Introduction
L'epilessia è un disturbo neurologico comune in cui ricorrenti crisi epilettiche si verificano durante tutto la durata della vita di un paziente. La maggior parte delle recidive epilettiche possono essere ben controllati da farmaci anti-epilettici (DAE). Tuttavia, circa il 30% dei pazienti epilettici sviluppare epilessia refrattaria 1. cause Epilessia disturbi del sonno, che può esacerbare ulteriormente recidiva. L'evidenza dimostra che l'epilessia può o disturbare il sonno di notte o può causare eccessiva sonnolenza diurna 2,3. I nostri studi precedenti indicano inoltre che l'epilessia che si verificano al momento zeitgeber (ZT) 0, vale a dire, l'inizio del periodo di luce nella luce: ciclo di buio, diminuisce il sonno; questo è mediata da ormone di liberazione della corticotropina (CRH), un fattore omeostatico. Epilessia ZT13 (all'inizio del periodo buio) aumenta l'espressione di un altro fattore omeostatico, interleuchina-1 (IL-1), che aumenta il sonno. Sonno ritmi circadiani sono alterati quando si verifica l'epilessia a ZT6, al centro dellaperiodo di luce 4,5. D'altra parte, problemi di sonno aggravano ulteriormente la progressione e la recidiva di epilessia 6. Sulla base delle prove di cui sopra, cerchiamo di rivelare un metodo terapeutico ottimale per controllare contemporaneamente l'epilessia e prevenire interruzioni del sonno nei pazienti con epilessia. Abbiamo precedentemente trovato che elettroagopuntura (EA) con una frequenza di stimolazione 10 Hz, in cui una certa quantità di corrente viene erogata nel acupoint attraverso un ago di acciaio inossidabile, sopprime successo electrocorticogram (ECoG) attività epilettiche e disturbi del sonno epilessia indotta 7 . EA con una frequenza di stimolazione di 100 Hz si deteriora ulteriormente le attività epilettiche e interruzioni del sonno nei ratti 8,9. Questo esperimento di successo dipende da tre fattori: in primo luogo, un modello animale di epilessia fattibile; in secondo luogo, un metodo per la registrazione sonno e analisi roditori; e in terzo luogo, le prestazioni accurata di agopuntura e la precisione del punto terapeutico locations.
L'epilessia è stato classificato in due tipi principali: l'epilessia focale e epilessia generalizzata. Siamo interessati a focale epilessia del lobo temporale (TLE), epilessia generalizzata, stato epilettico (SE), e il ripetersi di epilessia generalizzata spontanea. Pertanto, diverse manipolazioni sono applicati per creare modelli epilettici adatti per i nostri esperimenti. Per stabilire TLE focale, una bassa dose di pilocarpina viene somministrato nel nucleo centrale di sinistra dell'amigdala (CEA). Per verificare questo modello, sei elettrodi ECOG sono impiantati sul frontale (F1 e F2), parietale (P1 e P2), e occipitale (O1 e O2) lobi in entrambe gli emisferi destro e sinistro, e altri due elettrodi di riferimento (R1 & R2) sono disposti sopra il cervelletto in entrambi gli emisferi. Un ulteriore cannula guida microiniezione viene impiantato chirurgicamente nella sinistra CeA (AP, 2,8 mm dal bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7.8 mm rispetto al bregma). Le coordinate sono adattati dal Paxinos e Watson ratto atlante 10. Se la focale TLE è indotta con successo, solo la registrazione dall'elettrodo sulla corteccia parietale sinistra (P1), che è vicino al CeA sinistra, dovrebbero acquisire le ECoGs epilettiformi dominanti, senza significativi ECoGs epilettiformi registrati dagli altri elettrodi ECOG. Intraperitoneale (IP) iniezioni di pilocarpina in ratti indurre generalizzata epilessia e SE, ma questo può essere fatale. Cinque iniezioni IP di pentylenetetrazol (PTZ) con un intervallo di un giorno tra ogni iniezione inducono successo epilessia generalizzata spontanea nei topi e anche garantire la sopravvivenza dei topi. Due elettrodi filo ECOG vengono impiantati nelle frontale e parietale nel topo per ricevere i segnali ECOG e per verificare l'epilessia spontaneamente ricorrenti.
