Summary
Vi presenterar ett immunofluorescens imaging-baserad metod för rumsliga och tidsmässiga lokalisering av aktiv ERK i dissekerade C. elegans gonad. Protokollet som beskrivs här kan anpassas för visualisering av någon signalering eller strukturellt protein i C. elegans gonad, förutsatt att ett lämpligt antikroppsreagens är tillgänglig.
Abstract
Den evolutionärt konserverad extracellulära signalomvandlande RTK-RAS-ERK-vägen är en viktig kinassignalkaskad som styr flera cellulära och utvecklingsprocesser i huvudsak via aktivering av ERK, terminal kinas av vägen. Tight reglering av ERK-aktivitet är nödvändig för normal utveckling och homeostas; alltför aktiva ERK resultat i överdriven cellulär proliferation, medan active ERK orsakar celldöd. C. elegans är ett kraftfullt modellsystem som har hjälpt karakterisera funktion och reglering av RTK-RAS-ERK signalväg under utveckling. I synnerhet, är en förutsättning för C. RTK-RAS-ERK-vägen elegans könsceller utveckling, som är i fokus för denna metod. Genom att använda antikroppar som är specifika för den aktiva, diphosphorylated form av ERK (dpERK), den stereotypa lokaliseringsmönster kan visualiseras i nedärvda. Eftersom detta mönster är både rumsligt och tidsmässigt controlled, förmågan att reproducerbart analysera dpERK är användbara för att identifiera regulatorer av reaktionsvägen som påverkar dpERK signalens varaktighet och amplitud och därmed arvslinjeutveckling. Här visar vi hur man framgångsrikt att dissekera, bets, och bild dpERK inom C. elegans gonad. Denna metod kan anpassas för spatial lokalisering av någon signalering eller strukturellt protein i C. elegans gonad, förutsatt en antikropp kompatibel med immunofluorescens finns.
Introduction
Receptor (RTK) -RAt Sarkom (RAS) -Extracellular signal Regulated Kinase (ERK) -vägen förmedlar extracellulära signaler genom en konserverad kinaskaskad som resulterar i fosforyleringen och aktivering av ERK 3/1. ERK proteiner är medlemmar i den konserverade prolin-serin / treonin MAP (Mitogen aktiverat protein) kinasfamiljen, och påverkas direkt av MEK via dubbla fosforylering på treonin (T) och tyrosin (Y) av den konserverade TEY motiv. Aktiv ERK (kallad diphosphorylated ERK, eller dpERK) reglerar sedan många cellulära och utvecklingsprocesser genom dess fosforylering av ett batteri av nedströms substrat 1-3. Således onormal ERK aktivitet leder till många cell och utvecklingsdefekter 4-7.
Strängare reglering av ERK-aktivitet är kritisk för normal utveckling: i däggdjurssystem för mycket ERK aktivitet leder till överdriven celldelning ledandetill onkogen tillväxt; för lite aktivitet leder till celldöd 4,6. Dessutom förändringar i längden på ERK-aktivitet kan också leda till tydliga resultat: i PC12-celler, ERK aktivering för 30 minuter eller mindre inducerar celltillväxt, men ERK aktivering för 60 minuter eller mer inducerar neuronal differentiering 8,9. Tight reglering av ERK-aktivitet är därför absolut nödvändigt för normal utveckling och homeostas.
C. elegans är en kraftfull och genetiskt formbar modellsystem för att dissekera funktion och reglering av RTK-RAS-ERK signalväg 3,10-15. I förhållande till däggdjurssystem, som innehåller flera gener för RAS och ERK, C. elegans innehåller en RAS-genen (let-60) och en ERK-gen (mpk - 1), vilket gör det till en genetiskt mer lättvindig system där att dissekera funktionen av denna reaktionsväg 3,10-14. C. elegans arvslinje är väsentligen ett rör som består av mitotiskastamceller vid sin distala ände och mogna oocyter vid sin proximala ände (figur 1) 16. Könsceller initiera meios alldeles proximalt till den distala mitotiska zonen, och framsteg genom en utsträckt meiotisk profas (pachytene), varefter de börjar bildas oocyter i loopregionen, slutligen genomgår oocytmognad i det proximala området 16.
