Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54901
Automatic Translation
1, 1,2
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Summary

نقدم طريقة القائم على التصوير المناعي للتوطين المكاني والزماني لإرك نشط في C. تشريح ايليجانس الغدد التناسلية. بروتوكول صفها هنا يمكن تكييفها لرؤية أي إشارة أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، شريطة الضد كاشف مناسب هو متاح.

Abstract

إشارة الخلية الحفظ تطويريا transducing RTK-RAS-إرك المسار هو سلسلة مما يشير كيناز الهامة التي تسيطر على العديد من العمليات الخلوية والتنموية أساسا عن طريق تنشيط إرك، كيناز النهائية للمسار. تنظيم محكم من النشاط إرك ضروري للتطور الطبيعي والتوازن. النتائج إرك نشطة بشكل مفرط في انتشار الخلوي المفرط، في حين الدرقية إرك يسبب موت الخلايا. C. ايليجانس هو نظام نموذجي القوية التي ساعدت توصيف وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير المسار خلال التنمية. على وجه الخصوص، وطريقة RTK-RAS-إرك ضروري لC. ايليجانس تطوير سلالة الجرثومية، التي هي محور هذا الأسلوب. عن طريق الاجسام المضادة المحددة لشكل نشط، diphosphorylated من إرك (dpERK)، ونمط التعريب النمطية يمكن تصور داخل الخط الجرثومي. لأن هذا النمط هو مكانيا وزمانيا وسيطرواالطبعه، والقدرة على مقايسة بتكاثر dpERK مفيد لتحديد المنظمين من المسار الذي يؤثر على dpERK مدة إشارة والسعة والتنمية وبالتالي سلالة الجرثومية. نحن هنا لشرح كيفية تشريح بنجاح، وصمة عار، وdpERK الصورة داخل C. ايليجانس الغدد التناسلية. ويمكن تكييف هذه الطريقة لتوطين المكاني للأي إشارات أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، قدم الأجسام المضادة متوافق مع المناعي هو متاح.

Introduction

ومستقبلات التيروزين كيناز (RTK) -RAt اللحمي (RAS) -Extracellular إشارة ينظم كيناز (إرك) مسار التتابع إشارات خارج الخلية من خلال سلسلة كيناز الحفظ الذي ينتج في الفسفرة وتفعيل إرك 1-3. البروتينات إرك أعضاء في الموجه البرولين الحفظ سيرين / ثريونين MAP (Mitogen المنشط البروتين) عائلة كيناز، وتفعيلها مباشرة من قبل منظمة مجاهدي خلق عبر الفسفرة المزدوجة على ثريونين (T) والتيروزين (Y) من عزر TEY محفوظ. إرك نشط (المشار إليها باسم diphosphorylated إرك، أو dpERK) ثم ينظم العديد من العمليات الخلوية والتنموية من خلال الفسفرة للبطارية من ركائز المصب 1-3. وهكذا النشاط إرك غير طبيعي يؤدي إلى العديد من الخلايا والعيوب التنموية 4-7.

تنظيم صارم من النشاط إرك هو أمر حاسم لتنمية العادية: في أنظمة الثدييات الكثير من النشاط إرك يؤدي إلى الإفراط الرائدة انتشار الخليويإلى نمو أنكجنيك. النشاط القليل جدا يؤدي إلى موت الخلايا 4،6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات في مدة النشاط إرك يؤدي أيضا إلى نتائج مختلفة: في الخلايا PC12، وتفعيل إرك لمدة 30 دقيقة أو أقل الحث تكاثر الخلايا، ولكن تفعيل إرك لمدة 60 دقيقة أو أكثر الحث تمايز الخلايا العصبية 8،9. تنظيم محكم من النشاط إرك وبالتالي من الضروري بشكل واضح عن التطور الطبيعي والتوازن.

C. ايليجانس هي قوية، ومرن وراثيا نظام نموذجي لتشريح وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير مسار 3،10-15. بالنسبة لأنظمة الثدييات، والتي تحتوي على جينات متعددة لRAS وإرك، C. يحتوي ايليجانس جين واحد RAS (السماح-60) والجينات إرك واحد (MPK - 1)، مما يجعله نظاما وراثيا أكثر سطحي التي لتشريح وظيفة هذا المسار 3،10-14. وC. ايليجانس الخط الجرثومي هو في الأساس الأنبوب الذي يتكون من الإنقساميةالخلايا الجذعية في نهايته البعيدة والبويضات الناضجة في نهاية القريبة لها (الشكل 1) 16. الخلايا الجرثومية الشروع الانقسام الاختزالي فقط القريبة إلى منطقة الإنقسامية البعيدة، والتقدم من خلال الطور التمهيدي الموسع الانتصافي (طور التثخن)، وبعد ذلك البدء في تشكيل البويضات في المنطقة حلقة، تمر أخيرا بويضة النضوج في المنطقة القريبة 16.