La polisonnografia (PSG) è un metodo completo per registrare i cambiamenti fisiologici che si verificano durante il sonno, e può oggettivamente classificare il sonno in diverse fasi del movimento dei non-rapid eye (NREM) e Rmovimento degli occhi APID (REM) del sonno. PSG registra parametri delle funzioni del corpo, tra cui le onde cerebrali (elettroencefalogramma, EEG), i movimenti oculari (elettrooculogramma, EOG), toni muscolo scheletrico (elettromiografia, EMG), del ritmo cardiaco (elettrocardiogramma, ECG) e livelli di ossigeno nel sangue e parametri respiratori. Nei ratti, registriamo ECoGs, EMG, temperatura corticale, e l'attività locomotoria per classificare gli stati di vigilanza in veglia, sonno non-REM, e il sonno REM. analisi del sonno nei topi viene condotta utilizzando ECoGs, EMG, ed i risultati di attività locomotoria. I ratti sono impiantati chirurgicamente con tre vite ECoG elettrodi al frontale, parietale e corteccia cerebellare controlaterale per radiochirurgia stereotassica. determinazione post-acquisizione degli stati di vigilanza (veglia, sonno non-REM e il sonno REM) è condotta secondo i parametri acquisiti dai ECoGs, EMG, temperatura del cervello e l'attività locomotoria. I criteri dettagliati per classificare il comportamento dell'animale in entrambi i ratti e topi sono descritti in tegli protocollo.
Entrambi i ratti e topi devono essere anestetizzati con una bassa dose di Zoletil (25 mg / kg), che è la metà della dose di anestetici normalmente somministrati durante la chirurgia stereotassica, prima di eseguire l'agopuntura manuale o EA. Questo dosaggio permette animali di svegliarsi da 30 a 35 minuti dopo l'iniezione. Sia l'agopuntura manuale o EA viene eseguita all'inizio del periodo buio, con un periodo costante di tempo di 30 minuti, e ogni animale è consecutivamente trattati per due o tre giorni. Stimulating correnti EA vengono consegnati in un particolare punto terapeutico attraverso un ago di acciaio inossidabile che viene inserito nel punto terapeutico. La corrente di stimolo è un treno di impulsi quadrati bifasici, in cui la durata dell'impulso è di 150 ms e l'intensità di stimolazione è di 1 mA. Se un ago a secco è utilizzato per l'agopuntura manuale, l'ago inserito nei punti terapeutici si contrasse 10 volte ogni 5 minuti. La parte difficile di agopuntura manuale o EA è quello di localizzare i punti terapeutici nei roditori. il loczione di punti terapeutici in ratti o topi è simile alla loro localizzazione anatomica negli esseri umani. Ad esempio, gli agopunti bilaterali Fengchi si trovano 3 mm dalla linea mediana posteriore sul collo, tra le due orecchie, che è simile alla sua posizione anatomica nell'uomo 11. Inoltre, le agopunti con bassa impedenza sulla pelle possono essere ulteriormente confermato. Sham manipolazione agopuntura simulata o EA è necessario per agopuntura o esperimenti EA. Agopuntura sham o sham EA devono essere eseguiti in un non-punto terapeutico situato vicino al punto terapeutico, come ad esempio vicino al cavo ascellare 12.
Per indagare con successo gli effetti dell'agopuntura o EA su epilessia e interruzioni del sonno epilessia indotta, i seguenti fattori devono essere a posto: un modello fattibile epilettica animali, la precisa analisi di ECoGs epilettiformi e la ricorrenza di epilessia, un metodo per classificare gli stati di vigilanza , e le prestazioni accurata di agopuntura o EA nei roditori.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) del National Taiwan University.
1. radiochirurgia stereotassica per impiantare ECoG elettrodi, elettrodi EMG, Cervello termistore, e Guida Iniezione cannula
- Per ratti (250-350 g, da 6 a 8 settimane di età ratti Sprague-Dawley)
- Anestetizzare i topi mediante iniezione IP con 50 mg / kg Zoletil. Verificare la corretta profondità dell'anestesia osservando una mancanza di risposta dopo la presa della zampa posteriore. Applicare una pomata oculare, accorciare il pelo, e sterilizzare la pelle con una soluzione di iodio-povidone e il 75% di etanolo. Iniettare un antibiotico (penicillina G) per prevenire l'infezione.
