Introduction
Эпилепсия является распространенным неврологическим расстройством, при котором повторяющиеся приступы происходят в течение продолжительности жизни пациента. Большинство эпилептических рецидивы могут быть хорошо контролируются противоэпилептическими препаратами (AEDs). Тем не менее, около 30% больных эпилепсией развиваются огнеупорную эпилепсия 1. Эпилепсия причины нарушения сна, которые могут привести к дальнейшему обострению рецидивов. Данные демонстрируют тот факт , что эпилепсия может либо нарушить сон в ночное время или может привести к чрезмерной сонливости в дневное время 2,3. Наши предыдущие исследования также указывают на, что эпилепсия происходит в zeitgeber время (ZT) 0, т.е. начало светового периода в свет: темнота цикла, уменьшается сон; это опосредовано кортикотропин-рилизинг гормона (CRH), гомеостатического фактор. Эпилепсия в ZT13 (начало темного периода) усиливает экспрессию другого гомеостатической фактора, интерлейкина-1 (IL-1), что повышает сон. Циркадные ритмы сна изменяются, когда эпилепсия возникает при ZT6, серединалегкий период 4,5. С другой стороны, проблемы со сном еще больше усугубит прогрессирования и рецидивов эпилепсии 6. На основании вышеупомянутого доказательства, мы пытаемся выявить оптимальный терапевтический метод для одновременного управления эпилепсию и предотвратить нарушения сна у больных эпилепсией. Ранее мы обнаружили , что электроакупунктуры (EA) с частотой стимуляции 10 Гц, в котором определенное количество тока доставляется в Acupoint через нержавеющей стальной иглой, успешно подавляет ЭГ (ЭГ) эпилептические деятельности и нарушения сна эпилепсия индуцированных 7 , EA с частотой стимуляции 100 Гц дальнейшее ухудшение эпилептические деятельности и нарушения сна у крыс 8,9. Этот успешный эксперимент зависит от трех факторов: во-первых, возможной эпилептического животной модели; Во-вторых, способ записи сна и анализа у грызунов; и в-третьих, точное выполнение акупунктуры и точность Acupoint Locatiдополнения.
Эпилепсией были разделены на два основных типа: фокальной эпилепсии и генерализованной эпилепсии. Мы заинтересованы в фокальной височной эпилепсии (TLE), генерализованной эпилепсии, эпилептического статуса (SE), и рецидива спонтанного генерализованной эпилепсией. Таким образом, различные манипуляции применяются для создания подходящих эпилептических моделей для наших экспериментов. Для того, чтобы установить фокусное TLE, низкая доза пилокарпина вводят в левое центральное ядро миндалины (CEA). Чтобы проверить эту модель, шесть ECOG электроды имплантированы на фронтальную (F1 & F2), теменной (P1 & P2), и затылочных (О1 & O2) долек в обоих левого и правого полушарий, а еще через две опорные электроды (R1 & R2) расположены над мозжечком обоих полушарий. Дополнительное руководство микроинъекции канюля имплантируется в левый CEA (AP, 2,8 мм от темени; мл, 4,2 мм, DV, 7,8 мм по отношению к темени). Координаты выполнены из Paxinos и Watson атласе крысы 10. Если фокусное TLE успешно индуцируется, только запись с электрода на левой теменной коре (P1), который находится рядом с левой CeA, должны приобрести доминирующие эпилептиформные ECoGs, без существенных ECoGs эпилептиформными записанных от других электродов ЭГ. Внутрибрюшинной (IP) инъекции пилокарпина в крыс индуцируют генерализованная эпилепсия и SE, но это может привести к летальному исходу. Пять IP инъекции пентилентетразол (PTZ) с однодневным интервалом между каждой инъекцией успешно индуцируют спонтанное генерализованная эпилепсия у мышей, а также обеспечить выживание мышами. Два провода ЭГ электроды имплантируют в лобной и теменной коры головного мозга у мышей, чтобы принимать сигналы ЭГ и проверить самопроизвольно рецидивирующий эпилепсию.
