Introduction
La epilepsia es un trastorno neurológico común en el que se producen convulsiones recurrentes durante toda la vida de un paciente. La mayoría de las recurrencias epilépticos pueden ser bien controlados por los fármacos antiepilépticos (FAE). Sin embargo, aproximadamente 30% de los pacientes epilépticos desarrollar epilepsia refractaria 1. causas de la epilepsia, trastornos del sueño, que pueden exacerbar aún más la recurrencia. La evidencia demuestra que la epilepsia puede perturbar el sueño, ya sea por la noche o puede causar excesiva somnolencia durante el día 2,3. Nuestros estudios previos indican además que la epilepsia se produce en el momento zeitgeber (ZT) 0, es decir, el inicio del período de luz a la luz: oscuridad ciclo, disminuye el sueño; este es mediada por la hormona liberadora de corticotropina (CRH), un factor homeostático. Epilepsia en ZT13 (el comienzo del periodo de oscuridad) aumenta la expresión de otro factor homeostático, la interleucina-1 (IL-1), lo que aumenta el sueño. Sueño ritmos circadianos se alteran cuando la epilepsia se produce en ZT6, el medio de laperíodo de luz 4,5. Por otra parte, los problemas de sueño exacerbar aún más la progresión y recurrencia de la epilepsia 6. Sobre la base de la evidencia mencionada, tratamos de revelar un método terapéutico óptimo para controlar simultáneamente la epilepsia y prevenir las alteraciones del sueño en pacientes con epilepsia. Hemos encontrado previamente que la electroacupuntura (EA) con una frecuencia de estimulación de 10 Hz, en el que se suministra una cierta cantidad de corriente en el punto de acupuntura través de una aguja de acero inoxidable, suprime con éxito electrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia y trastornos del sueño epilepsia inducida 7 . EA con una frecuencia de estimulación de 100 Hz se deteriora aún más las actividades de epilepsia y trastornos del sueño en ratas 8,9. Este experimento exitoso depende de tres factores: en primer lugar, un modelo animal de epilepsia factible; en segundo lugar, un método para la grabación de sueño y el análisis en roedores; y en tercer lugar, el funcionamiento exacto de la acupuntura y la precisión del punto de acupuntura Locations.
La epilepsia se ha clasificado en dos tipos principales: la epilepsia focal y epilepsia generalizada. Estamos interesados en la epilepsia focal del lóbulo temporal (TLE), la epilepsia generalizada, estado epiléptico (SE), y la recurrencia de la epilepsia generalizada espontánea. Por lo tanto, diferentes manipulaciones se aplican para crear modelos de epilepsia adecuados para nuestros experimentos. Para establecer TLE focal, una dosis baja de pilocarpina se administra en el núcleo central de la amígdala izquierda (CEA). Para verificar este modelo, seis electrodos ECoG se implantan en el frontal (F1 y F2), parietal (P1 y P2), y occipital (O1 y O2) lóbulos en ambos hemisferios izquierdo y derecho, y otros dos electrodos de referencia (R1 y R2) se coloca sobre el cerebelo en ambos hemisferios. Una guía microinyección cánula adicional se implanta quirúrgicamente en el izquierdo CEA (AP, 2,8 mm de bregma; ml, 4,2 mm; DV, 7,8 mm con respecto al bregma). Las coordenadas son una adaptación de la Paxinos y Watlas rata atson 10. Si el TLE focal se induce con éxito, sólo la grabación desde el electrodo sobre la corteza parietal izquierda (P1), que está cerca del CEA izquierda, debería adquirir las ECoGs epileptiformes dominantes, sin ECoGs epileptiformes significativos registrados a partir de los otros electrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) del pilocarpina en ratas inducen epilepsia generalizada y SE, pero esto puede ser fatal. Cinco inyecciones IP de pentilentetrazol (PTZ) con un intervalo de un día entre cada inyección inducen con éxito la epilepsia generalizada espontánea en ratones y también asegurar la supervivencia de los ratones. Dos electrodos ECoG alambre se implantan en la corteza frontal y parietal en los ratones para recibir señales de ECoG y para verificar la epilepsia de manera espontánea recurrente.