- Preparare bisturi, forbici, pinze emostatiche, garze, e la macchina cauterizzazione per un intervento chirurgico. Sterilizzare attrezzi chirurgici e garze da una autoclave e la cauterizzazione del 75% di etanolo.
- Posizionare una barra orecchio nel condotto uditivo e montare il ratto al Stereotaxis.
- utilizzandoun bisturi, fare un approssimativo di 2 cm incisione mediana sul cranio lungo una linea tra due orecchie, spostando caudalmente. Agganciare i lembi cutanei con hemostats per esporre il cranio e rimuovere il tessuto sopra il cranio con un bisturi.
- Drill otto fori (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 e R2), ciascuna circa 0,7 mm di diametro, sul cranio con un utensile rotante. Vite otto elettrodi ECOG sui frontali, parietali e lobi occipitali e il cervelletto in entrambe gli emisferi destro e sinistro. Questi elettrodi sono utilizzati per la rilevazione epilessia focale.
- Utilizzare le seguenti coordinate per gli elettrodi di registrazione: frontale (F1 e F2): 2,0 millimetri anteriore al bregma e 2,5 millimetri dalla linea mediana, parietale (P1 e P2): -2.0 mm anteriori al bregma e 3,0 millimetri dalla linea mediana e occipitale (O1 e O2): -5.5 mm anteriore al bregma e 3,0 millimetri dalla linea mediana.
- Inserire due elettrodi di riferimento (R1 e R2) sopra il cervelletto (-11.0 mm anteriore al bregma e 4,0 millimetri dalla midliNE).
- In gruppi separati di ratti, trapano tre buchi e luogo due elettrodi EEG vite sopra il frontale destro (F2) e lobi parietali (P2) delle cortecce con le stesse coordinate come descritto al punto 1.1.5.1. Inserire un terzo elettrodo EEG sopra il cervelletto sinistra (R1), che serve a terra l'animale e ridurre artefatti del segnale. Questi elettrodi sono utilizzati per confermare l'epilessia generalizzata e analizzare le fasi di vigilanza.
- Separare la pelle del collo e dei muscoli e inserire due elettrodi EMG nel muscolo del collo.
- Praticare un altro foro sul cranio e inserire una cannula guida microiniezione nella sinistra CeA (AP 2,8 mm dal bregma, ML, 4,2 mm, DV, 7,8 millimetri rispetto al bregma) nei ratti. Le coordinate sono adattati dal Paxinos e Watson ratto atlante 10.
- Praticare un foro più grande (con un diametro di 1,6 mm) sul cranio e inserire un calibrato termistore 30 kV sulla superficie della corteccia parietale, che verrà cementato in seguito, per monitor la temperatura corticale in ratti.
- Utilizzare garze e cauterizzazione per arrestare l'emorragia quando si verifica.
- Disporre i cavi isolati dagli elettrodi ECOG ed elettrodi EMG ad un piedistallo e collegare il termistore alla cavezza. Cemento piedistallo e guidare la cannula al cranio con acrilico dentale.
- Trattare l'incisione per via topica con polysporin (bacitracina zinco / polimixina B solfato) per prevenire l'infezione. Dare gli animali sia ibuprofene e la penicillina G in acqua per una settimana dopo l'intervento chirurgico.
- Per i topi (20 - 30 g, da 6 a 8 settimane di età topi C57BL / C)
- Anestetizzare i topi mediante iniezione IP con 50 mg / kg Zoletil e confermare la corretta profondità dell'anestesia osservando una mancanza di risposta dopo la presa della zampa posteriore. Applicare una pomata oculare. Dopo la rasatura, sterilizzare la pelle con una soluzione di iodio-povidone e il 75% di etanolo. Iniettare un antibiotico (penicillina G) per prevenire l'infezione.
- Posizionare una barra orecchio nel condotto uditivo emontare il mouse per il Stereotaxis.
- Usando un bisturi, fare un approssimativo 1,5 cm linea mediana un'incisione sul cranio lungo una linea tra le due orecchie, lo spostamento caudale. Agganciare i lembi cutanei con hemostats per esporre il cranio e rimuovere il tessuto sopra il cranio con un bisturi.
