Summary
우리는 해부 C.에서 활동 ERK의 공간과 시간 현지화에 대한 면역 형광 이미징 기반의 방법을 제시한다 간스의 생식선. 여기에 설명 된 프로토콜 C. 어떤 시그널링 시각화 또는 구조 단백질을 적용 할 수있다 엘레 생식선은 적절한 항체 시약을 사용할 제공했다.
Abstract
RTK-RAS-ERK 경로를 열 변환 진화 적으로 보존 된 세포 외 신호는 주로 ERK, 통로의 단자 키나제의 활성화를 통해 여러 세포 및 발달 과정을 제어하는 중요한 키나제 신호 폭포입니다. ERK 활성의 긴밀한 조절 정상적인 발달 및 항상성 유지에 필수적이다; 과도한 세포 증식에 과도하게 활성화 된 ERK 결과는 동안은 부진 ERK는 세포 사멸을 야기한다. C.를 엘레 개발하는 동안 RTK-RAS-ERK 신호 전달 경로의 기능 및 규제의 특성을 도왔다 강력한 모델 시스템입니다. 특히, RTK-RAS-ERK 경로는 필수적이다 C. 이 방법의 초점 배아 발달, 간스. ERK (dpERK)의 활성 diphosphorylated 형태에 특이적인 항체를 사용하여, 스테레오 파악 패턴은 생식선 내에서 시각화 될 수있다. 이 패턴은 공간적 시간적 설정 제어하므로에드 dpERK 재현성을 분석하는 능력 dpERK 신호의 시간 및 진폭 따라서 배아 발달에 영향을주는 통로의 레귤레이터를 식별하기 위해 유용하다. 여기에서 우리는 성공적으로 C. 내에서, 얼룩 및 이미지 dpERK를 해부하는 방법을 보여줍니다 간스의 생식선. 이 방법은 임의 C. 시그널링 공간 지역화 또는 구조 단백질을 적용 할 수있다 엘레 생식선은 면역와 호환 항체를 사용할 수 제공.
Introduction
수용체 티로신 키나제 (RTK) -RAt 육종 (RAS) -Extracellular 신호 규제 키나제 (ERK) 경로는 ERK 1-3의 인산화 및 활성화 결과 보존 된 키나아제 캐스케이드를 통해 세포 외 신호를 중계한다. ERK 단백질은 보존 된 프롤린 - 지시 세린 / 트레오닌 MAP (미토 겐 활성화 단백질) 키나제 가족의 구성원, 직접 보존 테이 모티브의 트레오닌 (T)과 티로신 (Y)에 이중 인산화를 통해 MEK에 의해 활성화된다. (diphosphorylated ERK 또는 dpERK 라 함)는 액티브 ERK 하류 기판 1-3의 전지의 인산화를 통해 많은 세포 발달 과정을 조절한다. 그러므로 이상 ERK 활성은 다양한 세포 발달 결함 4-7 리드.
ERK 활동의 엄격한 규제는 정상적인 개발을위한 중요 : 포유류의 시스템에 너무 많은 ERK 활동이 과도한 세포 증식의 선두에 이르게종양 성장에; 너무 작은 활동은 세포 사멸 4,6 리드. 또한, ERK 활성의 지속 기간의 변화는 또한 고유의 결과로 이어질 수 : PC12 세포에서 ERK 활성화를 60 분 이상이 유도 신경 분화 -8,9- 30 분 이하를 유도 세포 증식하지만 ERK의 활성화. ERK 활동의 꽉 규제 따라서 정상적인 개발 및 항상성에 대한 명확 필수적이다.
C. 엘레는 RTK-RAS-ERK 신호 경로 3,10-15 기능 및 규제를 해부 강력한 유전 연성 모델 시스템이다. RAS 및 ERK, C. 여러 유전자를 포함하는 포유류 시스템에 대해 이 경로 3,10-14의 기능을 해부하는에 유 전적으로 더 용이 한 시스템을 렌더링 - 엘레 한 RAS 유전자 (하자-60)를 하나의 ERK 유전자 (1 MPK)가 포함되어 있습니다. C. 간스의 배아는 기본적으로 유사 분열로 구성 튜브입니다기단부 (그림 1) (16)의 선단에서 세포와 성숙 난자 줄기. 생식 세포는 최종적으로 인접 영역 (16)의 난 모세포 성숙을 받고, 루프 영역에 난자를 형성하기 시작 이후 연장 감수 의향 (pachytene)를 통해 바로 원위 분열 영역에 인접하고, 진행 감수 분열을 개시.