وقد أظهرت الدراسات الجينية من مختبرات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، أن مسار RTK-RAS-إرك أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية في C. ايليجانس 12،13،15،17-19. على وجه التحديد، وجدنا أن الضوابط إرك وينسق لا يقل عن تسعة العمليات البيولوجية متميزة خلال تطوير سلالة الجرثومية، بدءا من مفاتيح التنموية مثل جرثومة خلية موت الخلايا المبرمج للخلية العمليات البيولوجية مثل 11،18 نمو البويضة. يشبه إلى حد كبير في أنظمة الثدييات، والكثير من النشاط إرك في C. ايليجانس النتائج سلالة الجرثومية في إنتاج البويضات صغيرة متعددة، في حين لى أيضانتائج النشاط ttle في واحدة بويضة كبيرة (11). وبالتالي تنظيم محكم من dpERK أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية الطبيعية. النموذج النشط من إرك، كما تصور من قبل الأجسام المضادة المحددة لdpERK، يعرض النمطية، ودينامية، النسقين نمط التعريب: dpERK مرتفعة خلال منتصف طور التثخن (المنطقة 1، الشكل 1)، وانخفاض في المنطقة حلقة وارتفاع مرة أخرى في ناضجة البويضات (المنطقة 2، الشكل 1). مؤخرا، وجدنا أن التغذية تعمل من خلال عامل النمو الذي يشبه الانسولين مستقبلات 1 (داف-2) لتنشيط إرك في المنطقة 1 12؛ وأظهر العمل قبل أن إشارة الحيوانات المنوية (عبر Ephrin مستقبلات التيروزين كيناز) ينشط إرك في المنطقة 2 13.

وبالنظر إلى أن وظائف إرك النشطة بمثابة مقاومة متغيرة في سلالة الجرثومية لتنظيم نمو البويضة، توطين المكاني والزماني، فضلا عن اتساع dpERK، هو المفتاح لفهم نتائج الإشارات العادية. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، والتغيرات فيتوطين النمطي للdpERK يمكن رصدها بسهولة والتنبؤات المستمدة من تأثير الاضطرابات البيئية أو الوراثية على النشاط إرك وبالتالي وظيفة. وهكذا، يعاير لdpERK يتيح فهم شامل لدورها خلال تطوير سلالة الجرثومية.

Protocol

بروتوكول الموصوفة هنا هو في المقام الأول لنظام نموذجي اللافقارية جيم ايليجانس، ويتبع جميع المبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها المؤسسة.

1. نفقة الحيوان

  1. الحفاظ على C. ايليجانس العمل الثقافات الأسهم على النيماتودا نمو متوسط 20،21 (NGM، انظر المواد الجدول) أجار المصنف مع E. القولونية OP50.
  2. الاحتفاظ بمخزونات دودة في درجات الحرارة بين 16 درجة مئوية و 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: زراعة الديدان في أعلى نتائج درجات الحرارة في أسرع معدل نمو، في كثير من الأحيان، وتطوير سلالة الجرثومية الشاذة وانخفاض أحجام الحضنة. بالإضافة إلى ذلك، سوف درجة حرارة المورثات الحساسة عرض الظواهر المختلفة عند درجات حرارة مختلفة.
  3. نقل الديدان لوحات NGM جديدة كل 2-3 أيام اعتمادا على معدل نموها وذلك للحفاظ على امدادات ثابتة من الديدان تتغذى جيدا.
    ملاحظة: للحصول على أي تجربة معينة تنطوي على مستويات dpERK، يجب أن لا يتم الحصول على الديدان من تجويع أو الحشدإد لوحة. الازدحام أو آثار المجاعة الأنسولين في اشارة الديدان 22، والانسولين مما يشير تنظم إرك 12 النشاط. وهكذا الديدان من لوحات جوعا أو مكتظة سوف يؤدي إلى أنماط تلطيخ المتغيرة والتي يصعب التكاثر.