- Poke due fori sul cranio con le forbici chirurgiche e posizionare due elettrodi filo ECOG sul lobo frontale destro (F2: +2,0 mm per bregma e 1,5 alla linea mediana) e sinistra del lobo parietale (P1: -3.0 mm a Bregma e -2.5 mm alla linea mediana).
- Separare la pelle del collo e dei muscoli e inserire due elettrodi EMG nel muscolo del collo.
- Collegare i conduttori isolati dagli elettrodi ECOG filo ed elettrodi EMG ai terminali femmina e un connettore 2,54 mm, e quindi il cemento al cranio con acrilico dentale.
- Trattare l'incisione per via topica con polysporin (bacitracina zinco / polimixina B solfato) per prevenire l'infezione. Dare gli animali sia ibuprofene e penicillina G in acqua per un week dopo l'intervento chirurgico.
- Consentire a tutti gli animali di recuperare per sette giorni prima dell'inizio degli esperimenti.
- Casa ratti o topi separatamente, in gabbie individuali di registrazione, nella stanza isolata dove la temperatura è mantenuta a 23 ± 1 ° C e la luce: buio (L: D) ritmo viene controllato in 12: ciclo di 12 h (40 W x 4 tubi di illuminazione). Fornire cibo e acqua ad libitum.
- Collegare il ECoG, EMG, e termistore attraverso una cordicella per gli amplificatori una settimana dopo l'intervento chirurgico per iniziare le registrazioni.
2. Istituzione di Focal TLE epilessia, SE, e spontaneamente ricorrente epilessia
- per i ratti
- Somministrare 0,5 ml di pilocarpina (2,4 mg / ml) nel CeA sinistro attraverso la cannula guida iniezione utilizzando una pompa microiniezione. Il tasso di iniezione deve essere fissato a 0,2 ml / min per indurre focale TLE.
- IP iniettare 300 mg / kg di pilocarpina per indurre epi generalizzatalessia con ricorrenti SE.
- per i topi
- IP amministrare PTZ (0,035 mg / g di peso corporeo del mouse) in un punto particolare ZT ogni altro giorno. Cinque iniezioni consecutive causerà lo sviluppo di epilessia spontaneamente e periodica generalizzata.
- Per entrambi i ratti e topi
- Amplificare i segnali ECOG da 5.000 e filtrare i passa-banda analogici tra 0,1 e 40 Hz.
- Utilizzare un A / D bordo di conversione per convertire i segnali ECoGs analogici in segnali digitali con una frequenza di campionamento di 128 Hz.
- Utilizzare un software per il punteggio visivo e analizzare l'inizio e la durata della epilessia. Misurare la scala temporale per rappresentare la durata.
- Definire ECoG epilessia dalla comparsa di picchi epilettici con ampiezze maggiori di 2 mV e con durate di più di 30 s 13.
3. Classificazione delle Vigilanza Uniti
- per i ratti
- Determinare gli stati di vigilanza utilizzando i parametri acquisiti da ECoGs, EMG, temperatura del cervello, e la locomozione all'interno di un 12-s episodio di registrazione. Collegare il ECoG, EMG e termistore attraverso una cordicella per gli amplificatori una settimana dopo l'intervento chirurgico per avviare la registrazione. Punteggio gli stati con un software su misura in base alle misure 3.1.5 - 3.1.7.
- Misurare le attività locomotorie utilizzando un rilevatore di movimento a infrarossi, integrare i segnali ogni 1 s, e memorizzare i segnali.
- Misurare la temperatura corticale e memorizzare i segnali.
- Classificare gli stati di vigilanza in base ai nostri criteri definiti in precedenza 14.
- Punteggio veglia base alle seguenti caratteristiche: ECoGs piccola ampiezza con spettri ad alta frequenza, maggiore potenza delta (0,5 - 4.0 Hz), e minore potenza theta (6.0 - 9,0 Hz); attività locomotoria dominante; alta attività EMG; e aumentando gradualmente la temperatura corticale.
- Punteggio sonno non-REM utilizzando il followinCaratteristiche g: delta-onda ECoGs dominanti con grandi ampiezze, è diminuito l'attività EMG, ridotta la temperatura corticale, e nessuna attività locomotoria.
- Punteggio sonno REM utilizzando le seguenti caratteristiche: ridotta ampiezza ECoGs con la frequenza dominante theta, all'improvviso aumento della temperatura corticale, l'attività EMG minima, e bassa attività locomotoria con contrazioni del corpo.
