Introduction
Epilepsie ist eine häufige neurologische Erkrankung, bei der wiederkehrenden Anfällen während eines Patienten Lebensdauer auftreten. Die meisten epileptischen Rezidive können werden gut kontrollierte durch Antiepileptika (AEDs). Doch etwa 30% der Patienten mit Epilepsie entwickeln refraktärer Epilepsie 1. Epilepsie Ursachen Schlafstörungen, die weitere Wiederholung verschlimmern können. Der Nachweis zeigt , dass Epilepsie entweder Schlaf in der Nacht stören können oder übermäßige Tagesschläfrigkeit 2,3 verursachen kann. Unsere bisherigen Untersuchungen zeigen weiter , dass Epilepsie bei Zeitgeber Zeit auftritt (ZT) 0, dh der Beginn der Lichtperiode im Licht: Dunkel - Zyklus nimmt Schlaf; dies wird durch Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH), einen homöostatischen Faktor vermittelt. Epilepsie bei ZT13 (der Beginn der Dunkelperiode) erhöht die Expression eines anderen homöostatischen Faktor, Interleukin-1 (IL-1), die Schlaf erhöht. Schlaf-Tagesrhythmus verändert werden, wenn Epilepsie bei ZT6 auftritt, der Mitte desLichtperiode 4,5. Auf der anderen Seite, Schlafstörungen weiter die Progression und ein erneutes Auftreten von 6 Epilepsie verschlimmern. Auf der Grundlage der oben genannten Beweise, versuchen wir eine optimale therapeutische Methode, um gleichzeitig zu offenbaren Epilepsie kontrollieren und Schlaf Störungen bei Epilepsie-Patienten zu verhindern. Wir fanden zuvor , daß electroacupuncture (EA) mit einer 10-Hz Stimulationsfrequenz, bei dem eine bestimmte Menge an Strom in die acupoint durch eine Edelstahladel geliefert wird, erfolgreich unterdrückt Elektrokortikogramm (ECoG) epileptische Aktivitäten und Epilepsie-induzierter Schlafstörungen 7 . EA mit einer Stimulationsfrequenz von 100 Hz weiter verschlechtert epileptischen Aktivitäten und Schlaf Störungen bei Ratten 8,9. Dieses erfolgreiche Experiment hängt von drei Faktoren ab: erstens, eine machbare epileptischen Tiermodell; zweitens ein Verfahren zur Schlaf Aufzeichnung und Analyse in Nagetieren; und drittens die genaue Leistung der Akupunktur und die Genauigkeit der acupoint locations.
Epilepsie ist in zwei Haupttypen unterteilt: fokalen Epilepsie und generalisierter Epilepsie. Wir interessieren uns für fokale Temporallappen-Epilepsie (TLE), generalisierter Epilepsie, Status epilepticus (SE) und die Wiederholung der spontanen generalisierte Epilepsie. Daher werden verschiedene Manipulationen angewendet geeigneten epileptische Modelle für unsere Experimente erstellen. Herzustellen Brenn TLE, eine niedrige Dosis von Pilocarpin wird in den linken zentralen Kern der Amygdala (CEA) verabreicht. Um dieses Modell zu überprüfen, sechs ECoG Elektroden auf der frontalen (F1 & F2), parietalen (P1 & P2) implantiert und okzipitalen (O1 & O2) in den beiden Lappen der linken und rechten Hemisphären, und weitere zwei Referenzelektroden (R1 & R2) über die Kleinhirns in beiden Hemisphären angeordnet. Eine zusätzliche Mikroinjektionsführungskanüle wird operativ in die linke CeA implantiert (AP, 2,8 mm von Bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm, bezogen auf Bregma). Die Koordinaten werden von der Paxinos und W angepaßtATSON Ratte Atlas 10. Wenn die Brenn TLE erfolgreich induziert wird, wird nur die Aufzeichnung von der Elektrode auf der linken parietalen Kortex (P1), die in der Nähe der linken CeA ist, sollte die dominant epileptiforme ECoGs, ohne signifikante epileptiforme ECoGs erwerben von den anderen ECoG Elektroden aufgezeichnet. Intraperitoneale (IP) Injektionen von Pilocarpin in Ratten induzieren Epilepsie und SE verallgemeinert, aber dies kann tödlich sein. Fünf IP-Injektionen von pentylenetetrazol (PTZ) mit einem Ein-Tages-Intervall zwischen jeder Injektion erfolgreich spontane generalisierte Epilepsie bei Mäusen induzieren und auch dafür sorgen, das Überleben der Mäuse. Zwei Draht ECoG Elektroden werden in die frontalen und parietalen Kortex in den Mäusen implantiert erhalten ECoG Signale und spontan wiederkehrende Epilepsie zu überprüfen.