La polisomnografía (PSG) es un método integral para registrar los cambios fisiológicos que se producen durante el sueño, y se puede clasificar de manera objetiva el sueño en diferentes etapas del movimiento no rápido de los ojos (NREM) yrAPID movimiento de los ojos (REM) del sueño. PSG registra los parámetros de las funciones del cuerpo, incluyendo las ondas cerebrales (electroencefalograma, EEG), los movimientos oculares (electrooculogram, EOG), tonos de músculo esquelético (electromiograma, EMG), ritmos cardíacos (electrocardiograma, ECG), y los niveles de oxígeno en la sangre y los parámetros respiratorios. En ratas, registramos ECoGs, EMG, la temperatura cortical y la actividad locomotora de clasificar los estados de vigilancia en la vigilia, el sueño NREM y el sueño REM. El análisis del sueño en ratones se llevó a cabo utilizando ECoGs, EMG, y los resultados de la actividad locomotora. Las ratas se implantan quirúrgicamente con tres ECoG tornillo de electrodos en el frontal, parietal, y la corteza cerebelosa contralateral por cirugía estereotáxica. determinación posterior a la adquisición de los estados de vigilancia (vigilia, sueño NREM y sueño REM) se lleva a cabo de acuerdo con los parámetros obtenidos de los ECoGs, EMG, la temperatura del cerebro, y la actividad locomotora. criterios detallados para categorizar el comportamiento del animal en ratas y ratones se describen en tél protocolo.
Ambas ratas y ratones necesitan ser anestesiados con una dosis baja de Zoletil (25 mg / kg), que es la mitad de la dosis de los anestésicos normalmente administrados durante la cirugía estereotáxica, antes de realizar la acupuntura manual o EA. Esta dosis permite que los animales se despiertan de 30 a 35 minutos después de la inyección. Cualquiera de acupuntura manual o EA se lleva a cabo al comienzo del período de oscuridad, con un período constante de tiempo de 30 min, y cada animal se trata consecutivamente durante dos a tres días. Estimular las corrientes de EA son entregados en un punto de acupuntura particular a través de una aguja de acero inoxidable que se inserta en el punto de acupuntura. La corriente de estímulo es un tren de pulsos cuadrados bifásicos, en el que la duración del pulso es de 150 ms y la intensidad de estimulación es 1 mA. Si se utiliza una aguja seca para la acupuntura manual, la aguja insertada en los puntos de acupuntura se retorció 10 veces cada 5 min. La parte difícil de la acupuntura manual o EA es localizar los puntos de acupuntura en los roedores. el locación de los puntos de acupuntura en ratas o ratones es similar a su localización anatómica en los seres humanos. Por ejemplo, los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi se encuentran 3 mm de distancia de la línea media posterior sobre el cuello, entre las dos orejas, que es similar a su localización anatómica en humanos 11. Por otra parte, los puntos de acupuntura con baja impedancia en la piel se pueden confirmar aún más. acupuntura o EA farsa manipulación simulada es necesario que la acupuntura o experimentos de EA. La acupuntura simulada o EA farsa deben llevarse a cabo en un punto de acupuntura no se encuentra cerca del punto de acupuntura, por ejemplo, cerca de la axila 12.
Para investigar con éxito los efectos de la acupuntura o la EA sobre la epilepsia y los trastornos del sueño epilepsia inducida, los siguientes factores deben estar en su lugar: un posible modelo de epilepsia animal, el análisis preciso de ECoGs epileptiformes y la recurrencia de la epilepsia, un método para clasificar los estados de vigilancia y el funcionamiento exacto de la acupuntura o la EA en los roedores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los protocolos experimentales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad Nacional de Taiwán.
1. Cirugía estereotáxica para la implantación de electrodos ECoG, EMG electrodos, Brain termistor, y la Guía de inyección cánula
- Para las ratas (250-350 g, de 6 a 8 semanas de edad, las ratas Sprague-Dawley)
- Anestesiar las ratas por inyección ip con 50 mg / kg Zoletil. Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta después de pellizcar la pata trasera. Aplicar ungüento para los ojos, afeite la piel, y esterilizar la piel con una solución de povidona-yodo y 75% de etanol. Inyectar un antibiótico (penicilina G) para prevenir la infección.
- Preparar escalpelos, tijeras, pinzas, gasas, y la máquina de cauterio para la cirugía. Esterilizar engranaje quirúrgico y gasas por un autoclave y la cauterización por 75% de etanol.