2. تشريح الديدان الكبار عن الحصول على مبايض

  1. اختيار 100-150 WT (N2) أو النمط الجيني المطلوب من الديدان في هذه المرحلة التنموية المطلوبة والمحددة (L1، L2، L3، L4، والكبار، الخ.) في 100 ميكرولتر من العازلة M9 في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. ملء أنبوب microcentrifuge مع 900 ميكرولتر من العازلة M9 (انظر المواد الجدول). أنابيب الطرد المركزي في 1000 x ج في microcentrifuge لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة بلطف 900 ميكرولتر من المنطقة العازلة M9 وتجاهل. إزالة المنطقة العازلة تحت المجهر تشريح للتأكد من أن الديدان لا تتم إزالة الخطأ.
  4. كرر الخطوات من 2،2-2،3 مرتين أكثر مع M9 جديدة عازلة في كل مرة.وهذا يضمن أن أي البكتيريا التي تم ترحيلها مع الديدان يتم غسلها بشكل فعال بعيدا.
  5. بعد غسل النهائي إزالة 900 ميكرولتر من العازلة M9 من أنبوب وتجاهل.
  6. نقل 100 ميكرولتر من M9 عازلة المتبقية التي تحتوي على 100-150 الديدان مع طرف 200 ميكرولتر micropipette إلى أسفل الطبق ساعة الزجاج المسطح. تأكد من أن الرأس micropipette يتم قطع عند علامة 10 ميكرولتر قبل الاستخدام. لا قطع وغيض يؤدي إلى القص من الديدان.
  7. إضافة 1-3 ميكرولتر من 0.1 M الليفاميزول على طبق زجاج الساعات التي تحتوي على ديدان في المخزن M9. دوامة بلطف الليفاميزول وM9 لتمكين حتى الاختلاط حتى وقف الديدان تتحرك.
    ملاحظة: الأسهم الليفاميزول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. هنا، استخدام تركيز أعلى من 1-3 ملم مما وصفت في الأدب 23 من 0،2-،25 ملي من الليفاميزول من أجل الحصول على فقدان سريع التنقل في الحيوانات. إذا كانت الحيوانات سلخ حول للتر جداأونج في تعليق السائل، وأنماط الناتجة من dpERK في الغدد التناسلية يمكن أن يكون متغير (بسبب الإجهاد أو نقص التغذية أو كليهما). وقد تم تحقيق أنماط تلطيخ أكثر استنساخه مع 1-3 ملي الليفاميزول للتشريح.
  8. نعلق اثنين من 25 الإبر G لمدة 1 الحقن مل (حجم الحقنة لا يهم، وهو المقياس من الإبرة أمر بالغ الأهمية). موقف حقنة واحدة في كل يد (الشكل 2).
  9. تحت المجهر تشريح، وضع كل إبرة تحت وفوق كل دودة كما هو مبين في الشكل (2) ووضع خفض غرامة على دودة قرب لمبة البلعوم الثانية في حركة تشبه المقص. بعد قطع واحد في دودة الانتقال إلى الحيوان المقبل حتى يتم قطع جميع الحيوانات في الطبق مرة واحدة على الأقل.
    ملاحظة: يجب الأخذ بعين الاعتبار أن الخطوات 2،8-2،9 هي وقت حساس. تشريح جميع الديدان في طبق في أقل من خمس دقائق لنمط dpERK استنساخه. سيؤدي مرات تشريح أطول في تحول الخروج من إشارة dpERK، خصوصا في Zواحد 1. ضبط عدد من الديدان في كل جولة من تشريح (أي 50 الديدان مقابل 150) إذا لزم الأمر بالبقاء في الإطار الزمني المحدد.
    1. في حالة والغدد التناسلية مقذوف غير مرئية أثناء تشريح، لا تحاول خفض آخر في نفس الحيوان. عادة ما سوف القص فقط الحيوان ولا يؤدي إلى قذف من الغدد التناسلية. بدلا من ذلك، ننتقل إلى الحيوان المقبل. الديدان حيث ستظهر الغدد التناسلية لا قذف على هذا النحو على الشرائح التي سيتم إجراؤها في القسم 6 و يمكن تجاهلها أثناء التصوير
      ملاحظة: من خلال كل من تشريح وتجهيز الخطوات، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الغدد التناسلية سوف تظل مرتبطة الجسم / الذبيحة. لا قوة الغدد التناسلية والجسم بخلاف مع الإبرة. في كثير من الأحيان على المسيل للدموع الشاذة في أنسجة الغدد التناسلية في محاولة لقطع الغدد التناسلية من الجسم يمكن أن يؤدي في إشارة الضد زائفة. يمكن تجاهل الجسم / الذبيحة خلال الخطوات التصوير (المادة 6)، وفقط في الغدد التناسلية تصوير. بالإضافة إلى ذلك، سومetimes يمكن أن الخلايا المعوية أيضا أن تكون الضوابط الداخلية كما / الضوابط الجسدية للأجسام المضادة التي يعاير.