Polysomnographie (PSG) ist eine umfassende Methode physiologischen Veränderungen aufzuzeichnen, die während des Schlafes auftreten, und es kann objektiv Schlaf in verschiedene Stadien der nicht-schnelle Augenbewegung (NREM) und r klassifizierenapid Augenbewegung (REM) Schlaf. PSG zeichnet Parameter von Körperfunktionen, einschließlich der Gehirnwellen (Elektroenzephalogramm, EEG), Augenbewegungen (Elektrookulogramm, EOG), Skelettmuskel Töne (Elektromyogramm, EMG), Herzrhythmus (Elektrokardiogramm, EKG) und Sauerstoffgehalt im Blut und Atmungsparameter. Bei Ratten, wir ECoGs, EMGs, Rindentemperatur und Bewegungsaktivität aufzuzeichnen Wachsamkeit Zustände in Wachheit, NREM Schlaf und REM-Schlaf zu klassifizieren. Schlaf-Analyse bei Mäusen ist ECoGs, EMGs und Bewegungsaktivität Ergebnisse mit durchgeführt. Die Ratten werden chirurgisch mit drei ECoG Schraube Elektroden an der Stirn-, Scheitel- und kontralateralen Kleinhirns Rinden von stereotaktischen Operation implantiert. Nach der Akquisition Bestimmung der Wachsamkeit Staaten (Wachheit, NREM Schlaf und REM-Schlaf) durchgeführt wird entsprechend den Parametern aus den ECoGs erworben, EMG, Gehirntemperatur und der Bewegungsaktivität. Detaillierte Kriterien für das Verhalten des Tieres zu kategorisieren beiden bei Ratten und Mäuse werden in t beschriebener Protokoll.
Ratten und Mäuse müssen sich mit einer niedrigen Dosis von zoletil (25 mg / kg) anästhesiert werden, die normalerweise während der stereotaktischen Chirurgie verabreicht Hälfte der Dosis von Anästhetika ist, vor der manuellen Akupunktur oder EA durchführt. Diese Dosierung erlaubt Tiere 30 bis 35 Minuten nach der Injektion zu wecken. Entweder manuell Akupunktur oder EA wird zu Beginn der Dunkelperiode durchgeführt wird, mit einer konstanten Zeitdauer von 30 min, und jedes Tier nacheinander für zwei bis drei Tage behandelt. Stimulierender EA Ströme werden in einen bestimmten acupoint durch eine Edelstahl Nadel geliefert, die in die acupoint eingesetzt ist. Der Reizstrom ein Zug von zweiphasigen Rechteckimpulse ist, bei dem die Impulsdauer beträgt 150 ms und die Stimulationsintensität von 1 mA. Wenn eine trockene Nadel für die manuelle Akupunktur verwendet wird, die Nadel in die Akupunkturpunkte eingesetzt wird 10 mal zuckten alle 5 min. Der schwierige Teil der manuellen Akupunktur oder EA ist die Akupunkturpunkte bei Nagetieren zu lokalisieren. Die location von acupoints in Ratten oder Mäuse ähnelt in ihrer anatomischen Lage beim Menschen. Zum Beispiel werden die bilateralen Fengchi Akupunkte 3 mm entfernt von der hinteren Mittellinie an dem Hals zwischen den beiden Ohren befinden, die zu seiner anatomischen Lage beim Menschen 11 ähnlich ist. Darüber hinaus können die Akupunkturpunkte mit niedriger Impedanz auf der Haut weiter bestätigt werden. Sham-Akupunktur oder Schein-EA Manipulation ist für Akupunktur oder EA Experimente notwendig. Sham - Akupunktur oder Schein - EA sollte in der Nähe der acupoint, wie in der Nähe der Achselhöhle 12 befindet sich in einem nicht acupoint durchgeführt werden.
Um erfolgreich zu untersuchen, die Auswirkungen der Akupunktur oder EA auf Epilepsie und Epilepsie-induzierten Schlaf Störungen, müssen die folgenden Faktoren vorhanden sein: ein gangbarer epileptischen Tiermodell, die genaue Analyse von epilepsie ECoGs und das erneute Auftreten von Epilepsie, eine Methode, um Wachsamkeit Staaten klassifizieren und die genaue Leistung der Akupunktur oder EA bei Nagern.
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Protocol
Alle Versuchsprotokolle werden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der National Taiwan University genehmigt.
1. Stereotaktische Chirurgie zum Implantieren ECoG Elektroden, EMG-Elektroden, Gehirn Thermistoren und Injektions Leitkanüle
- Für Ratten (250-350 g, 6 bis 8 Wochen alte Sprague-Dawley Ratten)
- Anästhesieren die Ratten durch IP-Injektion mit 50 mg / kg zoletil. Bestätigen Sie die richtige Tiefe der Narkose durch eine fehlende Reaktion zu beobachten, nachdem die Hinterpfote Kneifen. Bewerben Augensalbe, rasieren Sie das Fell, und sterilisieren Sie die Haut mit Povidon-Jod-Lösung und 75% Ethanol. Injizieren eines Antibiotikums (Penicillin G), um eine Infektion zu verhindern.
- Bereiten Sie Skalpelle, Scheren, Hämostatika, Gazen und Kauter Maschine für die Chirurgie. Sterilisieren chirurgische Ausrüstung und Gazen durch einen Autoklaven und dem Kauter mit 75% Ethanol.