- per i topi
- Ripetere la classificazione degli stati di vigilanza nei topi, come condotti nel ratto, salvo non vi è alcuna temperatura corticale registrato dal termistore.
4. Prestazioni di agopuntura manuale e EA in ratti
- Il ratto è anestetizzato per il protocollo EA.
- Individuare il punto terapeutico per anatomia e confermare bassa impedenza pelle al punto terapeutico. La spia lampeggia quando rileva la bassa impedenza pelle. Nota: agopunti Fengchi si trova a 3 mm dalla linea mediana posteriore esseretra le due orecchie, sul collo.
- Inserire aghi in acciaio inox nelle punti terapeutici ad una profondità di 2 mm.
- Twitch gli aghi inseriti 10 volte ogni 5 minuti.
- Utilizzando uno stimolatore elettrico funzionale, fornire un treno di impulsi bifasici (durata 150 ms ciascuno) con una intensità di 1 mA per i punti terapeutici attraverso l'ago.
- Eseguire un agopuntura sham o sham EA come controllo.
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Representative Results
Ci sono diversi modelli di topo e ratto per soddisfare le esigenze dei diversi tipi di epilessia. Per indurre focale TLE, 0,5 ml di pilocarpina (2,4 mg / ml) viene somministrato in CeA sinistra. I ECoGs epilettiformi predominanti sono acquisiti dall'elettrodo ECoG sul lobo parietale dell'emisfero sinistro (Figura 1A: b), e attività epilettiche rare vengono prelevate dal resto degli elettrodi ECOG (Figura 1A: a, c, d, e e f) quando la pilocarpina viene somministrato. ECoGs epilettiformi sono principalmente registrati immediatamente dopo la somministrazione pilocarpina. Questi risultati sono adottati da 8. Questi risultati indicano l'induzione successo focale TLE in ratti dopo l'iniezione diretta di pilocarpina basso dosaggio nella CeA.
Entro 5 minuti, l'IPiniezione di 300 mg / kg pilocarpina induce gravi effetti colinergici sul comportamento, come ad esempio piloerezione, salivazione, occhi rossi, brividi, e automatismi per il viso. La gravità di questi segni comportamentali aumenta gradualmente fino a quando si verifica un sequestro ECoG generalizzata (Figura 1B, scatola blu). SE si verifica anche a seguito della epilessia generalizzata (Figura 1B, scatola rossa). Questi risultati sono adottati da 13. I nostri risultati suggeriscono che l'iniezione IP di 300 mg / kg pilocarpina è un metodo affidabile per indurre ECoG documentato epilessia generalizzata e SE. Tuttavia, il tasso di sopravvivenza dopo lo sviluppo SE è tra il 15% e il 20%. Il modello di PTZ-accendere di epilessia nei topi viene utilizzata per sviluppare l'epilessia spontaneamente e ricorrentemente generalizzata. PTZ alla dose di 0,035 mg / g di peso corporeo mouse è IP iniettato in un punto particolare ZT (ad esempio, l'inizio del periodo di buio, ZT13) ogni altro giorno, e ogni iniezione sono separati da un intervallo di un giorno. Non ci sono epileptiformECoGs riscontrate durante il periodo di buio dopo il 1 iniezione di PTZ (Figura 1C: a) o durante il successivo periodo di buio, quando si tratta di un giorno di riposo per l'iniezione (Figura 1C: b). No significativa attività epilettica si trova dopo il 2 °, 3 ° e 4 iniezioni Th (dati non mostrati qui). Tuttavia, ECoGs epilettiformi sono indotte dopo il 5 ° PTZ iniezione (Figura 1C: ced), oltre ad epilessia spontaneamente e ripetutamente generalizzata (Figura 1C: e e ').