Полисомнография (ПСГ) представляет собой комплексный метод для записи физиологических изменений, которые происходят во время сна, и он может объективно классифицировать сон в разных стадиях без быстрого движения глаз (NREM) и гAPID движения глаз (REM) сна. PSG записывает параметры функций организма, включая мозговые волны (электроэнцефалограммы, ЭЭГ), движений глаз (electrooculogram, EOG), скелетных мышц тонов (ЭМГ, EMG), сердечного ритма (ЭКГ, ЭКГ), а уровень кислорода в крови и дыхательных параметров. У крыс, мы записываем ECoGs, ЭМГ, корковой температуры и двигательную активность для классификации состояний в бдительности бодрствования, NREM сна и быстрого сна. Анализ сна у мышей проводят с использованием ECoGs, ЭМГ и результаты двигательной активности. Крыс имплантируется с тремя ЭГ ввернуть электроды на лобной, теменной и контралатеральной мозжечка на кору стереотаксической хирургии. определение после приобретения Бдительность состояний (бодрствования, сна NREM и REM сна) проводится в соответствии с параметрами, полученных от ECoGs, ЭМГ, температуры мозга и двигательной активности. Подробные критерии категоризации поведения животного в обоих крыс и мышей описаны в тон протокол.
Как у крыс и мышей, должны быть под наркозом с низкой дозой zoletil (25 мг / кг), что составляет половину доза анестетиков обычно вводят во время стереотаксис, перед выполнением ручного акупунктура или EA. Эта доза позволяет животным просыпаются от 30 до 35 мин после инъекции. Либо ручной акупунктуры или ЕА выполняется в начале темного периода, с постоянным периодом времени 30 мин, и каждое животное последовательно обрабатывают в течение двух-трех дней. Стимулирующие токи EA поставляются в определенной Acupoint через нержавеющей стальной иглы, которая вставляется в Acupoint. Текущий стимул поезд двухфазных прямоугольных импульсов, в котором длительность импульса составляет 150 мс, а интенсивность стимуляции 1 мА. Если сухая игла используется для ручной акупунктуры, иглы вставляются в акупунктурных дерганая 10 раз каждые 5 минут. Трудная часть ручной акупунктуры или ЕА для локализации акупунктурных у грызунов. LOCданию акупунктурных у крыс или мышей похож на их анатомическое расположение в организме человека. Например, двусторонние акупунктурных Fengchi расположены 3 мм от задней срединной линии на шее, между двумя ушами, который похож на его анатомическое расположение в организме человека 11. Кроме того, акупунктурных точек с низким сопротивлением на коже может быть дополнительно подтверждена. Sham иглоукалывание или фиктивных Е.А. манипуляция необходима для акупунктуры или экспериментов EA. Sham иглоукалывание или фиктивных EA должны быть выполнены на не-Acupoint , расположенный близко к Acupoint, например, рядом с подмышечной 12.
Для того, чтобы успешно исследовать эффекты акупунктуры или ЕА на эпилепсии и эпилептических индуцированных нарушения сна, следующие факторы должны быть на месте: посильная эпилептические животная модель, точный анализ эпилептиформными ECoGs и рецидивы эпилепсии, метод классификации бдительности состояний , а точность выполнения акупунктуры или ЕА у грызунов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные протоколы одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) из Национального университета Тайваня путем.
1. стереотаксис для имплантирования ЭГ электродах ЭМГ электродах, Brain термистор и нагнетательных Guide канюли
- Для крыс (250 - 350 г, от 6 до 8-недельного возраста крыс Sprague-Dawley)
- Обезболить крыс IP инъекции 50 мг / кг zoletil. Подтвердите правильную глубину анестезии, наблюдая отсутствие реакции после щипать заднюю лапу. Нанести глазную мазь, сбрить мех, и стерилизовать кожу с повидон-йода и 75% этанола. Вводят антибиотик (пенициллин G), чтобы предотвратить инфекцию.
- Приготовьте скальпели, ножницы, кровоостанавливающих, и сеток прижиганием машина для хирургии. Стерилизацию хирургического шестерню и сеток с помощью автоклава и прижиганием на 75% этанола.