- Legen Sie eine Ohrleiste in den Gehörgang und montieren Sie die Ratte auf die Stereotaxie.
- Mitein Skalpell, entlang einer Linie zwischen zwei den Ohren auf dem Schädel eine ungefähre 2-cm Mittelschnitt machen, bewegen kaudal. Clip die Hautlappen mit hemostats den Schädel zu entlarven und das Gewebe über den Schädel zu entfernen mit einem Skalpell.
- Bohrer acht Löcher (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 und R2), die jeweils etwa 0,7 mm im Durchmesser, auf dem Schädel mit einem Rotationswerkzeug. Schrauben Sie acht ECoG Elektroden an den Stirn-, Scheitel- und Hinterhauptslappen und das Kleinhirn in der linken und rechten Hemisphäre. Diese Elektroden werden für fokale Epilepsie Erkennung.
- Verwenden Sie die folgenden Koordinaten für die Aufzeichnungselektroden: frontale (F1 und F2): +2,0 mm vor Bregma und 2,5 mm von der Mittellinie, parietalen (P1 und P2): -2,0 mm vor Bregma und 3,0 mm von der Mittellinie und Hinterhaupts (O1 und O2): -5,5 mm vor Bregma und 3,0 mm von der Mittellinie.
- Platzieren von zwei Referenzelektroden (R1 und R2) über dem Cerebellum (-11,0 mm ventral Bregma und 4,0 mm von der midline).
- In einem separaten Gruppen von Ratten, bohren drei Löcher und legen Sie zwei Schrauben EEG-Elektroden über die rechte frontale (F2) und Parietallappen (P2) der Rinden mit den gleichen Koordinaten wie in Schritt 1.1.5.1 beschrieben. Legen Sie eine dritte EEG-Elektrode über dem linken Cerebellum (R1), die das Tier an Masse dient und Signalartefakte zu reduzieren. Diese Elektroden werden verwendet für generalisierte Epilepsie bestätigt und Wachsamkeit Stadien zu analysieren.
- Trennen Sie die Haut am Hals und Muskel und legen Sie zwei EMG-Elektroden in die Nackenmuskulatur.
- Bohren Sie ein weiteres Loch auf dem Schädel und legen Sie eine Mikroinjektionsführungskanüle in die linke CeA (AP, 2,8 mm von Bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm, bezogen auf Bregma) bei Ratten. Die Koordinaten werden von der Paxinos und Watson Ratte Atlas 10 angepasst.
- Bohren Sie ein größeres Loch (mit einem Durchmesser von 1,6 mm) auf dem Schädel und legen Sie eine kalibrierte 30-kV-Thermistor auf der Oberfläche des parietalen Kortex, die später zementiert werden, um monitor die kortikale Temperatur bei Ratten.
- Verwenden Gaze und Kauter Blutungen zu stoppen, wenn sie auftritt.
- Verlegen Sie die isolierten Leitungen von den ECoG Elektroden und EMG-Elektroden auf einem Sockel und schließen Sie den Thermistor an den Haltegurt. Zementieren Sie den Sockel und Führungskanüle auf den Schädel mit Dentalacryl.
- Behandeln Sie den Einschnitt topisch mit Polysporin (Zink-Bacitracin / Polymyxin-B-Sulfat), um eine Infektion zu verhindern. Geben Sie die Tiere sowohl Ibuprofen und Penicillin G in Wasser für eine Woche nach der Operation.
- Für Mäuse (20 - 30 g, 6 bis 8 Wochen alte C57BL / C - Mäuse)
- Anesthetize die Mäuse durch IP-Injektion mit 50 mg / kg zoletil und bestätigen, nachdem die richtige Tiefe der Anästhesie durch eine fehlende Reaktion Beobachtung der Hinterpfote Kneifen. Bewerben Augensalbe. Nachdem das Fell rasiert, die Haut mit Povidon-Jod-Lösung und 75% Ethanol sterilisiert werden. Injizieren eines Antibiotikums (Penicillin G), um eine Infektion zu verhindern.
- Legen Sie eine Ohrleiste in den Gehörgang undmontieren Sie die Maus an die Stereotaxie.
- Mit einem Skalpell machen eine ungefähre 1,5 cm Mittelschnitt auf dem Schädel entlang einer Linie zwischen den beiden Ohren, bewegen kaudal. Clip die Hautlappen mit hemostats den Schädel zu entlarven und das Gewebe über den Schädel mit einem Skalpell entfernen.
- Stoßen zwei Löcher auf dem Schädel mit chirurgischen Schere und legen zwei Draht ECoG Elektroden auf der rechten Stirnlappen (F2: +2,0 mm bis Bregma und 1,5 auf der Mittellinie) und der linken Parietallappen (P1: -3,0 mm bis Bregma und -2,5 mm auf der Mittellinie).
- Trennen Sie die Haut am Hals und Muskel und legen Sie zwei EMG-Elektroden in die Nackenmuskulatur.