Abbiamo classificato gli stati di vigilanza in veglia, sonno non-REM, e il sonno REM in base ai criteri di cui abbiamo parlato nel protocollo. Veglia è visivamente segnato da ECoGs desincronizzato con bassa ampiezza e alta frequenza. I valori di densità di potenza nella banda di frequenza delta (0,5 - 4 Hz) sono generalmente superiori a quelli ottenutila banda di frequenza theta (6-9 Hz) durante la veglia, e più alta spettri di frequenza (> 10 Hz) si trovano. Veglia presenta una elevata ampiezza di EMG e un sacco di attività locomotoria. Inoltre, la temperatura corticale aumenta gradualmente quando i transiti statali vigilanza sia da sonno NREM o sonno REM alla veglia (Figura 2). NREM sonno è caratterizzato da ECoGs sincronizzati con elevata ampiezza e bassa frequenza. I valori di densità di potenza sono dominanti nella banda di frequenza delta. L'ampiezza EMG gradualmente diminuisce, e nessuna attività locomotoria è esibito durante il sonno non-REM. Temperatura corticale diminuisce quando i transiti statali vigilanza dalla veglia al sonno NREM (Figura 2). Durante il sonno REM, l'onda ECoG viene disaccoppiato, l'ampiezza si riduce, la densità di potenza predominante EEG si verifica entro la frequenza theta (6,0-9,0 Hz), l'attività EMG è il più basso, fasica contrazione corpo si osserva, e la temperatura aumenta rapidamente corticale(Figura 2).
Abbiamo dimostrato gli effetti distinti di EA su attività epilettica quando EA stimola i punti terapeutici Fengchi sia con una stimolazione ad alta frequenza (100 Hz) o una stimolazione a bassa frequenza (10 Hz). Nella Figura 3A, una microiniezione di 0,5 ml di pilocarpina (2,4 mg / ml) nel CeA sinistro induce focale TLE, come menzionato in precedenza (B). Tuttavia, 100 Hz EA di punti terapeutici bilaterali Fengchi aggrava i ECoGs epilettiformi pilocarpina indotta (C). Questi risultati sono adattate da 8. Al contrario, 10 Hz EA di Fengchi bilaterale sopprime le ECoGs epilettiformi pilocarpina indotta (Figura 3B: C). Questi risultati sono adattate da 7. La somministrazione di pilocarpina nel CeA sinistra sopprime anche NREM sonno durante il periodo di luce della luce 12-h: ciclo scuro (Figura 4A e 4B). La riduzione del sonno non-REM durante afore EW del periodo buio è dovuto principalmente all'effetto di anestesia, e non è un effetto diretto della EA 15. Applicazione di 100 Hz EA peggiora ulteriormente la soppressione pilocarpina indotta di sonno non-REM (Figura 4A). Al contrario, a 10 Hz EA di punti terapeutici bilaterali Fengchi aumenta NREM sonno di per sé durante il periodo di buio e blocca la riduzione pilocarpina indotta di sonno non-REM durante il periodo di luce (Figura 4B). Questi risultati sono adottati dal 9.
Figura 1: Differenti modelli di epilessia nei ratti e topi. Un dimostra la focale TLE nei ratti. B chiarisce l'epilessia generalizzata con SE nei ratti. C indica i ECoGs epilettiformi spontanee e ricorrenti. (A) (a), (b), (c), (d), (e) e (f) rappresenta la Esegnali COG registrati dagli elettrodi posti sul frontale sinistra, parietale sinistra, occipitale sinistra, frontale destra, parietale destra, e cortecce occipitali destro, rispettivamente. (B) La freccia indica l'iniezione IP di pilocarpina. Il riquadro grigio (a) dimostra le ECoGs di base ottenute prima dell'iniezione pilocarpina. La scatola blu mostra i ECoGs epilettiformi di epilessia generalizzata. La scatola rossa (b) rappresenta la SE. I segnali ECOG estratti da (a) e (b) sono mostrati in (a ') e (b'). (C) (a) rappresenta le ECoGs acquisite dopo il 1 ° PTZ iniezione e (b) rappresenta le ECoGs registrate il giorno dopo il 1 ° PTZ iniezione nei topi. Attività epilettici si verificano dopo l'iniezione 5 ° PTZ (c) e dopo. I ECoGs epilettiche ricorrenti che si verificano il giorno dopo il 5 ° iniezione PTZ sono mostrati in (d). I ECoGs epilettiche ricorrenti registrate 5 giorni dopo l'iniezione PTZ 5 th sono mostrati in (e) . La figura in basso (un ') rappresenta le ECoGs estratte dalla scatola rossa. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Classificazione delle Vigilanza Uniti: veglia, sonno NREM e sonno REM. Gli stati di vigilanza di ratti sono classificati per i parametri delle ECoGs, ECoG spettri, EMG, attività locomotoria, e la temperatura corticale. Gli stati di vigilanza di topi sono caratterizzati dagli stessi parametri, tranne la temperatura corticale non è applicabile.
Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Gli effetti di 100 Hz e 10 Hz EA su epilessia. In (A), la prima traccia ECoG dimostra le ECoGs basali (a). Microiniezione di pilocarpina nel CeA sinistro induce focale TLE (b). Applicazione di 100 Hz EA in punti terapeutici bilaterali Fengchi aggrava i ECoGs epilettiformi (c). In (B), la prima traccia ECoG dimostra le ECoGs di base (a). La microiniezione di pilocarpina nel CeA sinistro induce focale TLE (b). L'applicazione di 10 Hz-EA in punti terapeutici bilaterali Fengchi sopprime le ECoGs epilettiformi (c). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Gli effetti di 100 Hz e 10 Hz EA su EpiInterruzioni del sonno lessia-indotta. (A) focale TLE indotta dalla microiniezione di pilocarpina nel CeA sinistra riduce NREM sonno durante il periodo di luce. 100-Hz EA si deteriora ulteriormente il disturbo del sonno epilessia indotta. (B) L'applicazione del 10-Hz blocchi EA riduzione epilessia indotta di sonno non-REM durante il periodo di luce. Inoltre, 10-Hz EA migliora NREM sonno durante il periodo di buio. I valori sono rappresentati come media ± SEM. Il cerchio nero rappresenta i valori ottenuti prima della microiniezione di pilocarpina, il cerchio aperto descrive i dati acquisiti dopo l'iniezione pilocarpina, e il triangolo aperto dimostra i valori ottenuti dopo stimoli EA. La barra nera rappresenta il periodo oscuro della luce 12-h: ciclo di buio, e la barra bianca rappresenta il periodo di luce. * Rappresenta la differenza statistica tra i 100 Hz EA + gruppo pilocarpina e controllo (ANOVA, P <0,05) e # indica il differenc statisticae tra 10 Hz EA + gruppo pilocarpina e il gruppo pilocarpina (ANOVA, p <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La scelta di un modello animale di epilessia fattibile è essenziale per ogni scopo sperimentale. Uno dei nostri obiettivi è quello di chiarire gli effetti di EA sulla soppressione epilessia. EA è una medicina alternativa che possono presentare effetti terapeutici in epilessia ed è stato documentato nell'antica letteratura cinese. Tuttavia, vi è una mancanza di prove scientifiche per dimostrarlo. Per determinare gli effetti di EA su epilessia, abbiamo principalmente concentrati sugli effetti della EA in lieve epilessia focale, piuttosto che sulla grave crisi generalizzata o SE. Il nostro precedente studio ha utilizzato un modello TLE focale nei ratti per dimostrare gli effetti di bassa frequenza (10 Hz) e alta frequenza (100 Hz) EA di punti terapeutici bilaterali Fengchi su pilocarpina indotta focali TLE e focali interruzioni del sonno TLE-indotta 7- 9. I nostri risultati suggeriscono che il 10-Hz EA di punti terapeutici bilaterali Fengchi sopprime focale TLE e dormire interruzioni, mentre 100 Hz EA aggrava sia focale TLE e disturbi del sonno TLE-indotte. Un altro esempio è to dimostrare gli effetti della stimolazione cerebrale profonda su epilessia refrattaria, il sequestro soprattutto generalizzata e SE. Abbiamo determinato che la stimolazione unilaterale cerebrale profonda del nucleo anteriore del talamo (ANT) con correnti ad alta frequenza e bassa intensità inibisce correttamente il ripetersi di epilessia generalizzata e la durata di SE 13. Abbiamo anche sviluppato spontaneamente e in modo ricorrente generalizzata epilessia con il metodo PTZ-accendere nei topi. Questo modello PTZ-accensione può essere ampiamente applicato a studi epilessia. Il passo fondamentale per la creazione di questi modelli di epilessia è l'uso di dosaggi appropriati. Un microiniezione di grandi quantità di pilocarpina nel CeA può sviluppare epilessia generalizzata secondaria. amministrazione IP superiore a 300 mg / kg pilocarpina induce epilessia generalizzata e SE; tuttavia, la maggior parte dei ratti non sono sopravvissuti dopo la SE ha sviluppato. Inoltre, dosi inferiori a 280 mg / kg non ha potuto stabilire con successo epilessia generalizzata e SE. Questo stesso situation accade con il modello PTZ-accendere. Dosi maggiori di PTZ possono causare SE, ma molti topi non sopravvivere. Al contrario, basse dosi di PTZ richiedono più iniezioni di stabilire l'epilessia spontaneamente ricorrenti.