- Поместите панель уха в ушной канал и установите крысу к стереотаксиса.
- С помощьюскальпель, делают приблизительную 2 см срединный разрез на черепе вдоль линии между двумя ушами, двигаясь в каудальном направлении. Клип кожных лоскутов с кровоостанавливающих, чтобы подвергать черепа и удаления ткани по черепу с помощью скальпеля.
- Дрель восемь отверстий (F1, F2, Р1, Р2, O1, O2, R1 и R2), каждый из приблизительно 0,7 мм в диаметре, на черепе с помощью роторного инструмента. Винт восемь ЭГ электродов на лобных, теменных и затылочных долей и мозжечка в обоих левого и правого полушарий. Эти электроды используются для обнаружения фокальной эпилепсией.
- Используйте следующие координаты для записи электродов: фронтальный (F1 и F2): +2,0 мм впереди брегмы и +2,5 мм от средней линии, теменной (P1 и P2): -2,0 мм впереди брегмы и +3,0 мм от средней линии и затылочной (O1 и O2): -5,5 мм впереди брегмы и +3,0 мм от средней линии.
- Поместите два опорных электродов (R1 и R2) над мозжечком (-11,0 мм впереди брегмы и +4,0 мм от midliпе).
- В отдельной группы крыс, бурильных три отверстия и поместите два винта EEG электродов над правой фронтальной (F2) и теменной долей (P2) от кортикальных с теми же координатами, как описано в шаге 1.1.5.1. Поместите третий электрод ЭЭГ над левым мозжечка (R1), который служит для заземления животных и уменьшить сигнальные артефакты. Эти электроды используются для подтверждения генерализованная эпилепсия и анализа этапов бдительности.
- Отделить кожу шеи и мышцы и вставить два электрода EMG в мышцу шеи.
- Дрель другое отверстие на черепе и поместите микроинъекции направляющую канюлю в левый CEA (AP, 2,8 мм от темени; ML, 4,2 мм, DV, 7,8 мм по отношению к темени) у крыс. Координаты выполнены из атласа 10 крыс Paxinos и Ватсона.
- Дрель большее отверстие (диаметром 1,6 мм), на черепе и вставьте термистор калиброванный 30 кВ на поверхности теменной коры, которая будет цементировать позже, в МониTOR коркового температуру у крыс.
- Используйте марлю и прижигание, чтобы остановить кровотечение, когда это происходит.
- Пропустите изолированные провода от электродов ЭГ и ЭМГ электродов на пьедестал и подключить термистор к тросу. Цемент пьедестал и руководство канюлю к черепу с зубной акрила.
- Лечить надрез местно с Полиспорина (бацитрацин цинк / полимиксин В сульфат), чтобы предотвратить инфекцию. Дайте животным как ибупрофен и пенициллин G в воде в течение одной недели после операции.
- Для мышей (20 - 30 г, от 6 до 8-недельного возраста линии C57BL / С мыши)
- Обезболить мышей путем IP инъекции 50 мг / кг zoletil и подтвердить правильную глубину анестезии, наблюдая отсутствие реакции после щипать заднюю лапу. Нанесите мазь для глаз. После бритья меха, стерилизовать кожу с повидон-йода и 75% этанола. Вводят антибиотик (пенициллин G), чтобы предотвратить инфекцию.
- Поместите бар уха в слуховой проход икрепление мыши к стереотаксиса.
- Используя скальпель, делают приблизительную 1,5-см срединный разрез на черепе вдоль линии между двумя ушами, двигаясь в каудальном направлении. Клип кожных лоскутов с кровоостанавливающих, чтобы подвергать черепа и удаления ткани через череп с скальпелем.
- Poke два отверстия на черепе с хирургическими ножницами и поместить два провода ЭГ электроды на правой лобной доле (F2: +2,0 мм брегмы и +1,5 к средней линии) и левой теменной доли (P1: -3.0 мм брегмы и -2,5 мм от средней линии).
- Отделить кожу шеи и мышцы и вставить два электрода EMG в мышцу шеи.