3. مناسل التثبيت

  1. بعد تشريح كاملة، إضافة 2 مل من 3٪ امتصاص العرق (PFA) مباشرة إلى الطبق ساعة زجاجية تحتوي على 100 ميكرولتر من M9 والحيوانات تشريح، وتغطي مع بارافيلم. وضع صحن زجاج الساعات التي يغطيها غطاء الدخان الكيميائية.
    تحذير: PFA هو مادة كيميائية خطرة. وبالتالي، يجب أن يتم تنفيذ التثبيت في غطاء الدخان الكيميائية.
  2. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  3. باستخدام المتاح ماصة 9 "باستير الزجاج إضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني 1X-T (انظر المواد الجدول) إلى صحن زجاج الساعات التي تحتوي على الحيوانات تشريح. ميكس من خلال الاعتماد على حل PFA وبرنامج تلفزيوني 1X-T مع الحيوانات تشريح في باستور ماصة، وإطلاق سراح بلطف مرة أخرى في طبق زجاج الساعات. لا دوامة الأنابيب خلال يغسل.
  4. باستخدام الصحائفش الزجاج ماصة باستير رسم 5 مل من السائل (التي تحتوي على ديدان تشريح، PFA وبرنامج تلفزيوني 1X-T) من صحن الزجاج ووتش في ماصة باستور ونقل المحتويات إلى 5 مل أنبوب زجاجي مخروطي جديدة.
  5. أنابيب الطرد المركزي المخروطية لمدة 30 ثانية في جهاز للطرد المركزي السريري في 1000 ز س. استخدام الزجاج الماصات باستور وأنابيب مخروطية كما الغدد التناسلية تشريح التمسك البلاستيك.
  6. إزالة والتخلص من طاف مع الحرص حتى لا تعكر صفو الحيوانات تشريح. إزالة السائل بعد كل غسل من أنبوب مخروطي الشكل تحت المجهر تشريح حتى لا تؤثر على الغدد التناسلية تشريح، وتقليل خسائرهم.
  7. باستخدام ماصة باستور جديدة، إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X-T للأنابيب المخروطية. أنابيب الطرد المركزي المخروطية في أجهزة الطرد المركزي السريري لمدة 30 ثانية في 1000 ز س. إزالة والتخلص من طاف مع الحرص حتى لا تعكر صفو الحيوانات تشريح.
  8. كرر الخطوة 3.7 ليصبح المجموع ثلاث مرات.
  9. باستخدام ماصة باستور جديدة، إضافة 2 مل من 100٪الميثانول للأنابيب، وبلطف مزيج الغدد التناسلية مع الميثانول عن طريق وضع في ماصة باستور. احتضان أنبوب في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
    ملاحظة: تشريح الغدد التناسلية يمكن تخزينها في الميثانول لمدة تصل إلى 2 أيام لdpERK تلطيخ. التخزين لأكثر من 2 أيام وتصل إلى 2 أسابيع متوافق مع تطبيقات تلوين الأجسام المضادة الأخرى، مثل مكافحة امين الأجسام المضادة، ولكن ليس مع الأجسام المضادة dpERK.
  10. بعد فترة حضانة المطلوب، كرر الخطوة 3.7 ليصبح المجموع ثلاث مرات من أجل غسل الغدد التناسلية. لا دوامة الأنابيب خلال يغسل. بعد غسل النهائي ترك 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X-T في أنبوب مخروطي 5 مل.
  11. باستخدام ماصة باستور جديدة نقل محتويات أنبوب زجاجي مخروطي إلى 1 أنبوب زجاجي مل الطازجة (6 ملم × 50 ملم). السماح للحيوانات تشريح لتسوية عن طريق الجاذبية ل5-10 دقيقة.
  12. باستخدام ماصة باستور الطازجة وتشريح تحت المجهر، وإزالة أكبر قدر من غسل ممكن من 1 مل أنابيب زجاجية خفة دمالحوت إزعاج الغدد التناسلية تشريح.

4. الحجب والابتدائية الجسم المضاد علاج

  1. إضافة 100 ميكرولتر من 30٪ مصل الماعز العادي (خ ع) المخفف في برنامج تلفزيوني 1X-T (انظر المواد الجدول) للحيوانات تشريح في 1 مل أنابيب زجاجية. 30٪ يخدم خ ع باعتبارها منطقة عازلة حظر. تغطية أنبوب مع بارافيلم لتجنب التبخر من السائل. في احتضان RT لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  2. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، وإزالة عازلة تمنع باستخدام ماصة باستور جديدة، وإزالة أكبر قدر من السائل ممكن. استخدام المجهر تشريح للتأكد من الغدد التناسلية ليست ضعت في ماصة باستور.
  3. تمييع الضد MAPKYT (انظر المواد الجدول المشار إليه في هذه الطريقة كما dpERK) في 1: 400 في 30٪ NGS. إعداد ما يكفي من تخفيف الأجسام المضادة لاستخدام 100 ميكرولتر في أنبوب. ويمكن تخزين غير المستخدمة، الأجسام المضادة المخفف في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من المخفف الأجسام المضادة لمكافحة dpERK ذلكlution إلى 1 أنابيب زجاجية مل تحتوي على الحيوانات تشريح. ختم الأنابيب مع بارافيلم. احتضان الأنابيب عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  5. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، إضافة 800 ميكرولتر من 1X PBST للأنابيب في RT.
  6. رسم العينة حتى في جديدة ماصة باستير الزجاج وإطلاق سراح بلطف لضمان أن الغدد التناسلية وعلقت بالتساوي في برنامج تلفزيوني 1X-T. السماح الغدد التناسلية تترسب في القاع مع الجاذبية. إزالة طاف. هذا يضمن أن الغدد التناسلية تشريح تغسل لكن لم تقع خسائر خلال هذه العملية.
  7. كرر الخطوات من 4،5-4،6 عن ما مجموعه ثلاثة يغسل. لا دوامة الأنابيب خلال يغسل. بعد غسل الثالث تأكد من إزالة والتخلص من أكبر قدر من طاف ممكن من دون إزعاج الحيوانات تشريح. ضمان أن يتم استخدام ماصة باستور جديدة في كل مرة.