Genetiska studier från flera laboratorier, inklusive vår egen, har visat att RTK-RAS-ERK-vägen är avgörande för könsceller utveckling i C. elegans 12,13,15,17-19. Specifikt fann vi att ERK kontroller och samordnar åtminstone nio olika biologiska processer under könsceller utveckling, från utvecklings växlar såsom könsceller apoptos att cellbiologiska processer såsom äggcellen tillväxt 11,18. Ungefär som i däggdjurssystem, för mycket ERK aktivitet i C. elegans nedärvda resulterar i produktion av flera små ägg, medan för little aktivitet resulterar i en stor äggcellen 11. Således är en förutsättning för normal könsceller utveckling stram reglering av dpERK. Den aktiva formen av ERK, såsom visualiseras genom en antikropp specifik för dpERK visar en stereotyp, dynamisk, bimodal lokalisering mönster: dpERK är hög under mitten pachytene (zon 1, figur 1) som är låg i loopregionen och hög igen i moget oocyter (Zon 2, Figur 1). Nyligen fann vi att näring verkar genom insulinliknande tillväxtfaktorreceptor-1 (daf-2) för att aktivera ERK i zon 1 12; tidigare arbete visade att spermier signalen (via ephrin receptortyrosinkinas) aktiverar ERK i zon 2 13.
Med tanke på att aktiva ERK fungerar som en reostat i könsceller för att reglera äggcellen tillväxt, rumsliga och tids lokalisering, liksom amplitud dpERK, är nyckeln till att förstå sin normala signaler resultatet. Med användning av metoden som beskrivs här, förändringar istereotypa lokalisering av dpERK kan lätt övervakas och förutsägelser erhållas på effekterna av miljö- eller genetiska störningar på ERK-aktivitet och därmed funktionen. Således, analys för dpERK möjliggör en omfattande förståelse för sin roll under könsceller utveckling.
Protocol
Protokollet som beskrivs här är i första hand för ryggradslösa modellsystemet C. elegans, och följer alla de etiska riktlinjer som fastställts av institutionen.
1. Animaliska Underhåll
- Upprätthålla C. elegans arbetsstamkulturer på Nematode Growth Medium 20,21 (NGM, se Material tabell) agar ympad med E. coli OP50.
- Bibehålla snäcklager vid temperaturer mellan 16 ° C och 25 ° C.
OBS: Odling maskar vid högre temperaturer resulterar i snabbare tillväxt, ofta avvikande könsceller utveckling och lägre avelsstorlekar. Dessutom kommer temperaturkänsliga genotyper visa olika fenotyper vid olika temperaturer. - Överföra maskar till nya NGM plattor var 2 - 3 dagar beroende på deras tillväxttakt för att upprätthålla en konstant tillförsel av välnärda maskar.
OBS: För varje given experiment med dpERK nivåer, maskar bör inte erhållas från ett svalt eller publiked plattan. Trängsel eller svält effekter insulin signalering i maskar 22, och insulinsignalering reglerar ERK 12 aktivitet. Sålunda maskar från Starved eller överfulla plattor kommer att resultera i variabla och svåra att reproducera färgningsmönster.
2. Dissekering av vuxna maskar för att erhålla Gonads
- Plocka 100-150 WT (N2) eller önskad genotyp av maskar på den önskade och specifika utvecklingsstadiet (L1, L2, L3, L4, vuxen, etc.) I 100 mikroliter av M9-buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Fylla mikrocentrifugrör med 900 mikroliter av M9-buffert (se Material tabell). Centrifugera rören vid 1000 x g i en mikrocentrifug under 1 min vid omgivningstemperatur.
- Försiktigt bort 900 mikroliter av M9 buffert och kassera. Ta bufferten under ett dissektionsmikroskop för att säkerställa att maskar inte av misstag tas bort.
- Upprepa steg 2,2 - 2,3 två gånger med färsk M9 buffert varje gång.Detta säkerställer att alla bakterier som överfördes med maskarna effektivt tvättas bort.
- Efter den slutliga tvätten ta bort 900 mikroliter av M9-buffert från röret och göra sig av med.