- Подключение изолированных проводника из проволоки ECOG электродов и электродов ЭМГ к женским терминалам и разъемом 2,54 мм, а затем цемент на череп с зубной акрила.
- Лечить надрез местно с Полиспорина (бацитрацин цинк / полимиксин В сульфат), чтобы предотвратить инфекцию. Дайте животным как ибупрофен и пенициллин G в воде для одного уиK после операции.
- Разрешить всем животным восстановиться в течение семи дней до начала экспериментов.
- Дом крысы или мыши отдельно в отдельных клетках записи, в изолированном помещении, где температуру поддерживают на уровне 23 ± 1 ° С и свет: темнота (L: D), ритм контролируется в 12: 12-часовой цикл (40 Вт х 4 трубки освещения). Обеспечить пищу и воду в неограниченном количестве .
- Подключите ЭГ, ЭМГ, и терморезистор через привязи к усилителям через одну неделю после операции, чтобы начать запись.
2. Создание координационного центра TLE эпилепсия, SE, и спонтанными возвратного эпилепсией
- Для крыс
- Администрирование 0,5 мкл пилокарпин (2,4 мг / мкл) в левую CeA через нагнетательную направляющей канюли с помощью микроинъекции насоса. Скорость впрыска должна быть установлена на уровне 0,2 мкл / мин, чтобы вызвать фокальную ОДВТ.
- IP-инъекции 300 мг / кг пилокарпина, чтобы вызвать обобщенную EPILepsy с рецидивирующим SE.
- Для мышей
- IP-администрирования PTZ (0,035 мг / г веса тела мыши) в определенной точке ZT каждый день. Пять инъекций подряд будет вызывать развитие спонтанно и периодически генерализованной эпилепсией.
- Для обоих крыс и мышей
- Усиливающий сигналы ECOG на 5000 и фильтрации аналоговых полосовой от 0,1 до 40 Гц.
- С помощью А / Ц преобразования плату для преобразования аналоговых ECoGs сигналы в цифровые сигналы с частотой дискретизации 128 Гц.
- С помощью программного обеспечения для визуального скоринг и анализировать начало и продолжительность эпилепсии. Измерение временной масштаб, чтобы представить длительность.
- Определение ЭГ эпилепсию появлением эпилептических пиков с амплитудой большей , чем 2 мВ и с длительностью более 30 лет 13.
3. Классификация Бдительности государств
- Для крыс
- Определение состояния бдительности, используя параметры, полученные от ECoGs, ЭМГ, температуры головного мозга и передвижению в 12-е годы эпизода записи. Подключите ЭГ, ЭМГ, и терморезистор через привязи к усилителям через одну неделю после операции, чтобы начать запись. Оценка состояния с заказного программного обеспечения в соответствии с этапами 3.1.5 - 3.1.7.
- Измерить деятельность опорно-двигательного аппарата с помощью инфракрасного детектора движения, интегрировать сигналы каждые 1 сек, и сохранять сигналы.
- Мера кортикальной температуры и хранить сигналы.
- Классифицировать состояния бдительности в соответствии с нашими ранее определенными критериями 14.
- Оценка бодрствование, используя следующие характеристики: малой амплитуды ECoGs с спектров высоких частот, более высокую мощность дельта (0,5 - 4,0 Гц) и мощность ниже тета (6,0 - 9,0 Гц); доминирующей двигательной активности; высокая активность EMG; и постепенно увеличивая температуру коры головного мозга.
- Оценка NREM сна с помощью followinг характеристики: дельта-волны доминирующие ECoGs с большими амплитудами, снизилась активность EMG, снижение температуры коры головного мозга, и отсутствие двигательной активности.
- Оценка фазы быстрого сна, используя следующие характеристики: снижение амплитуды ECoGs с доминирующей частотой тета, неожиданно повышенной корковой температуры, минимальной ЭМГ активностью и низкой локомоторной активности с подергиваний тела.
- Для мышей
- Повторить классификацию зоркости состояний в мышей, проведенные у крыс, за исключением того, что нет кортикальный температура, зарегистрированная от терморезистора.