5. الثانوية الضد العلاج

  1. خلال الأجسام المضادة الأولية يغسل تستعد للتخفيف عن الأجسام المضادة الثانوية. تمييع لمكافحة فأر حد ذاتهاالأجسام المضادة condary في 1: 500 في 30٪ NGS. كما هو الحال مع الأجسام المضادة الأولية، واستخدام 100 ميكرولتر في أنبوب. ويمكن تخزين الضد غير المستخدمة في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع.
  2. إضافة 100 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية إلى 1 أنابيب زجاجية مل تحتوي على الحيوانات تشريح. تغطية كل أنبوب مع parafilm، ثم لف الأنابيب في رقائق الألومنيوم للحفاظ على محتويات الأنبوب في الظلام. احتضان الأنابيب في RT لمدة 2 ساعة، أو بدلا من ذلك في 4 درجات مئوية خلال الليل.
  3. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، إضافة 800 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X-T للأنابيب وكرر الخطوات من 4،5-4،6 ليصبح المجموع ثلاث مرات. بعد غسل النهائي، وإزالة والتخلص من أكبر قدر من طاف وقت ممكن تحت المجهر تشريح باستخدام ماصة باستور جديدة.
  4. تحضير محلول دابي خلال يغسل عن الأجسام المضادة الثانوية. تمييع 1 ميكرولتر من دابي (من الأسهم 1،000x من 1 ملغ / مل المخزنة في -20 درجة مئوية) في- 1 مل من 1X PBST.
  5. إضافة 800 ميكرولتر من محلول دابي المخفف للأنابيب تحتوي علىالحيوانات تشريح. تغطية الفم من أنبوب مع بارافيلم، والتفاف كل أنبوب في رقائق الألومنيوم. في احتضان RT لمدة 20 دقيقة.
  6. بعد الحضانة مع دابي، وإزالة أكبر قدر من حل دابي ممكن مع ماصة باستور جديدة، تحت المجهر تشريح حتى لا تعكر صفو الحيوانات تشريح.
  7. إضافة 1 قطرة من تصاعد حل للأنابيب. التفاف كل أنبوب في رقائق الألومنيوم.
    ملاحظة: للحصول على تصور dpERK تلطيخ، يجب أن يتم تنظيمها الغدد التناسلية الملون للفحص المجهري على الفور. لتطبيقات الأجسام المضادة الأخرى مثل سيرين فسفرته 10 هيستون H3، الغدد التناسلية يمكن أن تظل في تزايد وسائل الإعلام لمدة تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية في الظلام.