- Coloque una barra de oído en el canal auditivo y montar la rata a la estereotaxia.
- Utilizandoun bisturí, crea un aproximado de 2 cm incisión en el cráneo a lo largo de una línea entre dos de las orejas, moviéndose en sentido caudal. Cortar las aletas de la piel con pinzas hemostáticas para exponer el cráneo y extraer el tejido sobre el cráneo con un bisturí.
- Perforar ocho orificios (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1, y R2), cada una de aproximadamente 0,7 mm de diámetro, sobre el cráneo con una herramienta rotativa. Tornillo de ocho electrodos ECoG sobre el frontal, parietal, occipital y los lóbulos y el cerebelo, tanto en los hemisferios derecho e izquierdo. Estos electrodos se utilizan para la detección de la epilepsia focal.
- Utilice las siguientes coordenadas para los electrodos de registro: frontal (F1 y F2): 2,0 mm anterior al bregma y 2,5 mm de la línea media, parietal (P1 y P2): -2.0 mm anterior al bregma y 3,0 mm de la línea media y occipital (O1 y O2): -5.5 mm anterior al bregma y 3,0 mm de la línea media.
- Coloque dos electrodos de referencia (R1 y R2) en el cerebelo (-11,0 mm anterior al bregma y 4,0 mm de la midlinordeste).
- En unos grupos separados de ratas, haga tres agujeros y el lugar dos electrodos de EEG de tornillo sobre el frontal derecho (F2) y lóbulos parietales (P2) de las cortezas con las mismas coordenadas, como se describe en el paso 1.1.5.1. Colocar un tercer electrodo EEG sobre el cerebelo izquierdo (R1), que sirve para conectar a tierra el animal y reducir los artefactos de señal. Estos electrodos se utilizan para confirmar epilepsia generalizada y el análisis de las etapas de vigilancia.
- Se separa la piel del cuello y los músculos e inserte dos electrodos de EMG en el músculo del cuello.
- Perforar otro agujero en el cráneo y colocar una cánula guía microinyección en la izquierda CEA (AP, 2,8 mm del bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm con respecto al bregma) en ratas. Las coordenadas son una adaptación de la rata atlas de Paxinos y Watson 10.
- Perforar un agujero más grande (con un diámetro de 1,6 mm) en el cráneo e insertar un calibrado termistor 30 kV en la superficie de la corteza parietal, que se consolidó después, a monitor la temperatura cortical en ratas.
- Utilice una gasa y cauterio para detener el sangrado cuando se produzca.
- Pase los cables con aislamiento de los electrodos ECoG y electrodos EMG a un pedestal y conectar el termistor a la correa de sujeción. Cimentar el pedestal y guiar la cánula al cráneo con acrílico dental.
- El tratamiento de la incisión por vía tópica con polisporina (bacitracina de zinc / sulfato de polimixina B) para prevenir la infección. Dar a los animales tanto el ibuprofeno y la penicilina G en el agua durante una semana después de la cirugía.
- Para los ratones (20 - 30 g, de 6 a 8 semanas de edad, ratones C57BL / C)
- Anestesiar a los ratones por inyección IP con 50 mg / kg Zoletil y confirmar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta después de pellizcar la pata trasera. Aplicar ungüento para los ojos. Después de afeitar el pelo, esterilizar la piel con una solución de povidona-yodo y 75% de etanol. Inyectar un antibiótico (penicilina G) para prevenir la infección.
- Coloque una barra de oído en el canal auditivo ymontar el ratón a la estereotaxia.
- El uso de un bisturí, hacer un aproximado de 1.5 cm incisión en el cráneo a lo largo de una línea entre los dos oídos, moviéndose en sentido caudal. Clip los colgajos de piel con pinzas hemostáticas para exponer el cráneo y eliminar el tejido sobre el cráneo con un bisturí.
- Meter dos agujeros en el cráneo con tijeras quirúrgicas y colocar dos electrodos ECoG alambre en el lóbulo frontal derecho (F2: +2,0 mm a bregma y 1,5 a la línea media) y el lóbulo parietal izquierdo (P1: -3,0 mm y -2,5 a bregma mm de la línea media).
- Se separa la piel del cuello y los músculos e inserte dos electrodos de EMG en el músculo del cuello.