4. Выполнение ручной акупунктуры и EA в Rats
- Крыса наркоз для протокола EA.
- Найдите Acupoint по анатомии и подтверждают низкий импеданс кожи на Acupoint. Индикатор мигает, когда обнаружит низкий импеданс кожи. Примечание: Fengchi акупунктурных расположены 3 мм от задней срединной линии будетпромежуточные кадры двумя ушами, на шее.
- Вставьте из нержавеющей стали иглы в акупунктурных на глубине 2 мм.
- Twitch вставленное иглы 10 раз через каждые 5 мин.
- С помощью функционального электрического стимулятора, поставить поезд двухфазных импульсов (150 мкс длительность каждого) с интенсивностью 1 мА к акупунктурных через иглу.
- Выполните симуляцию иглоукалывания или мнимое EA в качестве контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Существуют различные модели крысы и мыши, чтобы удовлетворить потребности различных типов эпилепсией. Для того, чтобы вызвать фокальную ОДВТ, 0,5 мкл пилокарпин (2,4 мг / мкл) вводят в левый CEA. Преобладающими эпилептиформные ECoGs получают из электрода ЭГ на теменной доли левого полушария (рис 1А: б), а также редкие эпилептические деятельности подбираются от остальной части электродов ЭГ (рис 1А: а, в, д, е и е) , когда пилокарпин вводят. Epileptiform ECoGs в основном регистрируются сразу после введения пилокарпина. Эти результаты принимаются с 8. Эти результаты указывают на успешное индуцирование фокальной ОДВТ у крыс после прямой инъекции низких доз пилокарпина в CEA.
В течение 5 мин, IP в300 проекция мг / кг пилокарпина вызывает серьезные холинергические воздействие на поведение, такие как пилоэрекции, слюнотечение, красные глаза, дрожа и автоматизмов лица. Тяжесть этих поведенческих признаков постепенно увеличивается , пока ЭГ обобщен захват не происходит (рис 1В, синяя коробка). SE также имеет место после генерализованной эпилепсией (рис 1B, красная коробка). Эти результаты принимаются с 13. Наши результаты свидетельствуют о том, что IP-инъекции 300 мг / кг пилокарпина является надежным методом для индукции ЭГ-документированную генерализованная эпилепсия и SE. Тем не менее, уровень выживаемости после развития SE составляет от 15% до 20%. PTZ-разжиганием модель эпилепсии у мышей используется для развития спонтанно и периодически генерализованная эпилепсия. PTZ в дозе 0,035 мг / г веса тела мыши является IP - впрыскивается в определенной точке ZT (например, начало темного периода, ZT13) каждый день, и каждая инъекция отделен интервалом в один день. Там нет ЭпилептиформныйECoGs найдены в темное время суток после 1 - й инъекции PTZ (рис 1С: а) или в течение следующего периода темноты, когда выходной день для инъекций (Рисунок 1С: б). Никаких существенных эпилептической активности не обнаружено после того, как 2 - й, 3 - й и 4 - й инъекции (данные не показаны здесь). Тем не менее, эпилептиформные ECoGs индуцируются после инъекции 5 - й PTZ (Рисунок 1C: C и D), а также спонтанно и периодически генерализованной эпилепсией (фиг.1С: е и а ').
Мы классифицировали бдительности состояния в бодрствовании, NREM сна и быстрого сна в соответствии с критериями, которые мы упоминали в протоколе. Бодрствование визуально забит рассинхронизованных ECoGs с малой амплитудой и высокой частотой. Значения плотности мощности в полосе частот дельта (0,5 - 4 Гц), как правило, больше, чем те, вполоса частот тета (6 - 9 Гц) во время бодрствования, а также более высокий частотные спектры (> 10 Гц) найдены. Бодрствование проявляет высокую амплитуду ЭМГ и много двигательной активности. Кроме того, корковое температура постепенно увеличивается , когда зоркость состояние переходит из любого NREM сна или REM - сна к бодрствованию (рисунок 2). NREM сон характеризуется синхронизированных ECoGs с высокой амплитудой и низкой частотой. Значения плотности мощности преобладают в полосе частот дельта. Амплитуда ЭМГ постепенно снижается, а не двигательная активность не проявляется во время NREM сна. Кортикальная температура снижается , когда зоркость состояние переходит из бодрствования в NREM сна (рисунок 2). Во время фазы быстрого сна, волна ECOG десинхронизирована, амплитуда уменьшается, преобладающий плотность мощности ЭЭГ происходит в пределах от частоты тета (6,0 - 9,0 Гц), это наблюдается самый низкий, стадийный подергивание тела ЭМГ активности, и коркового температура быстро возрастает(Рисунок 2).