6. تجميع الشرائح والتصوير

  1. وضع طبقة من الشريط مختبر بالطول، على القمة، واثنين من الشرائح الزجاجية المجهر (25 مم × 75 مم × 1 مم) كما رأينا في الشكل (3). وضع شريحة زجاجية نظيفة المجهر جديدة بين اثنين من الشرائح المسجلة.
    ملاحظة: سمكالشريط يساعد على توليد وسادة الاغاروز على الشريحة المتوسطة. سمك لوحة الاغاروز تساوي تقريبا إلى أن من الشريط، كما يخدم الشريط كفاصل لخلق لوحة الاغاروز.
  2. قطرة ~ 200 ميكرولتر من ذاب 2٪ الاغاروز (صنع في الماء المقطر) على شريحة المجهر في الوسط. المكان بسرعة شريحة نظيفة جديدة، عمودي، وعلى رأس من الاغاروز.
  3. السماح لل: تقوية الاغاروز (1-2 دقيقة).
  4. إزالة أكبر شريحة المجهر بلطف جدا، بحيث لوحة الاغاروز لا تدميرها. يمكن أن تبقى لوحة الاغاروز تعلق إما إلى أعلى أو أسفل الشريحة. لا يهم الذي حرك تبقى وحة agarose المرفقة، طالما أنه هو سطح أملس من الاغاروز.
  5. باستخدام ماصة باستور نقل الحيوانات تشريح على لوحة الاغاروز. إزالة أي السائل الزائد من الشريحة باستخدام ماصة باستور تحت المجهر تشريح.
  6. باستخدام الشعر رمش أو الشعرية مرسومة بدقة، ودفع الغدد التناسلية والامعاء لالطريق من بعضها البعض من أجل نشر الغدد التناسلية من على الشريحة.
  7. تغطية شريحة المجهر مع 24 ملم × 50 ملم حجم ساترة. الحرص على ضمان ساترة يخفض بلطف على الشريحة مع الحد الأدنى من فقاعات الهواء التي يجري تشكيلها بين ساترة والشريحة.
  8. تخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل في مربع الشريحة (مربع الشرائح مبهمة مع الشرائح الاستلقاء، ساترة لأعلى) للسماح السائل الزائد لتتبخر والغدد التناسلية لتصبح بالارض نوعا ما (بسبب ثقل ساترة على الغدد التناسلية). تسطيح طفيف في الغدد التناسلية يسمح للتصوير أفضل من أنبوب الغدد التناسلية جولة خلاف ذلك.
    1. مرة واحدة هي التي شنت ساترة، لا لممارسة الضغط على الجزء العلوي من ساترة مع الأصابع. في كثير من الأحيان وهذا يؤدي إلى تشويه الغدد التناسلية وفقدان إشارة dpERK.
    2. تتسطح الغدد التناسلية بين عشية وضحاها فقط لتصوير أكثر فعالية. الشرائح جاهزة ليتم عرضه في أقرب وقت يتم تجميعها. لالتقاط صور مباشرة واستيعاب بلطفالسائل الزائد بين ساترة والشريحة من الزوايا باستخدام الأنسجة مختبر نظيفة.
  9. بعد فترة ليلة وضحاها، وختم الشرائح وساترة مع الأظافر الشفاف المعطف الخفيف البولندية على الأركان الأربعة للساترة والحدود الشرائح. يضمن طلاء الأظافر / ساترة ختم أن ساترة لا يتحرك بينما التصوير، ويحمي ضد تدمير العينات.
  10. صورة الغدد التناسلية مع المجهر المركب في 63X. ولكن عدسة موضوعية والمجهر يمكن أن تختلف على أساس توافر المجاهر وتطبيق للمستخدم. لأن حجم الغدد التناسلية بأكملها من المنطقة التكاثري إلى البويضات أكبر من أن يتم القبض في صورة واحدة، يتم أخذ الصور والمونتاج مع حدود متداخلة كما هو مبين في الشكل (4) 11-14، 18.
    1. في كثير من الحالات، تحرير الذبيحة بعد التصوير النهائي والتجمع، طالما يتم إجراء أي تغييرات كبيرة في صورة الخط الجرثومي. مخزن رانه الصور الخام على طول صورة مجمعة لتمكين المقارنة بين 'قبل' التجمع / تحرير و'بعد' التجمع / تحرير الصور.
      ملاحظة: يجب أن لا يتم تغيير الصور المجهر من وجود إشارة أو التشبع أثناء تجميع المونتاج.

Representative Results

في WT الكبار الحيوانات خنثوي، هو تصور dpERK عادة في منطقة منتصف طور التثخن، المنطقة 1، وفي البويضات الأكثر نضجا من -1 من خلال -4 أو -5 (المنطقة 2). الاضطرابات في هذا النمط تفعيل تعكس تغييرات على مسار الإشارات. germlines الإناث لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لا تعرض تفعيل إرك في المنطقة 2، مع تفعيل ضعيف في المنطقة 1. وتتمثل هذه في الشكل (5).

شكل 1
الشكل 1: C. ايليجانس سلالة الجرثومية الصرف. التفاضلية التداخل المقابل (DIC) صورة لخنثى الكبار مع الذراع الغدد التناسلية على شكل حرف U واحد المذكورة مع خط أبيض. والغدد التناسلية خنثوي الكبار يحتوي على خلايا الإنقسامية في الطرف البعيد. الخلايا الإنقسامية تدخل الانقسام الاختزالي والتقدم من خلال الطور الأول الانتصافي (طور التثخن) النامية في maturالبويضات الإلكترونية في الغدد التناسلية الداني. المنطقة 1 والمنطقة 2 علامة توطين النمطي للdpERK في الغدد التناسلية خنثوي الكبار. الحجم: 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مظاهرة من المراكز إبرة أثناء تشريح اليسار: صورة لتشريح في العملية. الصحيح: مواقف إبرة مع الإشارة إلى دودة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): مظاهرة من إعداد الاغاروز الشرائح. (أ) وضع lengthwis الشريطالبريد عبر 2 شرائح المجهر نظيفة. ضع شريحة المجهر نظيفة جديدة بين الشرائح اثنين مع الشريط كما هو مبين. الشرائح الثلاث بجانب بعضها البعض طوليا. (ب) إضافة ذاب الاغاروز إلى الشريحة في الوسط. (C) ضع شريحة المجهر جديدة عمودي، وعلى رأسها، الشريحة المتوسطة، تحمل قطرة الاغاروز. ( D) السماح للالاغاروز ليصلب. (E) إزالة الشريحة العليا تاركة وراءها وحة agarose طدت. استخدام الشريحة السفلية مع لوحة الاغاروز لgermlines تصاعد تشريح والملون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: التصوير الشرائح كما المونتاج المونتاج من نوع سلالة الجرثومية البرية مع دابي (ر.المرجع) وقناة dpERK (القاع). الصور التي اتخذت في 63X مع تداخل الحدود، اتخذت المربعات البيضاء لوحة ألف وباء وصناديق خضراء لوحة باء وجيم ودابي وdpERK الصور لكل لوحة في وقت واحد في اثنين من قنوات مختلفة. يتم عرض صورة تجميعها في الشكل 5A. مقياس شريط: 20 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الديناميكي الزمنية / المكانية تفعيل إرك. (AC) WT (N2) الكبار (24 ساعة الماضية مرحلة منتصف L4 التنمية) germlines خنثى ملطخة الحمض النووي (B، دابي والأبيض) وdpERK (C، الحمراء). يتم تمييز إشارة dpERK في المنطقة 1 والمنطقة طور التثخن، والمنطقة 2، البويضات الناضجة. (DF)الضباب 2 (oz40) germlines الإناث (في 8 ساعة الماضية مرحلة منتصف L4 التنمية) ملطخة الحمض النووي (E، دابي) وdpERK (F). germlines الإناث الصغيرات عرض dpERK ضعيفة في المنطقة 1، وفي بويضة واحدة بطريقة مستقلة الحيوانات المنوية. المنطقة 2 هي الحيوانات المنوية يتوقف، وبالتالي غائبة في سلالة الجرثومية الإناث. مقياس شريط: 20 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