- Conecte los cables con aislamiento de los electrodos ECoG alambres y electrodos EMG a los terminales hembra y un conector de 2,54 mm, y luego de cemento en el cráneo con acrílico dental.
- El tratamiento de la incisión por vía tópica con polisporina (bacitracina de zinc / sulfato de polimixina B) para prevenir la infección. Dar a los animales tanto el ibuprofeno y la penicilina G en agua durante un week después de la cirugía.
- Permitir que todos los animales se recuperen durante siete días antes de la iniciación de los experimentos.
- Casa ratas o ratones por separado, en jaulas de grabación individuales, en la sala aislada donde la temperatura se mantiene a 23 ± 1 ° C y la luz: oscuridad (L: D) el ritmo es controlado en un 12: ciclo de 12 h (40 W x 4 tubos de iluminación). Proporcionar alimentos y agua ad libitum.
- Conectar el ECoG, EMG, y el termistor a través de una correa de sujeción a los amplificadores de una semana después de la cirugía para iniciar las grabaciones.
2. Establecimiento de TLE Focal Epilepsia, SE, y espontáneamente recurrentes Epilepsia
- Para las ratas
- Administrar 0,5 l de pilocarpina (2,4 mg / l) en el CEA izquierdo a través de la cánula guía de inyección usando una bomba de microinyección. La velocidad de inyección debe fijarse en 0,2 l / min para inducir TLE focal.
- IP inyectar 300 mg / kg de pilocarpina para inducir epi generalizadaLepsy con recurrentes SE.
- Para los ratones
- IP administrar PTZ (0,035 mg / g de peso corporal del ratón) en un punto ZT particular, cada dos días. Cinco inyecciones consecutivas harán que el desarrollo de la epilepsia generalizada de forma espontánea y de forma recurrente.
- Por tanto en ratas y ratones
- Amplificar las señales de ECoG por 5.000 y el filtro de paso de banda de las analógicas entre 0,1 y 40 Hz.
- Utilice una placa A / D conversión A para convertir las señales analógicas ECoGs en señales digitales con una tasa de muestreo de 128 Hz.
- Utilice un software para la puntuación visual y analizar la aparición y la duración de la epilepsia. Medir la escala de tiempo con el fin de representar la duración.
- Definir ECoG epilepsia por la aparición de puntas epilépticas con amplitudes mayores de 2 mV y con una duración de más de 30 s 13.
3. Clasificación de Vigilancia Unidos
- Para las ratas
- Determinar los estados de vigilancia mediante el uso de los parámetros adquiridos de ECoGs, EMG, temperaturas del cerebro, y la locomoción a menos de 12 s episodio de grabación. Conectar el ECoG, EMG, y el termistor a través de una correa de sujeción a los amplificadores de una semana después de la cirugía para comenzar la grabación. Puntuación de los estados con un software hecho a medida de acuerdo a los pasos 3.1.5 - 3.1.7.
- Medir la actividad locomotriz utilizando un detector de movimiento por infrarrojos, integrar las señales de cada 1 s, y almacenar las señales.
- Medir la temperatura cortical y almacenar las señales.
- Clasificar los estados de vigilancia de acuerdo con nuestros criterios previamente definidos 14.
- Puntuación vigilia mediante el uso de las siguientes características: ECoGs de pequeña amplitud con espectros de alta frecuencia, mayor potencia delta (0,5 - 4,0 Hz), y menor consumo de energía theta (6,0 - 9,0 Hz); la actividad locomotora dominante; alta actividad EMG; y aumentando gradualmente la temperatura cortical.
- Puntuación sueño NREM mediante el uso de la followincaracterísticas: g-ondas delta ECoGs dominantes con grandes amplitudes, se redujo la actividad EMG, la reducción de la temperatura cortical, y ninguna actividad locomotora.
- Puntuación sueño REM mediante el uso de las siguientes características: disminución de la amplitud de ECoGs con la frecuencia dominante theta, de repente aumento de la temperatura cortical, la actividad EMG mínima y baja actividad locomotriz con contracciones nerviosas del cuerpo.
- Para los ratones
- Repetir la clasificación de los estados de vigilancia en los ratones como llevó a cabo en las ratas, excepto que no hay temperatura cortical grabado desde el termistor.