우리 자신을 포함하여 여러 실험실에서 유전자 연구는 RTK-RAS-ERK 경로는 C에서 배아 발달에 필수적인 것으로 나타났습니다 엘레 12,13,15,17-19. 특히, 우리는 ERK 컨트롤을 발견 예컨대 난 모세포 성장 11,18 같은 생물학적 프로세스를 셀 수있는 생식 세포 사멸 등의 발달 스위치에 이르기까지, 배아 개발하는 동안 적어도 구 별개의 생물학적 과정을 조정합니다. 많은 포유류 시스템의 C.에 너무 많은 ERK 활동 등 너무 리 동안 여러 작은 난자의 생산에 배아 결과 엘레 간스하나의 큰 난자 11 ttle 활동 결과. 따라서 dpERK의 엄격한 규제는 정상적인 배아 발달에 필수적이다. 성숙한 다시 루프 지역에서 낮은 및 높은 dpERK 중순 pachytene 동안 높은 (존 1, 그림 1) : ERK의 활성 형태는 dpERK에 특이적인 항체에 의해 가시화 등의 진부한, 동적, 바이 모달 현지화 패턴을 표시합니다 난 모세포 (존 2, 그림 1). 최근에는 영양 구역 1 (12)에 ERK 활성화하는 인슐린 유사 성장 인자 수용체 1 (DAF-2)을 통해 작용하는 것으로; 이전 작업합니다 (Ephrin 수용체 티로신 키나제를 통해) 정자 신호 영역이 13 ERK를 활성화 것으로 나타났다.
배아에서 가감 저항기 활성 ERK 기능 dpERK의 난 모세포 성장, 공간과 시간 현지화뿐만 아니라 진폭을 조절하는 점을 감안, 정상 신호 결과를 이해하는 열쇠이다. 여기에 기술 된 방법을 사용하면의 변화dpERK의 진부한 현지화 쉽게 모니터링 할 수 있으며, 예측 ERK 활동 때문에 기능에 대한 환경 적 또는 유전 적 교란의 영향에 산출했다. 따라서, dpERK에 대해 분석하는 것은 배아 개발하는 동안 그 역할의 포괄적 인 이해를 할 수 있습니다.
Protocol
여기에 설명 된 프로토콜은 무척추 동물 모델 시스템 C. 대해 우선적 엘레, 그리고 기관에서 정한 모든 윤리적 가이드 라인을 따른다.
1. 동물의 유지 보수
- C. 유지 E. 시드 한천 선충 성장 매체 (20, 21) (NGM 참조 자료 표)에 재고 문화를 작업 간스 대장균 OP50.
- 16 ° C와 25 ° C 사이의 온도에서 웜 주식을 유지한다.
주 : 종종 빠른 성장 속도, 비정상적인 배아 발달 및 하부 브루 크기에서보다 높은 온도의 결과를 웜 배양. 또한, 온도에 민감한 유전자형은 서로 다른 온도에서 서로 다른 표현형을 표시합니다. - 잘 공급 웜의 지속적인 공급을 유지하기 위해 자신의 성장 속도에 따라 3 일 - 매 2 새로운 NGM 플레이트로 웜을 전송합니다.
참고 : dpERK 수준을 포함하는 특정 실험을 위해, 웜은 굶어 또는 군중에서 얻을 수 안됩니다에드 판. 크롤 링 기아에 미치는 영향 인슐린은 웜 (22)에 신호 및 인슐린 신호는 ERK (12) 활성을 조절한다. 따라서 굶주린 또는 과밀 판에서 벌레 변수 어려운 재현 염색 패턴 발생합니다.
생식선을 얻기위한 성인 웜 2. 해부
- 150 WT (N2) 또는 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 M9 완충액 100 μL의 원하는 특정 발달 단계 (L1, L2, L3, L4, 성인, 등.)의 웜 원하는 유전자형 - 백을 지정.
- M9 버퍼 900 μL와 microcentrifuge 관 채우기 (재료 표 참조). 주위 온도에서 1 분간 마이크로 원심 1,000 XG에서 튜브를 원심 분리기.
- 부드럽게 M9 버퍼 900 μL를 제거하고 폐기합니다. 벌레가 실수로 삭제되지 않도록 해부 현미경 버퍼를 제거합니다.
- 신선한 M9 2.3 두 번 더 할 때마다 버퍼 - 반복 2.2 단계를 반복합니다.이 벌레로 이월 된 모든 세균을 효과적으로 씻어되도록합니다.