- Schließen Sie die isolierten Leitungen von den Draht ECoG Elektroden und EMG-Elektroden mit den weiblichen Anschlüssen und mit einem 2,54-mm-Stecker, und dann Zement auf den Schädel mit Dentalacryl.
- Behandeln Sie den Einschnitt topisch mit Polysporin (Zink-Bacitracin / Polymyxin-B-Sulfat), um eine Infektion zu verhindern. Geben Sie die Tiere sowohl Ibuprofen und Penicillin G in Wasser für ein week nach der Operation.
- Erlauben alle Tiere sieben Tage zu erholen, bevor die Einleitung der Experimente.
- Haus Ratten oder Mäuse separat, in einzelnen Aufnahmekäfigen, im isolierten Raum, wo die Temperatur bei 23 ± 1 ° C und dem Licht gehalten: dunkel (L: D) Rhythmus in einem 12 gesteuert: 12-h-Zyklus (40 W x 4 Röhren Beleuchtung). Geben Sie Nahrung und Wasser ad libitum.
- Schließen Sie das ECoG, EMG, und Thermistor durch einen Haltegurt an die Verstärker eine Woche nach der Operation, um die Aufnahmen zu starten.
2. Einrichtung von Focal TLE Epilepsie, SE, und Spontan Recurrent Epilepsie
- Für Ratten
- Administrieren 0,5 & mgr; l von Pilocarpin (2,4 mg / & mgr; l) in das linke CeA durch die Injektionsführungskanüle eine Mikroinjektionspumpe. Die Injektionsrate sollte bei 0,2 & mgr; l / min eingestellt werden fokale TLE zu induzieren.
- IP injizieren 300 mg / kg Pilocarpin verallgemeinerten epi zu induzierenLepsy mit rezidivierenden SE.
- Für Mäuse
- IP verwalten PTZ (0,035 mg / g Maus Körpergewicht) an einem bestimmten Punkt ZT jeden zweiten Tag. Fünf aufeinanderfolgende Injektionen wird die Entwicklung von spontan und wiederkehrend generalisierte Epilepsie verursachen.
- Für Ratten und Mäuse
- Amplify die ECoG Signale, die von 5000 und Filtern der analogen Bandpass zwischen 0,1 und 40 Hz.
- Verwenden Sie einen A / D-Board Umwandlung der analogen ECoGs Signale in digitale Signale mit einem 128-Hz-Abtastrate zu konvertieren.
- Verwenden Sie eine Software für die visuelle Scoring und analysieren den Beginn und die Dauer der Epilepsie. Messen Sie die Zeitskala, um die Dauer zu vertreten.
- Definieren ECoG Epilepsie durch das Auftreten von epileptischen Spikes mit Amplituden von mehr als 2 mV und mit einer Dauer von mehr als 30 s 13.
3. Klassifizierung der Vigilance Staaten
- Für Ratten
- Bestimmen Sie die Wachsamkeit Staaten durch die Parameter von ECoGs erworben verwenden, EMG, Gehirn Temperaturen und Fortbewegung innerhalb von 12 s Folge der Aufnahme. Schließen Sie das ECoG, EMG, und Thermistor durch einen Haltegurt an die Verstärker eine Woche nach der Operation, um die Aufnahme zu starten. Score die Zustände mit einer maßgeschneiderten Software gemäß den Schritten 3.1.5 - 3.1.7.
- Messen Sie Bewegungsaktivitäten einen Infrarot-Bewegungsmelder, integrieren die Signale alle 1 s, und speichern Sie die Signale.
- Messen Sie kortikalen Temperatur und speichern Sie die Signale.
- Klassifizieren Wachsamkeit Staaten nach unseren zuvor definierten Kriterien 14.
- Ergebnis Wachheit durch die folgenden Merkmale mit: kleiner Amplitude ECoGs mit Hochfrequenzspektren, höhere Delta Leistung (0,5 bis 4,0 Hz) und niedriger Theta-Leistung (6,0 bis 9,0 Hz); dominante Bewegungsaktivität; hohe EMG-Aktivität; und die schrittweise Erhöhung Rindentemperatur.
- Ergebnis NREM Schlaf durch die followin mitg Eigenschaften: Delta-Wellen-dominant ECoGs mit großen Amplituden, verringerte sich die EMG-Aktivität, reduzierte kortikale Temperatur und keine Bewegungsaktivität.
- Ergebnis REM-Schlaf durch die folgenden Eigenschaften mit: verminderte Amplitude von ECoGs mit dem dominanten Theta-Frequenz, plötzlich erhöhte kortikale Temperatur, minimale EMG-Aktivität und eine geringe Bewegungsaktivität mit Körper zuckt.
- Für Mäuse
- Wiederholen Sie die Klassifizierung der Wachsamkeit Zustände in den Mäusen wie bei den Ratten durchgeführt, außer es keine kortikalen Temperatur vom Thermistor aufgezeichnet ist.
4. Durchführung der manuellen Akupunktur und EA in Ratten
- Die Ratte wird für die EA-Protokoll anästhesiert.