Мы продемонстрировали различные эффекты EA на эпилептической активности, когда EA стимулирует акупунктурных Fengchi либо стимуляции высокой частоты (100 Гц) или низкочастотной стимуляции (10 Гц). На фигуре 3А, микроинъекции 0,5 мкл пилокарпин (2,4 мг / мкл) в левую CeA индуцирует фокальной ОДВТ, как уже упоминалось ранее (Б). Тем не менее, 100-Гц EA двусторонних акупунктурных Fengchi усугубляет пилокарпин индуцированных эпилептиформные ECoGs (C). Эти результаты адаптированы из 8. В отличие от этого , 10-Гц Э.А. двустороннего Fengchi подавляет пилокарпин-индуцированной эпилептиформные ECoGs (фигура 3В: C). Эти результаты адаптированы из 7. Администрация пилокарпина в левый CeA также подавляет NREM сон в течение светового периода 12-часовой свет: темнота цикла (рис 4А и 4Б). Снижение NREM сна во время афРЭБ часов темного периода в первую очередь из - за эффекта анестезии, и не является прямым следствием EA 15. Применение 100-Гц EA далее ухудшает подавление пилокарпин индуцированного NREM сна (фиг.4А). В отличие от этого , 10-Гц Э.А. двусторонних акупунктурных Fengchi увеличивает период NREM сна по себе является в темное время суток и блокирует пилокарпин-индуцированное сокращение NREM - сна в течение светового периода (фиг.4В). Эти результаты принимаются с 9.
Рисунок 1: Различные модели Эпилепсия у крыс и мышей. А показывает фокусное ОДВТ у крыс. B проясняет генерализованная эпилепсия с SE у крыс. C указывает на спонтанные и периодические эпилептиформные ECoGs. (А) (а), (б), (в), (г), (д) и (е) представляет ЕCOG сигналы, записанные от электродов, расположенных на левой фронтальной, левой теменной, затылочной левый, правый фронтальные, правой теменной и правой затылочной коры головного мозга, соответственно. (B) Стрелка указывает IP - инъекции пилокарпина. Серая коробка (а) демонстрирует базовые ECoGs, полученные до введения пилокарпина. Синяя коробка показывает эпилептиформные ECoGs генерализованной эпилепсии. Красная коробка (б) представляет собой SE. Сигналы ECOG, извлеченные из (а) и (б) показаны на стадии (а ') и (б'). (C) (а) представляет собой ECoGs , приобретенные после 1 - й инъекции PTZ и (б) представляет ECoGs записан на следующий день после 1 - го PTZ инъекции у мышей. Эпилептические действия происходят после инъекции 5 - й PTZ (с) и после него . Неизменные эпилептические ECoGs , которые происходят на следующий день после 5 - й инъекции PTZ приведены в (г). Неизменные эпилептические ECoGs , записанные через 5 дней после инъекции PTZ на 5 - й показаны в (е) , Цифра в нижней части (а ') представляет ECoGs, экстрагированных из красной коробки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Классификация Бдительности государств: бодрствования, сна NREM и REM сна. Бдительность состояния крыс классифицируют по параметрам от ECoGs, ЭГ спектров, ЭМГ, двигательной активности и коркового температуры. Бдительность состояния мышей характеризуются одними и теми же параметрами, за исключением коры головного мозга температура не применяется.
Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
pload / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Влияние 100-Гц и 10 Гц EA на эпилепсию. В (А), первый след ЭГ демонстрирует базовые ECoGs (а). Микроинъекция пилокарпина в левую CeA индуцирует фокальную ОДВТ (б). Применение 100-Гц EA в двусторонних акупунктурных Fengchi усугубляет эпилептиформные ECoGs (с). В (В), первый след ЭГ демонстрирует базовые ECoGs (а). Микроинъекции пилокарпина в левый CeA индуцирует фокальную ОДВТ (б). Применение 10-Гц EA в двусторонних акупунктурных Fengchi подавляет эпилептиформные ECoGs (с). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Влияние 100 Гц и 10 Гц EA на EpiLepsy индуцированных сна Перебои. (А) фокальной ОДВТ индуцированное микроинъекции пилокарпина в левый CeA уменьшает NREM сна в течение светового периода. 100 Гц EA дополнительно ухудшает нарушение сна эпилепсию-индуцированной. (B) Применение 10-Гц блоков EA эпилепсия-индуцированное сокращение NREM сна в течение светового периода. Кроме того, 10 Гц EA усиливает NREM сон в темное время суток. Значения представлены в виде среднего значения ± SEM. Черный круг представляет значения, полученные до того, как микроинъекции пилокарпин, открытый круг изображает данные, полученные после инъекции пилокарпина, и открытый треугольник показывает величины, полученные после того, как раздражителей EA. Черная полоса представляет собой темный период 12-ч свет: темнота цикла, а белая полоса изображает светлый период. * Представляет собой статистическую разницу между 100 Гц EA + пилокарпин группы и контроля (ANOVA, p <0,05) и # указывает на статистическую разностныхе между 10 Гц EA + пилокарпин группы и пилокарпина группы (ANOVA, р <0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выбор посильную эпилепсию животную модель имеет важное значение для каждой экспериментальной цели. Одна из наших целей состоит в том, чтобы выяснить влияние ЕА на эпилепсию подавления. EA является альтернативной медицины, которая может проявлять терапевтический эффект при эпилепсии и было документально подтверждено в древней китайской литературе. Тем не менее, существует недостаток научных доказательств, чтобы доказать это. Для того, чтобы определить влияние на EA эпилепсии, мы в первую очередь сосредоточены на воздействии на EA легкой фокальной эпилепсии, а не на тяжелых генерализованных приступов или SE. Наше предыдущее исследование использовало фокусного модель TLE у крыс , чтобы продемонстрировать эффект низкой частоты (10 Гц) и высокочастотных (100 Гц) EA двусторонних акупунктурных Fengchi на пилокарпина индуцированных координационными TLE и очаговых нарушения сна TLE-индуцированной 7- 9. Наши результаты свидетельствуют о том, что 10-Гц EA двусторонних акупунктурных Fengchi подавляет фокусного TLE и сна нарушения, в то время как 100-Гц EA обостряет как фокусное TLE и TLE-индуцированные нарушения сна. Другим примером может служить то демонстрации влияния глубокой стимуляции мозга на огнеупорной эпилепсии, особенно генерализованных приступов и SE. Мы определили , что одностороннее глубокая стимуляция мозга переднего ядра таламуса (ANT) с высокочастотными и низкой интенсивности токов успешно подавляет рецидивы генерализованной эпилепсией и продолжительность SE 13. Мы также разработали спонтанно и периодически генерализованная эпилепсия с использованием метода PTZ-разжигания у мышей. Это PTZ-разжиганием модель может широко применяться для исследований эпилепсией. Важным шагом для установления этих моделей эпилепсия является использование соответствующих доз. Микроинъекции больших количеств пилокарпина в CeA может развиться вторичная генерализованная эпилепсия. IP-введение более 300 мг / кг пилокарпин индуцирует генерализованная эпилепсия и SE; Тем не менее, большинство крыс не выжить после того, как SE разработан. Кроме того, дозы ниже 280 мг / кг не удалось успешно установить генерализованная эпилепсия и SE. Та же сиtuation происходит с PTZ-растопку модели. Большие дозы PTZ может привести к SE, но многие мыши не выживают. В отличие от этого, низкие дозы PTZ требуют большего количества инъекций установить спонтанно рецидивирующий эпилепсию.