- 최종 세척 후 튜브 및 폐기에서 M9 버퍼 900 μL를 제거합니다.
- 평면 바닥 유리 시계 접시에 200 μL - 마이크로 피펫 팁 150 웜 - 100를 포함하는 나머지 100 μL M9의 버퍼를 전송합니다. 마이크로 피펫 팁을 사용하기 전에 10 μL 마크에서 절단되어 있는지 확인합니다. 끝이 웜의 전단 발생합니다 절단하지 않습니다.
- M9 버퍼에 웜을 포함하는 유리 시계 접시에 0.1 M의 levamisole 3 μL - 1을 추가한다. 조심스럽게 벌레가 이동을 중지 할 때까지 혼합도 가능하도록 레바 미솔과 M9 소용돌이 친다.
주 : 레바 미솔 주식 장기 보존에 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 동물의 이동성의 신속한 손실을 얻기 위하여 레바 미솔 0.25 밀리미터 - 0.2 문헌 23에 설명 된 내용 3mm보다 - 여기서, (1)의 높은 농도를 사용한다. 동물이 너무 리터 주위에 채찍 경우옹 액체 현탁액, 생식선에 dpERK의 결과 패턴 (때문에 스트레스 또는 영양 또는이 둘의 부족) 변수가 될 수 있습니다. 해부 3 밀리미터의 levamisole - 더 재현 염색 패턴 1을 달성했다. - 이 1 ML의 주사기 (바늘의 게이지가 중요하다 중요하지 않습니다 주사기의 크기)에 두 개의 25 G 바늘을 연결합니다. 각 손에 위치 하나의 주사기 (그림 2).
- 그림 2와 같이 해부 현미경 하에서 각 웜을 통해 각각의 바늘을 놓고 가위와 같은 동작에서 두 번째 인두 전구 근처 웜에 미세한 상처를 배치합니다. 접시에있는 모든 동물이 한 번 이상 절단 될 때까지 웜에서 한 컷 한 후 다음 동물로 이동합니다.
참고 : - 2.9 시간에 민감한 2.8 단계가 염두해야합니다. 재현 dpERK 패턴에 대한 다섯 분 아래에있는 접시에 모든 벌레를 해부하다. 긴 해부 시간은 특히 Z에서 dpERK 신호의 오프 선회가 발생합니다하나 1. 할당 된 시간 프레임에 머물 해부 (즉, 50 웜 대 150) 필요한 경우 라운드 당 벌레의 수를 조정합니다.- 경우 압출 생식선은 해부 동안 같은 동물의 또 다른 상처를 시도하지 마십시오 볼 수 없습니다. 일반적으로 그것은 단지 동물을 전단과 생식선의 압출 발생하지 않습니다. 대신, 다음 동물로 이동합니다. 돌출하지 않는 생식선 섹션 6에서 이루어집니다 및 이미징 동안 무시 될 수있는 슬라이드에 같은 표시됩니다 웜
참고 : 해부 및 처리의 모든 단계를 통해, 그것은 생식선이 몸 / 카 카스에 부착 된 상태로 유지됩니다 명심하는 것이 중요하다. 생식소와 떨어져 바늘로 몸을 강제하지 마십시오. 몸에서 생식선을 절단하기위한 시도에서 종종 배 성선 조직에서 비정상적인 눈물은 가짜 항체 신호가 발생할 수 있습니다. 바디 / 카 커스 이미징 단계 (제 6) 중에 무시 될 수 있으며, 단지 생식선 이미지화. 또한, 솜장 세포는 항체가 분석 될뿐만 내부 통제 / 신체 컨트롤을 제공 할 수 etimes.
- 경우 압출 생식선은 해부 동안 같은 동물의 또 다른 상처를 시도하지 마십시오 볼 수 없습니다. 일반적으로 그것은 단지 동물을 전단과 생식선의 압출 발생하지 않습니다. 대신, 다음 동물로 이동합니다. 돌출하지 않는 생식선 섹션 6에서 이루어집니다 및 이미징 동안 무시 될 수있는 슬라이드에 같은 표시됩니다 웜
3. 생식소 고정
- 절개가 완료된 후, M9의 100 μL를 함유하는 유리 시계 접시 해부 동물에 직접 3 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 2 mL를 첨가하고 파라 필름으로 커버. 화학 흄 후드에 덮여 시계 유리 접시를 놓습니다.