- Överför återstående 100 mikroliter av M9 buffert innehållande 100 - 150 maskar med 200 mikroliter-mikropipett tips till en platt botten glas klocka skålen. Se till att mikropipett spetsen skärs vid 10 mikroliter märket före användning. Inte skära spetsen kommer att resultera i klippning av maskar.
- Tillsätt 1 - 3 mikroliter av 0,1 M levamisol till glas watch skål innehållande maskar i M9-buffert. Snurra försiktigt levamisol och M9 för att möjliggöra jämn blandning tills maskarna stannar.
OBS: levamisol lagren kan lagras vid -20 ° C för långtidsförvaring. Här använder högre koncentration av 1 - 3 mM än vad som har beskrivits i litteraturen 23 av 0,2 till 0,25 mM levamisol för att få snabb förlust av rörlighet i djuren. Om djuren flå runt alltför long i den flytande suspensionen, kan de resulterande mönstren för dpERK i gonaderna vara variabel (på grund av stress eller brist på näring eller båda). Mer reproducerbara färgningsmönster har uppnåtts med 1 - 3 mM levamisol för dissekering. - Fäst två 25 G nålar till två 1 ml sprutor (storleken på sprutan spelar ingen roll, är mätaren av nålen kritiska). Position en spruta i varje hand (Figur 2).
- Under ett dissektionsmikroskop, placera varje nål under och över varje mask som visas i figur 2 och placera ett fint snitt på masken nära den andra svalg glödlampa i en saxliknande rörelse. Efter en sänkning av masken gå vidare till nästa djur tills alla djuren i skålen har skurits minst en gång.
OBS: Var medveten om att steg 2,8-2,9 är tidskänsliga. Dissekera alla maskar i skålen på under fem minuter för en reproducerbar dpERK mönster. Längre dissektion gånger kommer att resultera i en Stänga av dpERK signalen, särskilt i Zen 1. Justera antalet maskar per runda av dissektion (dvs 50 maskar kontra 150) om det är nödvändigt att stanna i den tilldelade tidsramen.- Vid en extruderad gonad inte syns under dissektionen, försök inte en annan snitt i samma djur. Vanligtvis som bara klippa djuret och inte resulterar i extrudering av gonad. Istället gå vidare till nästa djur. Worms där könskörtlarna inte extrudera kommer att visas som sådan på de bilder som kommer att göras i avsnitt 6 och kan ignoreras under avbildning
OBS: Genom alla dissekering och behandlingsstegen, är det viktigt att komma ihåg att det gonad förblir fäst vid kroppen / stommen. Tvinga inte gonad och kroppen isär med nålen. Ofta gånger ett avvikande tår i gonadal vävnaden i ett försök att avskilja gonad från kroppen kan resultera i falsk antikroppssignalen. Kroppen / kadaver kan ignoreras under bild stegen (avsnitt 6), och endast gonad avbildas. Dessutom, asetimes tarmcellerna kan också fungera som interna kontroller / somatiska kontroller för antikroppen som analyseras.
- Vid en extruderad gonad inte syns under dissektionen, försök inte en annan snitt i samma djur. Vanligtvis som bara klippa djuret och inte resulterar i extrudering av gonad. Istället gå vidare till nästa djur. Worms där könskörtlarna inte extrudera kommer att visas som sådan på de bilder som kommer att göras i avsnitt 6 och kan ignoreras under avbildning
3. gonad Fixering
- Efter dissektion är slutförd, tillsätt 2 ml av 3% paraformaldehyd (PFA) direkt mot glaset watch skålen innehållande 100 mikroliter av M9 och de dissekerade djur och täck med Parafilm. Placera den täckta urglaset skålen i en kemisk draghuv.
Varning: PFA är en farlig kemikalie. Sålunda bör fixeringen utföras i dragskåp. - Inkubera vid RT i 10 min.
- Med hjälp av en engångs 9 "glas pasteurpipett tillsätts 3 ml 1x PBS-T (se Material tabell) till klockan glasskål som innehåller de dissekerade djur. Blanda genom att dra PFA lösning och 1 x PBS-T med dissekerade djur i Pasteur pipett och släpper försiktigt tillbaka till klockan glasskål. inte virvel rören under tvättar.