4. Rendimiento de la acupuntura manual y EA en ratas
- La rata es anestesiada para el protocolo de EA.
- Busque el punto de acupuntura por la anatomía y confirme la baja impedancia de la piel en el punto de acupuntura. La luz parpadea cuando se detecta la baja impedancia de la piel. Nota: los puntos de acupuntura Fengchi se encuentran a 3 mm de la línea media posterior seainterpolar las dos orejas, en el cuello.
- Insertar agujas de acero inoxidable en los puntos de acupuntura en una profundidad de 2 mm.
- Twitch las agujas insertadas 10 veces cada 5 min.
- El uso de un estimulador eléctrico funcional, entregar un tren de pulsos bifásicos (150-mu s de duración cada una) con una intensidad de 1 mA a los puntos de acupuntura a través de la aguja.
- Realizar una acupuntura falsa o simulada EA como control.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Existen diferentes modelos de rata y ratón para satisfacer las necesidades de los diferentes tipos de epilepsia. Para inducir la TLE focal, 0,5 l de pilocarpina se administra (2,4 mg / l) en el CEA izquierda. Los ECoGs epileptiformes predominantes se adquieren desde el electrodo de ECoG en el lóbulo parietal del hemisferio izquierdo (Figura 1A: b) se recogen, y las actividades epilépticos raras desde el resto de los electrodos ECoG (Figura 1A: a, c, d, e y f) cuando se administra la pilocarpina. ECoGs epileptiformes se registran principalmente inmediatamente después de la administración de pilocarpina. Estos resultados se adoptó a partir de 8. Estos resultados indican la inducción exitosa de TLE focal en ratas después de la inyección directa de pilocarpina en dosis bajas en el CEA.
Dentro de 5 minutos, la IP eninyección de 300 mg / kg de pilocarpina induce efectos colinérgicos graves en el comportamiento, tales como piloerección, salivación, enrojecimiento de los ojos, temblando, y automatismos faciales. La severidad de estos síntomas conductuales aumenta gradualmente hasta que se produce una convulsión generalizada ECoG (Figura 1B, caja azul). SE también se produce después de la epilepsia generalizada (Figura 1B, caja roja). Estos resultados se adoptó a partir de 13. Nuestros resultados sugieren que una inyección IP de 300 mg / kg de pilocarpina es un método fiable para inducir epilepsia generalizada documentada ECoG y SE. Sin embargo, la tasa de supervivencia después del desarrollo SE es de entre 15% y 20%. El modelo de PTZ-encendido de la epilepsia en ratones se utiliza para desarrollar epilepsia generalizada espontánea y recurrente. PTZ a una dosis de 0,035 mg / g de peso corporal del ratón es IP inyecta en un punto ZT particular (por ejemplo, el comienzo del periodo de oscuridad, ZT13) cada dos días, y cada inyección está separada por un intervalo de un día. No hay epileptiformeECoGs encontrados durante el periodo de oscuridad después de la inyección de 1 de PTZ (Figura 1C: a) o durante el siguiente periodo de oscuridad, cuando es un día libre para la inyección (Figura 1C: b). No hay actividad epiléptica significativa se encuentra después de la 2ª, 3ª y 4ª inyecciones (datos no mostrados aquí). Sin embargo, ECoGs epileptiformes se inducen después de la 5ª inyección de PTZ (Figura 1C: c y d), junto con epilepsia generalizada de forma espontánea y recurrente (Figura 1C: e y a ').
Se clasificaron los estados de vigilancia en la vigilia, el sueño NREM y sueño REM de acuerdo con los criterios que hemos mencionado en el protocolo. La vigilia se puntúa visualmente por ECoGs desincronizado con baja amplitud y alta frecuencia. Los valores de densidad de potencia en la banda de frecuencia delta (0,5-4 Hz) son generalmente mayores que los dela banda de frecuencia theta (6 - 9 Hz) durante la vigilia, y los espectros de frecuencia más alta (> 10 Hz) se encuentran. Vigilia exhibe una alta amplitud de EMG y un montón de actividad locomotora. Por otra parte, la temperatura cortical aumenta gradualmente cuando los tránsitos del estado de vigilancia o bien el sueño NREM o sueño REM a la vigilia (Figura 2). Sueño NREM se caracteriza por ECoGs sincronizados con gran amplitud y baja frecuencia. Los valores de densidad de potencia son dominantes en la banda de frecuencia delta. La amplitud EMG disminuye gradualmente, y ninguna actividad locomotora se exhibe durante el sueño NREM. La temperatura cortical disminuye cuando los tránsitos estatales de vigilancia de la vigilia al sueño NREM (Figura 2). Durante el sueño REM, la onda de ECoG está sincronizado, la amplitud se reduce, la densidad de potencia EEG predominante se produce dentro de la frecuencia theta (6,0 a 9,0 Hz), está se observa actividad EMG el más bajo, contracción fásica cuerpo, y la temperatura cortical aumenta rápidamente(Figura 2).