주의 : PFA는 유해 화학이다. 따라서, 정착 화학 퓸 후드에서 수행되어야한다. - 실온에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 일회용 9 "유리 파스퇴르 피펫을 사용하면 해부 동물을 포함하는 시계 유리 접시에 3 ㎖의 1X PBS-T (참고 자료 테이블)의 추가. 믹스 파스퇴르로 해부 동물과 PFA 용액 및 1X PBS-T를 그려서 피펫 조심스럽게 다시 시계 유리 접시에 해제는. 세척하는 동안 튜브를 와동하지 마십시오.
- FRE 사용SH 유리 파스퇴르 피펫 파스퇴르 피펫으로 시계 유리 접시에서 5 (해부 웜 함유 PFA 및 1X PBS-T)의 액체 용액을 그리고 새로운 5 ㎖ 유리 원추형 튜브에 콘텐츠를 전송.
- 원심 분리기 1,000 X g에서 임상 원심 분리기에서 30 초 동안 원뿔 튜브. 유리 파스퇴르 피펫과 원뿔 튜브를 사용으로 해부 생식선 플라스틱에 충실.
- 제거하고 해부 동물을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다. 해부 생식선에 영향을 미치지 않도록 해부 현미경 원뿔형 튜브에서 각각 세척 한 후 액체를 제거하고, 그 손실을 최소화한다.
- 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 원뿔 튜브에 5 mL의 1 배 PBS-T를 추가합니다. 원심 분리기 1,000 × g으로 30 초 동안 임상 원심 분리기에서 원뿔 튜브. 제거하고 해부 동물을 방해하지 않도록주의하면서 상층 액을 버린다.
- 3 회 총 단계를 반복 3.7.
- 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 100 %의 2 mL를 넣고튜브에 메탄올, 부드럽게는 파스퇴르 피펫으로 그리기하여 메탄올 생식선을 섞는다. 1 시간 이상 동안 -20 ℃에서 튜브를 부화.
참고 : 해부 생식선은 dpERK 염색에 대한 최대 2 일 동안 메탄올에 저장할 수 있습니다. 2 개 이상의 일 2 주까지 보관이 아닌 dpERK 항체, 안티 라민 항체와 같은 다른 항체 염색 응용 프로그램과 호환됩니다. - 원하는 배양 시간 후, 생식선 세척하기 위해 총 3 회 반복 단계 3.7. 세척하는 동안 튜브를 와동하지 마십시오. 최종 세척 후 5 ML 원뿔 튜브에 1X PBS-T의 500 μL를 둡니다.
- 신선한 파스퇴르 피펫 신선한 1 mL 유리 튜브 (6mm × 50 ㎜)로 원추형 유리관의 내용을 전송하여. 10 분 - 해부 동물 5 중력에 의해 해결하도록 허용합니다.
- 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 해부 현미경, 1 mL의 유리 튜브 기지에서 가능한 한 세탁의 한 많이 제거심은 해부 생식선을 방해.
4. 차단 및 차 항체 치료
- 30 %의 100 μL를 1X PBS-T에 희석 정상 염소 혈청 (NGS)를 추가 1 mL 유리 튜브 해부 동물 (재료 표 참조). 30 % NGS 블로킹 버퍼로서 기능한다. 액체의 증발을 방지하기 위해 파라 필름 튜브 커버. 1 시간 또는 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 품어.
- 배양 원하는 시간 후, 가능한 한 많은 액체를 제거하고 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 블로킹 완충액을 제거한다. 생식선이 파스퇴르 피펫로 작성되지 않도록하기 위해 해부 현미경을 사용합니다.
- 30 % NGS 400 : 1에서 (dpERK이 메소드에 언급 된 재료 표를 참조) MAPKYT 항체를 희석. 튜브 당 100 μL를 사용하기에 충분한 항체 희석을 준비합니다. 미사용, 희석 항체를 일주일에 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 희석 방지 dpERK 항체의 100 μL를 추가하기 때문에해부 동물을 함유하는 1 ㎖의 유리 튜브 lution. 파라 필름으로 튜브를 밀봉합니다. 4 ℃로 하룻밤에 튜브를 품어.
- 밤새 배양 한 후, 실온에서 튜브에 1X PBST 800 μL를 추가합니다.
- 신선한 유리 파스퇴르 피펫에 샘플을 작성하고 생식선이 균등하게 1X PBS-T에 현탁되도록 부드럽게 놓습니다. 생식선 중력과 바닥에 정착하자. 뜨는을 제거합니다. 이 해부 생식선 씻어하지만 과정에서 손상되지 않았는지 확인합니다.