Классификация различных состояний бдительности у крыс и мышей в первую очередь основано на особенностях полисомнографических, записанных от людей. Мы изменили протокол для того, чтобы проанализировать сон-бодрствование активность значениями регистрируемых от ЭГ, спектрального распределения, ЭМГ, двигательной активности и коркового температуры. Характеристики ЭГ, спектральное распределение, ЭМГ, двигательную активность, и кортикальной температуры, записанные от бодрствования и NREM сна аналогичны тем, которые приобретены у человека. Тем не менее, фаза быстрого сна иногда неоднозначным и трудно классифицировать у грызунов. Большая литература описывает парадоксальный сон у грызунов в соответствии с его ECoGs и ЭМГ. Полоса частот тета из ECoGs преобладает и тонус мышц ЭМГ является самым низким, когда крысы или мышамповторно во время парадоксального сна. В целях повышения доверия скоринг фазы быстрого сна, мы также записали двигательную активность и корковой температуры. Фазовые подергивание тела наблюдается и корковое температура быстро повышается, когда крысы войти в фазу быстрого сна. Двигательная активность и коркового температуры, в дополнение к ECoGs, спектральное распределение, и ЭМГ, повысить точность анализа парадоксального сна. Чем больше параметров, которые включены, тем более точные классификации могут быть сделаны.
Два основных момента всегда подвергались критике, когда исследователи выполняют вручную иглоукалывание или эксперименты EA. Первый вопрос заключается в том, как исследователи идентифицировать и подтвердить акупунктурных у крыс. Система меридианов и акупунктурных точек в организме человека хорошо известны, однако нет меридиан системы и Acupoint карта подтверждена у грызунов. Таким образом, локализация соответствующих акупунктурных у грызунов определяется в соответствии с относительной анатомической локализации. Например, Fengchi акупунктурных (GB 20)расположен в углублении между верхней частью Musculus Sternocleidomastoideus и Musculus трапециевидной в организме человека. Мы нашли соответствующий анатомического расположения у грызунов и далее подтвердили это путем измерения низкий импеданс кожи. Импедансе Acupoint ниже, чем у окружающей кожи. Второй вопрос заключается в том, как дозы акупунктуры контролируются в ходе эксперимента. Если ручной акупунктуры используется для эксперимента, манипулирование подергивание иглы должны быть выполнены одним исследователем таким же образом, для каждой манипуляции. Было бы легче контролировать дозу иглоукалывание, если ЕА применимо, так как EA обеспечивает последовательную частоту стимуляции и силы тока. Кроме того, в обезболивание, EA обладает большей эффективности , чем ручной акупунктуры 16. Тем не менее, руководство иглоукалывание и EA с низкочастотной и высокочастотной стимуляции , в то же Acupoint может активировать различные участки мозга 17, что может означать различный лежат в основеИНГ механизмы.
Таким образом, этот документ демонстрирует несколько химических индуцированных эпилептические модели у крыс и мышей, в том числе фокусного ВЭ, генерализованной эпилепсией, SE, и спонтанно и периодически генерализованной эпилепсией. Мы также установили традиционный и быстрый электрический-разжиганием эпилептический модели у крыс. Если читатели заинтересованы в электрической-растопку модели, пожалуйста, обратитесь в справочной литературе 4 и 5. Мы также обеспечиваем критерии для анализа сон-бодрствование активности у крыс и мышей. Для того, чтобы оценить влияние EA на эпилептической активности и сна, мы опишем, как локализовать связанные с акупунктурных у крыс и как выполнить иглоукалывание, и мы также приведем некоторые репрезентативные результаты, чтобы продемонстрировать влияние EA на эпилепсии и эпилептических индуцированных нарушения сна ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X. Predictors of sleepiness in epilepsy patients. Sleep. 20 (12), 1105-1110 (1997).
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W. Sleep and epilepsy. Semin Neurol. 22, 321-327 (2002).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