- Suchen Sie die acupoint von Anatomie und bestätigen geringe Hautimpedanz am acupoint. Das Licht blinkt, wenn die geringe Hautimpedanz erkennen. Hinweis: Fengchi Akupunkte 3 mm von der hinteren Mittellinie angeordnet sind, werdenschen den beiden Ohren, am Hals.
- Einfügen Edelstahl Nadeln in die Akupunkturpunkte in einer Tiefe von 2 mm.
- Twitch die eingesetzten Nadeln 10 mal alle 5 min.
- Mit Hilfe eines funktionellen elektrischen Stimulator, liefern einen Zug von zweiphasigen Impulsen (150 & mgr; s Dauer jeder) mit einer Intensität von 1 mA an die acupoints durch die Nadel.
- Führen Sie eine Schein-Akupunktur oder Schein EA als Kontrolle.
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Representative Results
Es gibt verschiedene Ratten- und Mausmodellen die Bedürfnisse der verschiedenen Epilepsietypen gerecht zu werden. Zu induzieren fokale TLE, 0,5 & mgr; l von Pilocarpin (2,4 mg / & mgr; l) in das linke CeA verabreicht. Die vorherrschenden epileptiforme ECoGs sind aus der ECoG - Elektrode auf dem Scheitellappen der linken Hemisphäre (1A: b) erworben und seltene epileptische Aktivitäten werden aus dem Rest der ECoG - Elektroden (1A aufgenommen: a, c, d, e und f) wenn das Pilocarpin verabreicht. Epileptiforme ECoGs sind in erster Linie unmittelbar nach Pilocarpin Verabreichung aufgezeichnet. Diese Ergebnisse sind von 8 angenommen. Diese Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Induktion von fokalen TLE bei Ratten nach der direkten Injektion von niedrig dosiertem Pilocarpin in die CeA.
Innerhalb von 5 min, die IP inSpritz- von 300 mg / kg Pilocarpin induziert schwere cholinergen Auswirkungen auf das Verhalten, wie Piloerektion, Speicheln, rote Augen, Schüttelfrost, und Gesichts-Automatismen. Die Schwere dieser Verhaltens Zeichen allmählich zunimmt , bis ein ECoG generalisierten Anfall auftritt (Abbildung 1B, blauer Kasten). SE tritt auch im Anschluss an die generalisierte Epilepsie (Abbildung 1B, roter Kasten). Diese Ergebnisse sind von 13 angenommen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass eine IP-Injektion von 300 mg / kg Pilocarpin ist eine zuverlässige Methode ECoG dokumentierte generalisierte Epilepsie und SE zu induzieren. Allerdings ist die Überlebensrate nach SE Entwicklung zwischen 15% und 20%. Die PTZ-Anzündholz Modell von Epilepsie bei Mäusen verwendet, spontan und wiederkehrend generalisierte Epilepsie zu entwickeln. PTZ bei einer Dosis von 0,035 mg / g Maus Körpergewicht ist IP an einem bestimmten Punkt ZT injiziert (zB der Beginn der dunklen Zeit, ZT13) jeden zweiten Tag, und jeder Injektion durch einen eintägigen Intervall getrennt ist. Es gibt keine epilepsieECoGs während der dunklen Periode nach der 1. Injektion von PTZ gefunden (Abbildung 1C: a) oder während der folgenden dunklen Periode, wenn es sich um einen freien Tag für die Injektion (Abbildung 1C: b). Keine signifikante epileptische Aktivität wird nach der 2., 3., und 4. Injektionen (Daten hier nicht gezeigt) gefunden. Jedoch epileptiforme ECoGs werden nach der 5. PTZ - Injektion (1C: c und d) induziert wird , zusammen mit spontan und wiederkehrend generalisierte Epilepsie (1C: e und a ').
Wir stuften Wachsamkeit Staaten in Wachheit, NREM Schlaf und REM-Schlaf nach den Kriterien, die wir im Protokoll erwähnt. Wakefulness wird visuell bewertet durch desynchronisierte ECoGs mit niedriger Amplitude und hoher Frequenz. Die Leistungsdichtewerte in den Delta-Frequenzband (0,5-4 Hz) im allgemeinen größer als diejenigen indie Theta-Frequenzband (6 - 9 Hz) im Wachzustand, und Hochfrequenzspektren (> 10 Hz) gefunden. Wakefulness eine hohe Amplitude von EMG und viel Bewegungsaktivität. Außerdem kortikalen Temperatur steigt allmählich , wenn die Wachsamkeit Zustand geht entweder von Non - REM - Schlaf oder REM - Schlaf zu Wachheit (Abbildung 2). NREM Schlaf wird durch synchronisierte ECoGs mit hoher Amplitude und niedriger Frequenz aus. Die Leistungsdichte-Werte sind dominant in der Delta-Frequenzband. Die EMG-Amplitude allmählich ab, und keine Bewegungsaktivität während des Non-REM-Schlaf ausgestellt. Cortical Temperatur abnimmt , wenn die Wachsamkeit Zustand geht von Wachheit in NREM - Schlaf (Abbildung 2). Im REM-Schlaf ist die ECoG Welle desynchronisiert wird die Amplitude verringert, die vorherrschende EEG Leistungsdichte innerhalb des Frequenz theta auftritt (6,0-9,0 Hz), wird EMG-Aktivität der niedrigste ist phasischen Körper twitch beobachtet und Rindentemperatur schnell ansteigt(Abbildung 2).