Hemos demostrado los distintos efectos de EA sobre la actividad epiléptica cuando EA estimula los puntos de acupuntura Fengchi ya sea con una estimulación de alta frecuencia (100 Hz) o una estimulación de baja frecuencia (10 Hz). En la Figura 3A, una microinyección de 0,5 l de pilocarpina (2,4 mg / l) en el CEA izquierda induce focal TLE, como se ha mencionado anteriormente (B). Sin embargo, 100-Hz EA de puntos de acupuntura bilaterales Fengchi exacerba los ECoGs epileptiformes inducidos por pilocarpina (C). Estos resultados son una adaptación de 8. En contraste, 10-Hz EA de Fengchi bilateral suprime los ECoGs epileptiformes inducidos por pilocarpina (Figura 3B: C). Estos resultados son una adaptación de 7. La administración de pilocarpina en el CEA izquierda también suprime el sueño NREM durante el período de luz del 12-h luz: oscuridad ciclo (Figura 4A y 4B). La reducción del sueño NREM durante la FAew horas del período oscuro es debido principalmente al efecto de la anestesia, y no es un efecto directo de la EA 15. La aplicación de 100 Hz-EA se deteriora aún más la supresión inducida por pilocarpina de sueño NREM (Figura 4A). Por el contrario, a 10 Hz EA de los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi aumenta el sueño NREM per se durante el periodo oscuro y bloquea la reducción inducida por pilocarpina del sueño NREM durante el período de luz (Figura 4B). Estos resultados se adoptó a partir de 9.
Figura 1: Diferentes modelos de epilepsia en ratas y ratones. Un demuestra la TLE focal en ratas. B aclara la epilepsia generalizada con SE en ratas. C indica los ECoGs epileptiformes espontáneas y recurrentes. (A) (a), (b), (c), (d), (e) y (f) representar la ECoG señales grabadas desde los electrodos colocados en el frontal izquierdo, izquierda parietal, occipital izquierdo, frontal derecho, parietal derecha, y la corteza occipital derecha, respectivamente. (B) La flecha indica la inyección IP de la pilocarpina. El cuadro gris (a) demuestra las ECoGs de referencia obtenidos antes de la inyección de pilocarpina. El cuadro azul muestra los ECoGs epileptiformes de epilepsia generalizada. El cuadro rojo (b) representa la SE. Las señales de ECoG extraídos a partir de (a) y (b) se muestran en (a ') y (b'). (C) (a) representa los ECoGs adquiridos después de la inyección de 1 de PTZ y (b) representa la ECoGs registraron el día después de la inyección de 1 st PTZ en ratones. Actividades epilépticos ocurren después de la inyección 5º PTZ (c) y después. Los ECoGs epilépticas recurrentes que se producen la inyección de PTZ día después de 5º se muestran en (d). Los ECoGs epilépticas recurrentes registrados 5 días después de la inyección de PTZ 5º se muestran en (e) . La figura en la parte inferior (a ') representa los ECoGs extraídos de la caja roja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Clasificación de Vigilancia Unidos: la vigilia, el sueño NREM y sueño REM. Los estados de vigilancia de las ratas se clasifican según los parámetros de los espectros, ECoGs ECoG, EMG, la actividad locomotora, y la temperatura cortical. Los estados de vigilancia de los ratones se caracterizan por los mismos parámetros, excepto la temperatura cortical no es aplicable.
Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
pload / 54896 / 54896fig3.jpg "/>
Figura 3: Los efectos de 100 Hz y EA-10 Hz sobre la epilepsia. En (A), la primera traza ECoG demuestra los ECoGs de línea de base (a). La microinyección de pilocarpina en el CEA izquierda induce TLE focal (b). Aplicación de EA 100 Hz en los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi exacerba los ECoGs epileptiformes (c). En (B), la primera traza ECoG demuestra los ECoGs de línea de base (a). La microinyección de la pilocarpina en el CEA izquierda induce TLE focal (b). La aplicación de EA-10 Hz en los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi suprime los ECoGs epileptiformes (c). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de 100 Hz y EA-10 Hz en EpiLas interrupciones del sueño inducido por Lepsy. (A) Focal TLE inducida por la microinyección de pilocarpina en el CEA izquierda reduce el sueño NREM durante el período de luz. 100 Hz-EA se deteriora aún más la alteración del sueño inducido por la epilepsia. (B) La aplicación de 10 Hz-EA bloques de la reducción de la epilepsia inducida por el sueño NREM durante el período de luz. Por otra parte, 10 Hz EA mejora el sueño NREM durante el período oscuro. Los valores se representan como la media ± SEM. El círculo negro representa los valores obtenidos antes de la microinyección de pilocarpina, el círculo abierto representa los datos adquiridos después de la inyección de pilocarpina, y el triángulo abierto demuestra los valores obtenidos después de estímulos EA. La barra de color negro representa el período oscuro de la de 12 h luz: oscuridad ciclo, y la barra blanca representa el período de luz. * Representa la diferencia estadística entre los 100 Hz + EA grupo de pilocarpina y el control (ANOVA, P <0,05) y # indica la estadística difference entre el 10-Hz EA + grupo pilocarpina y el grupo de pilocarpina (ANOVA, p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La elección de un modelo animal de epilepsia viable es esencial para cada propósito experimental. Uno de nuestros objetivos es dilucidar los efectos de la EA en la supresión de la epilepsia. EA es una medicina alternativa que puede exhibir efecto terapéutico en la epilepsia y ha sido documentado en la literatura china antigua. Sin embargo, hay una falta de evidencia científica para demostrarlo. Para determinar los efectos de la EA en la epilepsia, nos hemos centrado principalmente en los efectos de la EA en la epilepsia focal leve, en lugar de en convulsión generalizada severa o SE. Nuestro estudio anterior utilizó un modelo de epilepsia del lóbulo temporal focal en ratas para demostrar los efectos de baja frecuencia (10 Hz) y alta frecuencia (100 Hz) EA de los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi sobre focales TLE y focales interrupciones del sueño inducido por TLE inducidos por pilocarpina 7- 9. Nuestros resultados sugieren que 10-Hz EA de puntos de acupuntura bilaterales Fengchi suprime focal TLE y dormir interrupción, mientras que 100 Hz-EA exacerba tanto TLE focal y trastornos del sueño inducidos por el TLE. Otro ejemplo es tO demostrar los efectos de la estimulación cerebral profunda en la epilepsia refractaria, especialmente convulsión generalizada y SE. Se determinó que la estimulación cerebral profunda unilateral del núcleo anterior del tálamo (ANT) con corrientes de alta frecuencia y baja intensidad inhibe con éxito la recurrencia de epilepsia generalizada y la duración de SE 13. También hemos desarrollado de forma espontánea y recurrente epilepsia generalizada con el método PTZ-leña en ratones. Este modelo de PTZ-leña puede ser ampliamente aplicada a los estudios de epilepsia. El paso crítico para establecer estos modelos de epilepsia es el uso de las dosis apropiadas. A la microinyección de cantidades más grandes de la pilocarpina en el CEA puede desarrollar epilepsia generalizada secundaria. administración IP de más de 300 mg / kg de pilocarpina induce la epilepsia generalizada y SE; Sin embargo, la mayoría de las ratas no sobrevivieron después de la SE desarrollado. Además, las dosis inferiores a 280 mg / kg no se pudo establecer con éxito la epilepsia generalizada y SE. Este mismo situación ocurre con el modelo de PTZ-leña. Las dosis más grandes de PTZ pueden causar SE, pero muchos ratones no sobrevivir. En contraste, las dosis bajas de PTZ requieren más inyecciones para establecer la epilepsia de manera espontánea recurrente.