- Med användning av en fresh glas pasteurpipett dra 5 ml vätska (innehållande dissekerade maskar, PFA och 1x PBS-T) från klockan glasskål i pasteurpipett och överföra innehållet i en ny 5 ml glas koniska rör.
- Centrifugera de koniska rör för 30 sek i en klinisk centrifug vid 1000 x g. Använd glas Pasteur pipetter och koniska rör som dissekerade gonads hålla sig till plast.
- Avlägsna och kassera supernatanten tar hand för att inte störa de dissekerade djur. Avlägsna vätskan efter varje tvätt från det koniska röret under ett dissektionsmikroskop för att inte påverka de dissekerade gonaderna, och minimera deras förlust.
- Med hjälp av en ny pasteurpipett, tillsätt 5 ml 1x PBS-T till koniska rör. Centrifugera de koniska rör i en klinisk centrifug under 30 s vid 1000 x g. Avlägsna och kassera supernatanten tar hand för att inte störa de dissekerade djur.
- Upprepa steg 3,7 för totalt tre gånger.
- Med hjälp av en ny pasteurpipett, tillsätt 2 ml av 100%metanol till rören och blanda försiktigt könskörtlar med metanol genom att dra upp i pasteurpipett. Inkubera röret vid -20 ° C under minst 1 h.
NOT: Dissekerade gonader kan lagras i metanol under upp till 2 dagar för dpERK färgning. Förvaring för mer än 2 dagar och upp till två veckor är kompatibel med andra antikroppsfärgning tillämpningar, såsom anti-Lamin antikropp, men inte med dpERK antikroppen. - Efter den önskade inkubationstiden, upprepa steg 3,7 för totalt tre gånger för att tvätta könskörtlarna. Inte virvel rören under tvättar. Efter den slutliga tvätten lämna 500 mikroliter av 1 x PBS-T i 5 ml koniska rör.
- Med användning av en färsk pasteurpipett överför innehållet i den koniska glasrör i en färsk 1 ml glasrör (6 mm x 50 mm). Låt dissekerade djur att reglera genom gravitationen för 5-10 min.
- Med användning av en färsk pasteurpipett och under ett dissektionsmikroskop, ta bort så mycket av tvätt som möjligt från 1 ml glasrör witHout störa dissekerade könskörtlarna.
4. Blockering och primärantikroppsbehandling
- Tillsätt 100 mikroliter av 30% normalt getserum (NGS) utspädd i 1 x PBS-T (se Material tabell) till de dissekerade djur i 1 ml glasrör. 30% NGS fungerar som blockerande buffert. Täck röret med Parafilm för att undvika avdunstning av vätskan. Inkubera vid RT i 1 h eller vid 4 ° C över natten.
- Efter att den önskade tiden för inkubation, ta bort den blockerande buffert med användning av ett färskt pasteurpipett, ta bort så mycket vätska som möjligt. Använd en dissekera mikroskop för att se till att könskörtlarna inte är upprättad i pasteurpipett.
- Späd MAPKYT antikropp (se Material tabell, som avses i denna metod som dpERK) vid 1: 400 i 30% NGS. Förbered tillräckligt antikroppsutspädning att använda 100 mikroliter per rör. Oanvänd, utspädd antikropp kan förvaras vid 4 ° C i en vecka.
- Tillsätt 100 | il av den utspädda anti dpERK antikropp sålution till 1 ml glasrör som innehåller dissekerade djur. Täta rören med Parafilm. Inkubera rören vid 4 ° C över natten.
- Efter inkubation över natten, tillsätt 800 | il av 1x PBST till rören vid RT.
- Dra provet upp i en färsk glas pasteurpipett och släpp försiktigt för att säkerställa att gonaderna är jämnt suspenderade i 1 x PBS-T. Låt gonaderna sedimentera till botten med gravitationen. Avlägsna supernatanten. Detta säkerställer att dissekerade gonaderna tvättas men inte skadas under processen.