إرك النشط (dpERK) يتبع المكاني وديناميكية نمط التعريب النمطية في C. ايليجانس سلالة الجرثومية. هذه النمطية dpERK النمط المكاني (الشكل 5)، والسعة في مرحلة البلوغ C. ايليجانس الغدد التناسلية، ويمكن أن تكون مرتبطة بشكل فعال مع العديد من العمليات البيولوجية التي تنظم إرك. على سبيل المثال، عدم القدرة على تفعيل إرك في المنطقة 2 النتائج في الاعتقال في البويضات في الطور الأول من الانقسام الاختزالي، النمط الظاهري لوحظ في germlines الإناث التي لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لم تقم بتنشيط إرك في البويضات الناضجة (الشكل 5). التزاوج مع نتائج الذكور في تراكم الفعال للdpERK في المنطقة 2 في germlines الإناث 11،13، إلى جانب ظهور نضوج البويضة والإباضة. وهكذا تحليل الأنماط المكانية والزمانية تفعيل من dpERK على بعض الاضطرابات الوراثية (مثل تدخل الجيش الملكي النيبالي تثبيط الجين بوساطة) أو العلاجات الكيميائية يسمح لتحديد العوامل التي reguأواخر إشارات إرك والعمليات البيولوجية وبالتالي إرك التي تعتمد على. هذه التحليلات أيضا تمكين اكتشاف التفاعلات وراثية جديدة بين مسارات إشارات.

وعنق الزجاجة للأي تحليل التصوير القائم هو توافر الكواشف وظيفية مثل الأجسام المضادة التي تخص التطبيق. في حالة وجود مثل هذا كاشف ثم طرق مثل تلك المذكورة أعلاه يمكن أن تتكيف بسهولة لتحليل نمط التعريب لأي بروتين من الفائدة. وبالتالي يحد من الطلب من قبل توافر الأجسام المضادة عمل. بالإضافة إلى ذلك، لأن أسلوب يصف تشريح وتلطيخ في وقت تنموي معين، لا يمكننا إلا التقاط المعلومات في إطار زمني واحد، ولا تسليط الضوء على ديناميات أو تنظيم البروتين في الوقت الحقيقي أو معدل دوران البروتين.