Wir haben gezeigt, die unterschiedlichen Wirkungen von EA auf epileptische Aktivität, wenn die EA Fengchi Akupunkte entweder mit einer Hochfrequenz-Stimulation (100 Hz) oder eine niederfrequente Stimulation (10 Hz) stimuliert. In 3A eine Mikroinjektion von 0,5 & mgr; l von Pilocarpin (2,4 mg / & mgr; l) in das linke CeA induziert fokale TLE, wie zuvor (B) erwähnt. Jedoch verschärft 100-Hz EA bilateraler Fengchi acupoints die Pilocarpin-induzierten epileptiforme ECoGs (C). Diese Ergebnisse sind von 8 angepasst. Im Gegensatz dazu unterdrückt die 10-Hz EA bilateraler Fengchi die Pilocarpin-induzierten epileptiforme ECoGs (3B: C). Diese Ergebnisse sind von 7 angepasst. Die Verabreichung von Pilocarpin in die linke CeA unterdrückt auch Non - REM - Schlaf während der Lichtperiode des 12-h Licht: Dunkel - Zyklus (4A & 4B). Die Reduktion von NREM Schlaf während afew Stunden der Dunkelperiode ist auf die Wirkung der Anästhesie in erster Linie, und ist keine direkte Wirkung von EA 15. Applikation von 100-Hz EA verschlechtert weiter die Pilocarpin-induzierten Suppression von NREM - Schlaf (4A). Im Gegensatz dazu ist eine 10-Hz EA bilateraler Fengchi Akupunkte erhöht NREM Schlaf per se während der dunklen Periode und blockiert die Pilocarpin-induzierten Reduktion von Non - REM - Schlaf während der Lichtperiode (4B). Diese Ergebnisse werden von 9 angenommen.
Abbildung 1: Unterschiedliche Epilepsie Modelle bei Ratten und Mäusen. A zeigt die fokale TLE bei Ratten. B verdeutlicht die generalisierter Epilepsie mit SE bei Ratten. C zeigt die spontane und rezidivierende epileptische ECoGs. (A) (a), (b), (c), (d), (e) und (f) stellen die ECoG Signale von den auf der linken Seite frontal, links parietal, links occipital, rechts frontal, rechts parietalen und rechten Hinterhaupts cortices platziert Elektroden aufgezeichnet. (B) Der Pfeil gibt die IP - Injektion von Pilocarpin. Der graue Kasten (a) zeigt die Basis ECoGs vor dem Pilocarpin Injektion erhalten. Die blaue Box zeigt die epilepsie ECoGs von generalisierte Epilepsie. Die rote Box (b) stellt die SE. Die Signale ECoG extrahiert aus (a) und (b) in (a ') und (b') gezeigt ist. (C) (a) darstellt , die erworbenen ECoGs nach der 1. PTZ - Injektion und (b) stellt die ECoGs den Tag aufgezeichnet nach der 1. PTZ - Injektion in Mäusen. Epileptische Aktivitäten auftreten , nach der 5. PTZ - Injektion (c) und danach. Die wiederkehrenden epileptischen ECoGs , die am Tag nach der 5. PTZ Injektion auftreten , werden in (d) gezeigt. Die wiederkehrenden epileptischen ECoGs aufgezeichnet 5 Tage nach der 5. PTZ - Injektion sind gezeigt in (e) . Die Figur am Boden (a ') steht für die ECoGs aus der roten Box extrahiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Klassifizierung von Vigilance Staaten: Wachheit, NREM Schlaf und REM - Schlaf. Die Wachsamkeit Staaten von Ratten werden durch die Parameter aus den ECoGs, ECoG-Spektren, EMGs, Bewegungsaktivität, und kortikalen Temperatur eingestuft. Die Wachsamkeit Staaten von Mäusen werden durch die gleichen Parameter charakterisiert, außer kortikalen Temperatur nicht anwendbar ist.
Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3: Die Wirkung von 100 Hz und 10 Hz EA auf Epilepsie. In (A) zeigt die erste ECoG Spur die Basis ECoGs (a). Mikroinjektion von Pilocarpin in das linke CeA induziert fokale TLE (b). Die Anwendung der 100-Hz EA auf bilateraler Fengchi Akupunkte verschärft die epilepsie ECoGs (c). In (B) zeigt die erste ECoG Spur die Basis ECoGs (a). Die Mikroinjektion von Pilocarpin in das linke CeA induziert fokale TLE (b). Die Anwendung von 10-Hz EA auf bilateraler Fengchi Akupunkte unterdrückt die epilepsie ECoGs (c). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Die Wirkung von 100 Hz und 10 Hz EA auf EpiLepsy-induzierten Schlaf Störungen. (A) Focal TLE induziert durch die Mikroinjektion von Pilocarpin in die linke CeA reduziert NREM Schlaf während der Lichtperiode. 100-Hz EA weiter verschlechtert die Epilepsie bedingten Schlafstörungen. (B) Die Anwendung von 10-Hz EA blockiert die Epilepsie-induzierte Reduktion von Non - REM - Schlaf während der Lichtperiode. Darüber hinaus 10-Hz EA verbessert NREM Schlaf während der dunklen Periode. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Der schwarze Kreis stellt die erhaltenen Werte, bevor die Mikroinjektion von Pilocarpin, der offene Kreis die Daten nach der Pilocarpin Injektion erworben zeigt, und das offene Dreieck zeigt die nach EA Stimuli erhaltenen Werte. Der schwarze Balken repräsentiert die dunkle Zeit des 12-h Licht: Dunkel-Zyklus, und der weiße Balken zeigt die Lichtperiode. * Stellt den statistischen Unterschied zwischen dem 100-Hz EA + Pilocarpin-Gruppe und der Kontrolle (ANOVA, p <0,05) und # gibt die statistische difference zwischen dem 10-Hz EA + Pilocarpin-Gruppe und der Pilocarpin-Gruppe (ANOVA, p <0,05). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
eine machbare Epilepsie Tiermodell zu wählen, ist für jeden experimentellen Zweck unerlässlich. Eines unserer Ziele ist es, die Auswirkungen von EA auf Epilepsie Unterdrückung aufzuklären. EA ist eine alternative Medizin, die therapeutische Wirkung bei Epilepsie aufweisen kann und hat in der alten chinesischen Literatur dokumentiert. Allerdings gibt es einen Mangel an wissenschaftlichen Beweise, um es zu beweisen. Um die Auswirkungen von EA auf Epilepsie bestimmen, konzentrieren wir uns in erster Linie auf die Auswirkungen von EA auf milden fokalen Epilepsie, anstatt sich auf schwere generalisierten Anfall oder SE. Unsere früheren Studie verwendet , um eine fokale TLE Modell bei Ratten , die Auswirkungen von niederfrequenten (10 Hz) und Hochfrequenz (100 Hz) EA bilateraler Fengchi acupoints auf Pilocarpin-induzierten Brenn TLE und fokale TLE-induzierten Schlaf Störungen 7- zu demonstrieren 9. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass 10-Hz EA bilateraler Fengchi Akupunkte unterdrückt Brenn TLE und Schlafstörungen, während 100-Hz EA sowohl fokale TLE und TLE-induzierten Schlafstörungen verschärft. Ein weiteres Beispiel ist to die Auswirkungen der tiefen Hirnstimulation auf refraktärer Epilepsie, insbesondere generalisierten Anfall und SE demonstrieren. Wir stellten fest , dass einseitige tiefe Hirnstimulation des Nucleus anterior des Thalamus (ANT) mit hoher Frequenz und geringer Intensität Ströme erfolgreich das erneute Auftreten von generalisierten Epilepsie und die Dauer der SE 13 hemmt. Wir haben auch spontan entwickelt und wiederkehrend generalisierte Epilepsie die PTZ-Anzündholz Methode in Mäusen. Diese PTZ-Anzündholz Modell in großem Maße an Epilepsie Studien angewendet werden können. Der entscheidende Schritt, diese Epilepsie Modelle für die Einrichtung ist die Verwendung der geeigneten Dosierungen. Eine Mikroinjektion von größeren Mengen von Pilocarpin in die CeA kann sekundär generali Epilepsie zu entwickeln. IP Verabreichung von mehr als 300 mg / kg Pilocarpin induziert generalisierter Epilepsie und SE; Allerdings haben die meisten Ratten nicht überleben, nachdem die SE entwickelt. Darüber hinaus Dosen unter 280 mg / kg nicht erfolgreich generalisierter Epilepsie und SE etablieren konnten. Das gleiche situation geschieht mit dem PTZ-Anzündholz Modell. Größere Dosen von PTZ kann SE verursachen, aber viele Mäuse nicht überleben. Im Gegensatz dazu erfordern niedrige Dosen von PTZ mehr Injektionen spontan wiederkehrende Epilepsie zu etablieren.