- 세 세척의 총 4.6 - 반복 4.5 단계를 반복합니다. 세척하는 동안 튜브를 와동하지 마십시오. 세 번째 세척 후 제거하고 해부 동물을 방해하지 않고 가능한 한 많이 뜨는 폐기해야합니다. 신선한 파스퇴르 피펫마다 사용되어 있는지 확인합니다.
5. 차 항체 치료
- 차 항체 동안 세척 보조 항체 희석을 준비합니다. 항 - 마우스 희석 SE1에서 condary 항체 : 500 30 % NGS. 차 항체와 마찬가지로, 튜브 당 100 μL를 사용합니다. 않는 항체를 일주일에 4 ℃에서 저장 될 수있다.
- 해부 동물을 함유 한 용액의 유리관에 100 μL 차 항체 용액을 추가한다. 파라 필름 각 튜브를 커버하고 어두운 튜브의 내용을 유지하기 위해 알루미늄 호일에 튜브를 감싸는. 2 시간 동안 실온에서 튜브를 품어, 또는 대안 밤새 4 ° C에서.
- 배양 원하는 시간 후, 튜브에 1X PBS-T의 800 μL를 추가하고 반복 4.5 단계 - 3 회 총 4.6. 최종 세척 후 제거하고 신선한 파스퇴르 피펫을 사용하여 해부 현미경으로 가능한 한 상층 액만큼을 버린다.
- 이차 항체에 대한 세척시 DAPI 솔루션을 준비합니다. 1X PBST 1 mL의 IN- (-20 ° C에서 보관 1 ㎎ / ㎖의 1000 배 재고에서) DAPI의 1 μL를 희석.
- 을 함유하는 튜브로 희석 DAPI 용액 800 μL를 추가해부 동물. 파라 필름 튜브의 입구를 커버하고, 알루미늄 박의 각 튜브를 감싸는. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션.
- 해부 동물을 방해하지 않도록 DAPI와 인큐베이션 후, 해부 현미경 신선한 파스퇴르 피펫 가능한 DAPI 용액만큼 제거한다.
- 튜브에 솔루션을 장착 한 방울을 추가합니다. 알루미늄 호일의 각 튜브를 감싸.
참고 : dpERK 염색을 시각화를 들어, 스테인드 생식선 즉시 현미경 마운트해야합니다. 이러한 인산화 된 세린 (10) 히스톤 H3 다른 항체 응용 프로그램의 경우, 생식선은 어둠 속에서 4 ° C에서 최대 2 주 동안 미디어를 장착 유지 될 수있다.
6. 조립 슬라이드 및 이미지
- .도 3에 도시 된 바와 같이 두 유리 현미경 슬라이드 (25mm X 75mm X 1mm)의 위쪽에 세로 랩 테이프의 층을 배치 두 테이프 슬라이드 사이에 새로운 깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 배치했다.
참고 : 두께테이프의 중간 슬라이드에 아가로 오스 패드를 생성하는 데 도움이됩니다. 테이프가 아가 패드를 만들기위한 스페이서로서 기능으로서 아가 패드의 두께는 테이프와 거의 동일하다. - 중간에 현미경 슬라이드에 드롭 용융 2 % 아가로 오스의 ~ 200 μL (증류수 제). 빨리 아가로 오스의,에 수직 및 상단에, 신선한 깨끗한 슬라이드를 배치합니다.
- (- 2 분 1) 아가로 오스이 응고하자.
- 아가로 오스 패드가 파괴되지 않도록 매우 조심스럽게 상단 현미경 슬라이드를 제거합니다. 아가로 오스 패드 상단 또는 하단 슬라이드에 하나 부착 된 상태를 유지 할 수 있습니다. 아가로 오스 패드로는, 아가로 오스의 매끄러운 표면 한, 부착 남아 슬라이드하는 중요하지 않습니다.
- 파스퇴르 피펫 아가로 오스 패드에 해부 동물을 전송 사용. 해부 현미경 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드에서 초과 액체를 제거합니다.
- 생식선과 장을 누르면, 속눈썹의 머리카락이나 미세하게 그려 모세관을 사용하여슬라이드의 생식선을 확산하기 위해 서로 방법.
- 24mm X 50mm 크기의 커버 슬립과 현미경 슬라이드를 커버. 커버 슬립이 최소한의 기포가 커버 슬립 및 슬라이드 사이에 형성되는으로 슬라이드에 부드럽게 저하 될 수 있도록주의하십시오.
- 슬라이드 상자에 밤새 4 ° C (슬라이드가 coverslip에 평평 거짓말 불투명 슬라이드 상자)에서 스토어를 초과하는 액체가 증발하고 생식선이 (인해 생식선에 커버 슬립의 무게에) 다소 평평 될 수 있도록합니다. 생식선의 약간의 평탄화는 달리 라운드 생식 관의 더 나은 이미징 수 있습니다.
- 커버 슬립을 장착하면, 손가락으로 커버 슬립의 상부에 압력을 적용하지 않는다. 종종 이것은 생식기 및 dpERK 신호의 손실의 왜곡을 초래한다.
- 만 더 효과적인 이미징 하룻밤 생식선을 평평하게. 슬라이드는 즉시이 조립으로 볼 수 준비가 된 것입니다. 바로 이미지를 사용하려면, 부드럽게 흡수커버 슬립 깨끗한 실험실 조직을 사용하여 모서리에서 슬라이드 사이의 초과 액체.
- 밤새 기간 후, 슬라이드를 밀봉 커버 슬립 슬라이드 경계의 네 모서리에 투명 매니큐어 탑 코트와 커버 슬립. 매니큐어 / 커버 슬립 씰은 커버 슬립 이미징 동안 이동하지 않는 것을 보장하고 샘플의 파괴를 방지합니다.
- 이미지 63X에서 복합 현미경 생식선. 그러나 대물 렌즈의 현미경은 현미경 사용자 애플리케이션의 이용 가능성에 기초하여 변화 될 수있다. 난 모세포의 증식 영역에서 전체 생식선의 크기는 하나의 이미지에서 캡처 될 수있는 것보다 크기 때문에,도 4. 11 ~ 14, 18에 도시 된 바와 같이, 이미지가 중첩 경계 몽타주로 간주된다.
- 많은 경우에, 긴 별다른 변화가 생식선 이미지하지 한, 최종 이미지 및 조립 후 카 커스를 편집. 스토어 t조립 된 이미지를 따라 그는 원시 이미지는 '이전'조립 / 편집의 비교 및 이미지의 어셈블리 '후'/ 편집을 활성화합니다.
주 : 현미경 이미지가 몽타주를 조립하는 동안 신호 강도 나 채도에 대해 변경 될 수 없습니다.
- 많은 경우에, 긴 별다른 변화가 생식선 이미지하지 한, 최종 이미지 및 조립 후 카 커스를 편집. 스토어 t조립 된 이미지를 따라 그는 원시 이미지는 '이전'조립 / 편집의 비교 및 이미지의 어셈블리 '후'/ 편집을 활성화합니다.
Representative Results
WT 성인 암수 동물에 dpERK는 일반적으로 (지역 2) -4 또는 -5 중순 pachytene 지역, 구역 1에서 -1 가장 성숙한 난자으로 시각화된다. 이 활성화 패턴의 교란은 신호 경로의 변경 사항을 반영합니다. 여성 germlines는이 그림 5에 표시되는 영역 1 만 약한 활성화와 함께 지역 2 ERK의 활성화를 표시하지 않습니다 따라서 정자를 지정하지 않습니다.
그림 1 : C. 엘레 배아 형태학. 흰색 선으로 요약 한 U 자형 생식소 팔 성인 자웅 동체의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지입니다. 성인 자웅 동체 생식선은 원위 팁에서 유사 분열 세포가 포함되어 있습니다. 유사 분열 세포는 감수 의향 (pachytene) matur에 개발을 통해 감수 분열과 발전을 입력근위 생식선에서 전자 난자. 성인 자웅 동체 생식선에 dpERK의 영역 1과 영역 2마르크에 박힌 현지화. 규모 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 해부 동안 바늘 위치 데모 왼쪽 :. 과정에서 해부의 사진. 오른쪽 :. 웜을 참조하여 바늘 위치 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 아가로 오스 슬라이드 준비의 데모. (A) 테이프 lengthwis 배치2 깨끗한 현미경 슬라이드에 걸쳐 전자. 