ويتم تكييف الطريقة الموصوفة أعلاه من فرانسيس وآخرون. 23، والذي يختلف من سيدو ودان مethod 24 البثق الغدد التناسلية وتلوين الأجسام المضادة. وسوف يطلق على الأسلوب على أساس فرانسيس وآخرون. "طريقة تعليق" وطريقة سيدو ودان يسمى "تجميد تكسير طريقة" للمقارنة. وكانت طريقة تعليق فعالة جدا في أيدينا للحصول على أنماط توطين استنساخه من الجزيئات مما يشير مثل dpERK، التي هي بطبيعتها أكثر حساسية لظروف معالجة قاسية. في حالة dpERK التعريب، في تجربتنا، والإشارة في منطقة 1 غير قابل للكشف عمليا مع أسلوب تجميد تكسير. بالإضافة إلى ذلك، عينة التجفيف، والتي يمكن أن تحدث في كثير من الأحيان مع طريقة التجميد تكسير، والنتائج في إشارات الأجسام المضادة زائفة. طريقة تعليق يقلل عينة التجفيف، حيث يتم تعليق الغدد التناسلية في السائل طوال العملية. نجد أيضا أن الطريقة تعليق مفيد لتصوير متعددة الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة. على سبيل المثال، إذا كان اثنان المورثات، مثل المنحرفين مقابلالإناث إلى أن مباشرة مقارنة لdpERK التوطين، والمورثات اثنين يمكن أن تكون مختلطة معا ومعالجتها. وهذا ممكن لأن الظواهر تختلف ويمكن تمييزها عن طريق الأشكال التضاريسية دابي. تلطيخ في نفس أنبوب تليها التصوير على نفس الشريحة يسمح للمقارنة مباشرة بين الغدد التناسلية من المورثات مختلفة. بدلا من ذلك، إذا كانت الأشكال التضاريسية دابي ليست مميزة، ثم على بعد خطوتين تلوين الأجسام المضادة يمكن اعتمادها. لأول مرة يتم التعامل مع كل الوراثي الفردي مع اثنين من الأجسام المضادة متميزة، الجسم المضاد ألف لWT والجسم المضاد B لمتحولة (سواء الأجسام المضادة تحتاج إلى أن تثار في مجموعة متميزة من الأجسام المضادة dpERK). مرة واحدة وقد تم ملطخة المورثات مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية، وغسلها، وأنها يمكن أن تكون مختلطة معا في أنبوب واحد وملطخة الآن مع الأجسام المضادة dpERK، تليها علاج الأجسام المضادة الثانوية إلى تصور كل الأجسام المضادة في الأنبوب. القدرة على المقارنة بين الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة، وخصوصا عندما دوتبذل eductions من أنماط تنشيط يضمن تفسيرات دقيقة لا يتأثر الظروف تلطيخ متميزة.

في حين مفيد، وهناك خطوات متعددة في جميع أنحاء طريقة تعليق تتطلب المعالجة المتأنية. ومن الأهمية بمكان أن تحدث تشريح في الوقت بكفاءة. الأهم من ذلك، ينبغي أن تشريح لا تأخذ أكثر من 5 دقائق. مرات تشريح الأطول تؤدي في إشارة dpERK المتغيرة، التي غالبا ما يساء فهمها على أنها تغييرات ينظم في تفعيل إرك، وليس الفشل كما الفنية. ومن الأهمية بمكان أن تبدأ مع أكثر من 100-150 الحيوانات لكل تشريح لجميع أنحاء غسل مختلف الخطوات التي يمكن بسهولة الغدد التناسلية تضيع من الأنابيب بسبب أخطاء pipetting ل. فقدان الغدد التناسلية يمكن تخفيض إما عن طريق تشريح في دفعات صغيرة متعددة (مثل ثلاث دفعات من 50 الحيوانات لكل منهما) التي يمكن دمجها، أو عن طريق تشريح دفعة واحدة كبيرة من 150. وهناك تحد آخر هو الحصول على الغدد التناسلية للكذب في-متباعدة بشكل جيد تشكيلعلى الشريحة بحيث الغدد التناسلية البعيدة بأكمله ولا يمكن تصوير. لتمكين هذا، استخدم رمش على عود ثقاب أو ماصة سحبت إلى الفضاء خارج الغدد التناسلية. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر حتى لا تتلف الغدد التناسلية أثناء هذه العملية. في كثير من الأحيان مع هذه التقنيات يستغرق عدة محاولات السيطرة على تشريح وكذلك الترتيبات من الغدد التناسلية على الشرائح.

بمجرد يتقن هذه التقنية، وهي بمثابة وسيلة قوية للتحاليل البيولوجية المتنوعة، ويمكن استخدامها لدراسة أكثر من مستويات dpERK فقط. على سبيل المثال هذه الطريقة يمكن استخدامها لتصور مستويات النشطة P38، أو مستويات معلمين النشطة، أو أي البروتين الذي يوجد كاشف الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يقترن الأسلوب مع شاشة تثبيط الكيميائية في الحيوانات كلها لفحص لمثبطات جديدة أو تفعيل للمسار، عبر يعاير لمستويات dpERK. وهذا سوف يسمح لقراءات في الجسم الحي من كل من رد الفعل والحساسية تجاه أي من مثبطات التي قد كثافة العملياتeract مع إشارات الطريق RTK-RAS-إرك. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في تركيبات الأجسام المضادة مع مخرجات الإشارات المتعددة التي يمكن لجميع استخدامها، وتصور في وقت واحد. باستخدام الأجسام المضادة متعددة يسمح ارتباط بين مسارات متعددة، وحالة تفعيلها، ونتائج كل داخل الأنسجة نفسها، مما يتيح فهم أفضل لهذه التفاعلات. هذه ليست سوى أمثلة قليلة على مزيد من التطبيقات لهذه الطريقة، ولكن هذا النظام يمكن تعديلها لدراسة اهتمامات بحثية متعددة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
  2. McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
  3. Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
  4. Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
  5. Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
  6. Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
  7. Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
  8. Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
  10. Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
  11. Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
  12. Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
  13. Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
  14. Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
  15. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
  16. Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
  17. Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
  18. Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
  19. Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
  20. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
  23. Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
  24. Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 117، RAS-إرك،
تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial… More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter