Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.
Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.
La atrofia muscular es una complicación grave de diversas condiciones clínicas tales como el cáncer, sepsis, hígado, cirrosis, insuficiencia cardíaca y renal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y el SIDA. En particular, el desgaste muscular es evidente en al menos 50% de los pacientes con cáncer de 1. La pérdida de músculo esquelético en el cáncer resulta de una mayor degradación de las proteínas debido a la sobre-activación de los sistemas proteolíticos del músculo esquelético y / o de disminución de la síntesis de proteínas 6. La lipólisis es también evidente, lo que lleva a la disminución de tejido adiposo. Clínicamente, la caquexia está asociada con una reducción de la calidad y la duración de la vida y se estima que es la causa de la muerte en 20 – 30% de los pacientes de cáncer de 7. El uso de modelos experimentales que se asemejan a la enfermedad humana tan estrechamente como sea posible sería beneficioso. Un modelo animal óptima se caracteriza por una alta reproducibilidad, así como por la interferencia limitada de diferentes terapias y los factores impredecibles dela dieta, el sexo y los antecedentes genéticos que se asocian generalmente con la condición clínica 8. Hasta el momento, la caquexia del cáncer se ha estudiado principalmente en modelos animales que se caracterizan por el trasplante de células de cáncer o de inyección de carcinógenos, aunque un nuevo método es el uso de ratones modificados genéticamente susceptibles al desarrollo de cáncer.
Los ratones que llevan el carcinoma C26 (también referidos como de colon-26 y adenocarcinoma) representar un modelo bien caracterizado y utilizado ampliamente de la caquexia del cáncer de 2,5. El crecimiento de los resultados C26 tumorales en el cuerpo y la pérdida de peso muscular, principalmente mediante el aumento de la grasa y el catabolismo proteico 9. Generalmente, un peso del tumor 10% versus el peso corporal total se asoció con una reducción de 20-25% en peso del músculo esquelético y un mayor agotamiento de la grasa de 3,10. Hepatomegalia y esplenomegalia también se observan con el crecimiento tumoral, junto con la activación de la respuesta de fase aguda y la elevación de pro-inflalos niveles de citoquinas mmatory 3,11. Entre estos, se sabe que la IL-6 juega un papel fundamental en la mediación de pérdida de masa muscular en el modelo C26, a pesar de que esta citocina no es probablemente el único inductor de caquexia 12. Elevada IL-6 causa atrofia muscular a través de la activación de la vía de JAK / STAT3, y la inhibición de este factor de transcripción puede prevenir atrofia muscular 3,4.
Durante pérdida de masa muscular inducida por C26, como en muchas condiciones de atrofia muscular, la masa muscular se pierde en gran medida a través de reducciones en el contenido de proteína del músculo a través de las fibras musculares, no a través de la muerte celular o pérdida de fibras 13. En C26 caquexia, un cambio hacia áreas de sección transversal más pequeñas se observa tanto en glucolíticas y oxidativas fibras 2. Esto también es coherente con una reducción de la fuerza muscular 5. Muchos grupos de todo el mundo han aprovechado el modelo C26 con el fin de descubrir nuevos mediadores de la pérdida de masa muscular o fármacos clínicamente relevantes para el cáncer cacHexia. Sin embargo, se ha informado de muchos procedimientos diferentes para el uso de este modelo, aumentando las preocupaciones acerca de la consistencia de los datos obtenidos y que presenta obstáculos al reproducibilidad en diferentes condiciones experimentales. Aquí mostramos un uso típico de este modelo para el estudio de la caquexia por cáncer que produce datos estandarizados y reproducibles.
Especialmente en sus últimas etapas, el cáncer colorrectal se asocia con el desarrollo de la caquexia, que es responsable de los resultados y las reducciones en la calidad de vida del paciente más pobres. Muchos estudios se han centrado en el tratamiento de condiciones secundarias al cáncer; Sin embargo, a pesar de muchos esfuerzos en este sentido, aún no existe una terapia aprobada para la caquexia por cáncer 21. Por lo tanto, es imperativo que los modelos animales se asemejan a la patología humana ta…
The authors have nothing to disclose.
We thank Richard Lieber and Shannon Bremner for their ImageJ macro and instructions. While at Thomas Jefferson University, this work was supported by the Pennsylvania Department of Health CURE Grant TJU No. 080-37038-AI0801. Subsequently, this study was supported by a grant to AB from the National Institutes of Health (R21CA190028), and by grants to TAZ from the National Institutes of Health (R01CA122596, R01CA194593), the IU Simon Cancer Center, the Lustgarten Foundation, the Lilly Foundation, Inc., and the IUPUI Pancreas Signature Center.
Cell culture Flasks | Falcon – Becton Dickinson | 35-5001 | |
DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
FBS | Gibco | 26140 | |
Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
Image J | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
Microtainer | BD | 365873 |