그림과 같이 테이프로 두 슬라이드 사이에 신선한 깨끗한 현미경 슬라이드를 놓습니다. 세 개의 슬라이드 중앙에 슬라이드로 아가로 오스 녹아 추가 서로 길이. (B) 옆에 있습니다. (C)는 아가로 오스의 드롭을 들고에 수직 신선한 현미경 슬라이드를 놓고 중간 슬라이드의 상단에. ( D) 아가로 오스는 응고하도록 허용합니다. (E)는 응고 아가로 오스 패드를 뒤에 남겨두고 상단 슬라이드를 제거합니다. 해부 및 스테인드 탑재 germlines의 아가로 오스 패드 하단 슬라이드를 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. DAPI와 야생 형 배아의 몽타주 몽타주로 슬라이드 (t 이미징영업 이익) 및 dpERK (아래) 채널. 이미지의 경계를 중복으로 63X에서 찍은 패널 A와 B 각 패널의 패널 B와 C를 DAPI와 dpERK 이미지에 녹색 상자 흰색 상자는 두 개의 서로 다른 채널에서 동시에 촬영했다. 조립 된 화상은도 5a에 도시되어있다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 동적 임시 ERK의 / 공간 활성화. DNA (흰색 B, DAPI) 및 dpERK에 대한 염색 (AC) WT (N2) 성인 (개발 후 24 시간 지난 중간 L4 단계) 자웅 동체의 germlines (C, 빨간색). 지역 (1), pachytene 영역 및 영역 2, 성숙 난자의 dpERK 신호가 강조 표시됩니다. (DF)를안개-2 (oz40) 여성 germlines DNA (E, DAPI) 및 dpERK (F)에 대한 염색 (8 시간 개발의 과거 중간 L4 단계에서). 젊은 여성 germlines은 구역 1에 약한 dpERK를 표시하고, 정자 독립적 인 방식으로 하나의 난자있다. 존 2는 정자에 의존하고 여성의 생식 세포에 따라서 존재하지 않는다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
활성 ERK (dpERK)는 C.에 박힌 공간 및 동적 현지화 패턴을 따른다 간스의 배아. 성인 C.에서이 박힌 dpERK 공간 패턴 (그림 5), 진폭 간스의 생식선이 효과적으로 ERK가 규제하는 많은 생물학적 과정과 연관 될 수있다. 예를 들어, 무능력 감수 분열, 성숙 난자에서 ERK를 활성화하지 따라서 (그림 5) 정자를 지정하지 않는 여성 germlines에서 관찰 된 표현형의 의향에 영역에 난자의 체포에이 결과를 ERK를 활성화합니다. 난자의 성숙과 배란의 시작과 함께 여성 germlines 11,13의 영역 2 dpERK의 효율적인 축적에 남성 '결과 짝짓기. 따라서 공간 패턴 (예 : RNA 간섭 중재 유전자의 불 활성화와 같은) 특정 유전자 교란 물질 또는 화학 물질 처리시 dpERK의 시간적 활성화의 분석은 가열 공기 조절기 요인의 식별 가능늦은 ERK 신호 따라서 ERK 의존 생물학적 과정. 이러한 분석은 또한 신호 전달 경로 사이에 새로운 유전 적 상호 작용의 발견을 가능하게한다.
어떤 이미지를 기반으로 분석을위한 중요한 병목 현상은 응용 프로그램에 특정 항체로 기능 시약의 가용성이다. 이러한 시약이 존재하는 경우와 같은 전술 한 하나의 방법을 용이하게 관심있는 단백질을 파악 패턴의 분석에 적용될 수있다. 애플리케이션 따라서 작동하는 항체의 가용성에 의해 제한된다. 상기 방법은 소정의 개발시에 박리 및 착색을 설명하기 때문에 또한, 단지 하나의 시간 프레임에서의 정보의 캡쳐를 가능하게하고, 실시간으로 또는 단백질 회전율의 비율 역학 또는 단백질 조절을 밝혀 않는다.