La clasificación de los diferentes estados de vigilancia en ratas y ratones se basa principalmente en las características de polisomnografía registrados de los humanos. Hemos modificado el protocolo con el fin de analizar la actividad de sueño-vigilia por los valores registrados a partir de ECoG, distribución espectral, EMG, la actividad locomotora, y la temperatura cortical. Las características de ECoG, distribución espectral, EMG, la actividad locomotora y la temperatura cortical registrados a partir de la vigilia y el sueño NREM son similares a los adquiridos de los humanos. Sin embargo, el sueño REM es a veces ambiguo y difícil de clasificar en los roedores. La mayoría de la literatura describe el sueño REM en los roedores de acuerdo a sus ECoGs y EMG. La banda de frecuencia theta de ECoGs es predominante y el tono muscular de EMG es más bajo cuando las ratas o ratones unare en el sueño REM. Con el fin de aumentar la confianza de sueño REM de puntuación, se registraron más actividad locomotora y la temperatura cortical. Fásica contracción corporal se observó cortical y la temperatura aumenta rápidamente cuando las ratas entran en el sueño REM. La actividad locomotora y la temperatura cortical, además de los ECoGs, distribución espectral, y EMG, mejorar la precisión para el análisis del sueño REM. Los más parámetros que se incluyen, las clasificaciones más precisas se pueden hacer.
Dos puntos principales siempre han sido criticados cuando los investigadores realizan la acupuntura manual o experimentos de EA. La primera cuestión es cómo los investigadores identificar y confirmar los puntos de acupuntura en ratas. El sistema de meridianos y puntos de acupuntura en los seres humanos están bien establecidos, sin embargo no existe un sistema del punto de acupuntura y meridianos mapa confirmado en los roedores. Por lo tanto, la localización de puntos de acupuntura correspondientes en los roedores se determina según la localización anatómica relativa. Por ejemplo, los puntos de acupuntura Fengchi (GB 20) sonsituado en la depresión entre la parte superior del esternocleidomastoideo y trapecio musculus musculus en los seres humanos. Encontramos la ubicación anatómica relacionada en roedores y posterior confirmó que mediante la medición de baja impedancia de la piel. La impedancia de un punto de acupuntura es menor que la de la piel circundante. La segunda cuestión es cómo se controlan las dosis de acupuntura durante el experimento. Si se utiliza la acupuntura manual para el experimento, la manipulación de la aguja espasmos debe ser realizada por el mismo investigador de la misma manera para cada manipulación. Sería más fácil para controlar la dosis de acupuntura si EA es aplicable, como EA asegura una frecuencia de estimulación constante y la intensidad de corriente. Por otra parte, en la analgesia, EA exhibe una mayor efectividad que la acupuntura manual de 16. Sin embargo, la acupuntura manual y EA con baja frecuencia y alta frecuencia de estimulación al mismo punto de acupuntura pueden activar diferentes regiones del cerebro 17, lo que puede implicar diferentes subyacening mecanismos.
En resumen, este trabajo demuestra varios modelos de epilepsia inducida químicamente en ratas y ratones, incluyendo TLE focal, la epilepsia generalizada, SE y epilepsia generalizada espontánea y recurrente. También hemos establecido el modelo de epilepsia-leña eléctrica tradicional y rápida en ratas. Si los lectores están interesados en el modelo de leña eléctrica, consulte Referencias 4 y 5. También proporcionamos los criterios para analizar la actividad de sueño-vigilia en ratas y ratones. Para evaluar el efecto de EA sobre la actividad epiléptica y dormir, se describe cómo localizar los puntos de acupuntura relacionados en ratas y cómo realizar la acupuntura, y también presentamos algunos resultados representativos para demostrar los efectos de la EA sobre la epilepsia y los trastornos del sueño epilepsia inducida .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
- Regesta, G., Tanganelli, P. Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies. Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).
- Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X.
- Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy. Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle. Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).
- Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats. Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).
- Bazil, C. W.
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions. J Biomed Sci. 22, 49 (2015).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy. BMC Complement Altern Med. 13, 290 (2013).
- Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats. J Biomed Sci. 20, 85 (2013).
- Paxinos, G., Watson, W. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition). , Academic Press. San Diego. (1998).
- Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains. Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).
- Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries. J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).
- Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats. Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).
- Chang, F. C., Opp, M. R. Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).
- Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209 (2011).
- Tsui, P., Leung, M. C. Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow. Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).
- Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI. Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).