Die Klassifizierung der verschiedenen Wachsamkeit Zustände bei Ratten und Mäusen auf Merkmale von Polysomnographie von Menschen aufgezeichnet basiert in erster Linie. Wir modifiziert, um das Protokoll, um Schlaf-Wach-Aktivität durch die Werte von ECoG, spektrale Verteilung, EMG, Bewegungsaktivität und kortikalen Temperatur aufgezeichnet zu analysieren. Die Merkmale der ECoG, spektralen Verteilung, EMG, die lokomotorische Aktivität und kortikalen Temperatur von Wachheit und NREM Schlaf aufgezeichnet sind ähnlich denen von Menschen gewonnen. Allerdings ist der REM-Schlaf manchmal mehrdeutig und schwierig bei Nagetieren zu klassifizieren. Die meisten Literatur beschreibt den REM-Schlaf bei Nagetieren nach seiner ECoGs und EMGs. Die Theta-Frequenzband von ECoGs vorherrschend ist und der Muskeltonus von EMG ist am geringsten, wenn Ratten oder Mäusen einwieder in den REM-Schlaf. Um das Vertrauen der Scoring-REM-Schlaf zu steigern, haben wir weiter die Bewegungsaktivität und Rindentemperatur aufgezeichnet. Phasic Körper zucken beobachtet und Rindentemperatur schnell ansteigt, wenn Ratten REM-Schlaf ein. Die lokomotorische Aktivität und kortikalen Temperatur, zusätzlich zu den ECoGs, spektralen Verteilung und EMGs, verbessern die Genauigkeit für die REM-Schlafanalyse. Je mehr Parameter, die enthalten sind, können die präziseren Klassifizierungen erfolgen.
Zwei Hauptpunkte haben immer kritisiert worden, als Forscher manuellen Akupunktur oder EA Experimente durchführen. Die erste Frage ist, wie Forscher identifizieren und die Akupunkturpunkte an Ratten bestätigen. Die Meridian-System und acupoints beim Menschen sind gut etabliert, jedoch gibt es keine Meridiansystem und acupoint Karte bei Nagern bestätigt. Daher wird die Lokalisierung der entsprechenden Akupunkturpunkte in Nagetieren, ermittelt nach der relativen anatomischen Lage. Zum Beispiel Fengchi Akupunkte (GB 20)in der Vertiefung zwischen dem oberen Teil des Musculus sternocleidomastoideus und dem musculus Trapezius beim Menschen befindet. Wir fanden die zugehörige anatomische Lage in Nagetieren und bestätigt es weiter durch eine geringe Hautimpedanz zu messen. Die Impedanz eines acupoint ist geringer als die der umgebenden Haut. Die zweite Frage ist, wie die Akupunktur Dosen während des Experiments gesteuert. Wenn die manuelle Akupunktur für das Experiment verwendet wird, sollte die Manipulation der Zuckungen Nadel durch den gleichen Forscher in der gleichen Weise für jede Manipulation durchgeführt werden. Es wäre einfacher, die Akupunktur Dosis steuern, wenn EA anwendbar ist, als EA eine konsistente Stimulationsfrequenz und Stromstärke gewährleistet. Weiterhin in Analgesie zeigt EA mehr Wirksamkeit als die manuelle Akupunktur 16. Allerdings manuelle Akupunktur und EA mit niederfrequenten und hochfrequenten Stimulation bei der gleichen acupoint aktivieren können unterschiedliche Gehirnregionen 17, die unterschiedliche Basiswertes verwendet implizierening Mechanismen.
Zusammenfassend zeigt dieses Papier mehrere chemisch-induzierten epileptischen Modelle bei Ratten und Mäusen, einschließlich fokale TLE, generalisierte Epilepsie, SE, und spontan und wiederkehrend generalisierte Epilepsie. Wir stellten auch die traditionelle und schnellen elektrischen Anzünden epileptischen Modell bei Ratten. Wenn der Leser interessieren sich für die elektrisch-Anzündholz Modell sind, finden Sie auf Referenzen 4 und 5. Wir stellen auch die Kriterien Schlaf-Wach-Aktivität bei Ratten und Mäusen zu analysieren. Um die Wirkung von EA auf epileptische Aktivität und Schlaf zu bewerten, beschreiben wir, wie die damit verbundenen acupoints in Ratten zu lokalisieren und wie die Akupunktur durchzuführen, und wir präsentieren auch einige repräsentative Ergebnisse, die Auswirkungen von EA auf Epilepsie und Epilepsie-induzierten Schlaf Störungen zu demonstrieren .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Zoletil | Virbac | 50 mg/kg i.p. | |
| pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503 | 300 mg/kg i.p.; 1.2 mg microinjection |
| PTZ | Sigma-Aldrich | P6500 | 0.035 mg/mouse |
| polysporin | Pfizer | ||
| Surgery | |||
| ECoG electrode | Plastics One | E363/20 | screw electrode for rats |
| Pedestal | Plastics One | MS363 | |
| Cannula | Plastics One | C315G/spc | |
| Thermistor | Omega Engineering | 44008 | |
| Dental acrylic | Tempron | ||
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Dural arms | |
| Recording equipments | |||
| ECoG amplifier | Colbourn Instruments | V75-01 | |
| A/D Board | National Instruments | NI PCI-6033E | |
| Infrared-based motion detectors | Biobserve GmbH | custom-made | |
| ICELUS | G-System | ||
| AxoScope 10 Software | Molecular Devices | ||
| Acupuncture needs | |||
| Stainless needles | Shanghai Yanglong Medical Articles Co. | 32 gauge x 1” | |
| Functions Electrical Stimulator | I.T.O., Japan | Trio 300 | |
| AcuPen | Lhasa OMS | Pointer Excel II |
References
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