상기 방법은 프란시스 동부 등으로부터 구성된다. 23 Seydoux 던 m 구별되는생식선 압출 및 항체 염색 24을 ethod. 프랜시스 등의 알을 기반으로하는 방법은.은 "서스펜션 방법"과 "균열 동결 방법"비교라는 Seydoux과 던 방법 호출됩니다. 서스펜션 방법은 본질적으로 가혹한 처리 조건에 더 민감 같은 dpERK 같은 신호 분자의 재현 현지화 패턴을 얻기 위해 우리의 손에 매우 효과적이었다. dpERK 현지화의 경우, 우리의 경험, 영역 1의 신호가 동결 크래킹 방법으로 거의 발견 할 수없는 것입니다. 또한, 자주 동결 분해 방법에서 발생할 수있는 샘플 건조, 가짜 항체 신호의 결과. 생식선이 과정에서, 액체에 부유하기 때문에 서스펜션에있어서, 샘플의 건조를 최소화한다. 우리는 또한 서스펜션 방법은 하나의 슬라이드에 여러 다른 유전자형을 이미징 유용하다는 것을 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 자웅 동체 등의 경우 두 개의 유전자형, 대암컷 직접 dpERK 현지화 비해 두 유전자형을 함께 혼합하여 처리 될 수하여야한다. 표현형을 구별하고 DAPI 모폴로지를 통해 구별 할 수 있기 때문에 가능하다. 같은 슬라이드에 이미지 다음에 같은 튜브에 염색 서로 다른 유전자형의 생식선 사이의 직접 비교를 할 수 있습니다. DAPI 모폴로지가 구별 될 수없는 경우 또는, 다음 두 단계의 항체 염색을 채용 할 수있다. 먼저 각각의 유전자형이 두 가지 항체로 처리, 돌연변이에 대한 WT 및 항체 B에 대한 항체 A (모두 항체는 dpERK 항체 구별 호스트에서 제기해야합니다). 두 유전자형이 차 항체로 염색하고, 세척 된 후에, 그것들은 하나의 튜브에서 혼합 될 수 있고, 이제 튜브 모든 항체를 시각화하는 이차 항체를 처리하여 상기 dpERK 항체로 염색. 거라고 때 능력은 특히, 하나의 슬라이드에 다른 유전자형을 비교활성화 패턴의 eductions는 별개의 염색 조건에 의해 영향을받지 않는 정확한 해석을 보장 이루어지고있다.
유리하지만, 조심 조작을 필요로하는 정지 방법을 통해 여러 단계가 있습니다. 해부 한 번 효율적으로 발생하는 것이 중요합니다; 중요한 것은, 해부를 통해 5 분을해서는 안된다. 긴 해부 시간은 종종 ERK의 활성화에 규제 변화보다는 기술적 인 오류로 잘못 해석 될 수있는 변수 dpERK 신호를 초래한다. 때문에 다양한 세척이 생식선 쉽게 피펫 오류로 인해 튜브에서 손실 될 수 있습니다 단계에 걸쳐 각 해부 150 동물 - 100로 시작하는 것이 중요합니다. 생식선의 손실 중 하나를 여러 개의 작은 일괄 적으로 해부에 의해 감소 될 수있다 결합 할 수 있습니다 (예 : 50 동물 각각의 세 가지 배치로), 또는 (150)의 하나의 큰 배치를 해부하여 또 다른 문제는 잘 간격에 거짓말을 생식선을 받고있다 형성슬라이드에 있도록 전체 말초 생식소는 이미징 할 수있다. 이를 사용하려면, 성냥이나 생식선 밖으로 공간에 뽑아 피펫에 속눈썹을 사용합니다. 이 과정에서 생식기 손상되지 않도록하지만,주의를 기울여야한다. 종종 이러한 기술로는 슬라이드 상에 다수의 해부를 마스터하려는 시도뿐만 아니라, 생식선의 준비를합니다.
이 기술을 습득 한 후에는 다양한 생물학적 분석을위한 강력한 수단으로 제공하며, 단지 dpERK 레벨 이상을 연구하는데 사용될 수있다. 예를 들어,이 방법은 활성 P38 수준 또는 활성 수준 CDK 또는 항체 시약이 존재하는 임의의 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 또한, 상기 방법은 dpERK 레벨에 대한 시금 통해 신규 억제제 또는 경로의 활성화에 대한 분석에 전체 동물 화학적 억제 스크린에 연결될 수있다. 이 값 int 수있는 억제제에 모두 반응 감도의 생체 판독이 가능합니다RTK-RAS-ERK 신호 전달 경로와 eract. 또한,이 방법은 모든 이용 한번에 가시화 될 수있는 다수의 신호 출력을 갖는 항체를 조합하여 사용할 수있다. 다수의 항체를 사용하여 다중 경로들이 활성화 상태 사이의 상관을 허용하고, 이러한 상호 작용의 이해를 가능하게, 같은 조직 내 성과. 다음은이 방법의 또 다른 응용 프로그램의 몇 가지 예에 불과하지만,이 시스템은 여러 연구 분야를 공부하고 수정할 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution |
| Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass because dissected gonads often stick to plastic |
| 25 G needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| Syringes (could be 1 or 5 mL) | BD Syringes | 1 mL: BD 309659 | |
| Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
| Coverslips (24 x 50 mm) | Corning | 2935-245 | |
| 5 mL glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
| 9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Clinical bench top centrifuge | |||
| Glass tubes (6 x 50 mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
| *M9 solution | |||
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
| 1x PBS-T | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBS-T |
| MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
| Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| *M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. | ||
| **PBS (1x) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L | ||
| Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. |
References
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