La classificazione dei diversi stati di vigilanza in ratti e topi si basa principalmente sulle caratteristiche di polisonnografia registrati dagli esseri umani. Abbiamo modificato il protocollo, al fine di analizzare l'attività sonno-veglia dai valori registrati da ECoG, distribuzione spettrale, EMG, attività locomotoria, e la temperatura corticale. Le caratteristiche di ECoG, distribuzione spettrale, EMG, attività locomotoria e temperatura corticale registrati dalla veglia e sonno REM sono simili a quelli acquisiti da esseri umani. Tuttavia, il sonno REM è a volte ambigua e difficile da classificare nei roditori. La maggior parte della letteratura descrive il sonno REM nei roditori secondo i suoi ECoGs e EMG. La banda di frequenza theta di ECoGs è predominante e il tono muscolare di EMG è più basso quando i ratti o topi unnuovamente nel sonno REM. Al fine di aumentare la fiducia del sonno REM punteggio, abbiamo ulteriormente registrato l'attività locomotoria e la temperatura corticale. Fasica contrazione corpo è osservato e la temperatura corticale aumenta rapidamente quando i ratti entrano sonno REM. attività locomotoria e la temperatura corticale, oltre ai ECoGs, distribuzione spettrale, e EMG, migliorare la precisione per l'analisi del sonno REM. I più parametri che sono inclusi, le classificazioni più precise possono essere fatte.
Due punti principali sono sempre stati criticati quando i ricercatori eseguono l'agopuntura manuale o esperimenti EA. Il primo problema è come i ricercatori identificano e confermano i punti terapeutici nei ratti. Il sistema dei meridiani e agopunti negli esseri umani sono ben stabiliti, ma non esiste una mappa del sistema e dei punti di agopuntura meridiani confermata nei roditori. Pertanto, la localizzazione dei punti di agopuntura corrispondenti nei roditori è determinato in base alla posizione anatomica relativa. Ad esempio, agopunti Fengchi (GB 20) sonosituato nella depressione tra la parte superiore del sternocleidomastoideus musculus e il trapezio musculus nell'uomo. Abbiamo trovato la posizione anatomica correlata nei roditori e ulteriormente confermato che misurando bassa impedenza della pelle. L'impedenza di un punto terapeutico è inferiore a quella della pelle circostante. Il secondo problema è come le dosi di agopuntura sono controllati durante l'esperimento. Se l'agopuntura manuale viene utilizzata per l'esperimento, la manipolazione dell'ago spasmi deve essere eseguita dallo stesso ricercatore nello stesso modo per ogni manipolazione. Sarebbe più facile controllare la dose di agopuntura se EA è applicabile, come EA assicura una frequenza di stimolazione costante e intensità di corrente. Inoltre, in analgesia, EA espone più efficacia di agopuntura manuale 16. Tuttavia, l'agopuntura manuale e EA con bassa frequenza e la stimolazione ad alta frequenza allo stesso punto terapeutico possono attivare diverse regioni del cervello 17, che può implicare sottostanno alla diversaing meccanismi.
In sintesi, questo documento dimostra diversi modelli epilettici chimici indotti nel ratto e nel topo, tra cui TLE focale, epilessia generalizzata, SE, e l'epilessia spontaneamente e ricorrentemente generalizzata. Abbiamo anche stabilito il modello epilettico elettrico-accendere tradizionale e rapida nei ratti. Se i lettori sono interessati al modello elettrico-accendere, si prega di fare riferimento a Riferimenti 4 e 5. Inoltre forniamo i criteri per analizzare l'attività sonno-veglia in ratti e topi. Per valutare l'effetto di EA su attività epilettica e dormire, si descrive come localizzare i relativi punti terapeutici nei ratti e come eseguire l'agopuntura, e abbiamo anche presentare alcuni risultati rappresentativi per dimostrare gli effetti di EA su epilessia e interruzioni del sonno epilessia indotta .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
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