H & E-colorato è ancora un processo manuale o semi-automatico, il più delle volte, in termini di tempo, e colpiti da precisione limitata ad alta intensità di manodopera. Sulla base della nostra esperienza, riteniamo che il metodo IF-based è una tecnica più accurata per segnalare CSA muscolare. Infatti, il numero di fibre che possono essere misurati automaticamente prendendo vantaggio di questa tecnica è significativamente più grande, aumentando così la precisione della misura. Da segnalare, per entrambe le tecniche, un metodo alternativo di dimensioni muscolare segnalazione sta valutando il diametro del Feret. È interessante notare, questo è considerato uno strumento molto affidabile a causa del fatto che tale parametro è largamente indipendente dall'angolo di sezionamento. Altri parametri, come il "diametro interno minimo" e il "diametro esterno minimo" sono insensibili al piano di sezionamento e possono essere utilizzati al posto del diametro della Feret come indicazioni alternative del fibdimensioni ER.
In conclusione, anche se la comunità cachessia deve chiaramente stabilire modelli più fisiologici per lo studio di atrofia muscolare associata al tumore, riteniamo che i topi recanti il carcinoma del colon C26 rappresentano un modello ben standardizzata e facile da usare per investigare alterazioni molecolari e anormalità fisiologiche solito rilevate dopo il verificarsi di un tumore. Le applicazioni future comporteranno la ricerca se l'impianto ortotopico di cellule C26 nel colon potrebbe rappresentare un modello adeguato e più fisiologico del colon-retto cachessia neoplastica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture Flasks | Falcon - Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
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