- Upprepa steg från 4,5 till 4,6 för totalt tre tvättar. Inte virvel rören under tvättar. Efter den tredje tvättningen vara noga med att ta bort och kassera så mycket supernatant som möjligt utan att störa dissekerade djur. Säkerställa att en färsk pasteurpipett används varje gång.
5. sekundär antikropp Behandling
- Under den primära antikroppen förbereda tvättar utspädning för den sekundära antikroppen. Späd anti-mus och för sigcondary antikropp 1: 500 i 30% NGS. Som med den primära antikroppen, använd 100 mikroliter per rör. Oanvänd antikropp kan förvaras vid 4 ° C i en vecka.
- Tillsätt 100 mikroliter sekundär antikropp lösning till 1 ml glasrör som innehåller dissekerade djur. Täck varje rör med Parafilm, och sedan linda rören i aluminiumfolie för att hålla innehållet i röret i mörker. Inkubera rören vid RT under 2 h, eller alternativt vid 4 ° C över natten.
- Efter att den önskade tiden för inkubationen, till 800 mikroliter av 1 x PBS-T till rören och upprepa steg 4,5-4,6 för totalt tre gånger. Efter den slutliga tvätten, ta bort och kasta så mycket av supernatanten som möjligt under ett dissektionsmikroskop med användning av en färsk pasteurpipett.
- Förbered DAPI-lösning under de tvättar för den sekundära antikroppen. Späd 1 mikroliter av DAPI (från en 1,000x lager av 1 mg / ml lagrades vid -20 ° C) in-1 mL 1x PBST.
- Tillsätt 800 mikroliter av den utspädda DAPI-lösning till rören innehållande dendissekerade djur. Täcka mynningen av röret med Parafilm, och linda varje rör i aluminiumfolie. Inkubera vid RT i 20 min.
- Efter inkubationen med DAPI, ta bort så mycket av DAPI-lösning som möjligt med en färsk pasteurpipett, under ett dissektionsmikroskop för att inte störa de dissekerade djur.
- Lägga en droppe monteringslösning till rören. Wrap varje rör i aluminiumfolie.
OBS: För att visualisera dpERK färgning bör färgade könskörtlar monteras för mikroskopi omedelbart. För andra applikationer antikropp, såsom fosforylerad serin 10 Histon H3, kan könskörtlar hållas i monterings media för upp till 2 veckor vid 4 ° C i mörker.
6. Montering Slides och Imaging
- Lägg ett lager av lab tejp på längden, på toppen av två objektglas (25 mm x 75 mm x 1 mm) som visas i figur 3. Placera en ny rent glas objektglas i mellan de två tejpade bilder.
OBS: Tjocklekenav bandet hjälper till att generera en agarosen pad på mitten bilden. Tjockleken på agarosen pad är nästan lika med den hos bandet, när tejpen fungerar som ett distanselement för att skapa agarosen pad. - Drop ~ 200 mikroliter av smält 2% agaros (gjord i destillerat vatten) på objektglas i mitten. Snabbt placera en ny ren bild, vinkelrätt mot och på toppen av agarosen.
- Låt agarosen ÖVERFÖRA TILL FAST FORM (1 - 2 min).
- Ta bort den övre objektglas mycket försiktigt, så att agarosen pad inte förstörs. Agarosen pad kan sitta kvar antingen toppen eller botten bilden. Det spelar ingen roll vilka glider agarosen pad förblir fäst vid, så länge det är en slät yta av agaros.
- Med hjälp av en pasteurpipett överföra dissekerade djur på agarosen pad. Ta bort överflödig vätska från bilden med hjälp av en pasteurpipett under ett dissektionsmikroskop.
- Använda en ögonfrans hår eller fint dras kapillär, tryck könskörtlarna och tarmar ensätt från varandra för att sprida gonaderna ut på objektglaset.
- Täck objektglas med en 24 mm x 50 mm storlek täckglas. Vara noga med att se till att täckglaset sänkes försiktigt på objektglaset med minimala luftbubblor bildas mellan täckglas och objektglaset.
- Lagra vid 4 ° C över natten i en glidlåda (ett opakt glidlåda med sliderna ligger platt, täckglas upp) för att tillåta överskottsvätska att avdunsta och gonader för att bli något tillplattad (på grund av vikten av täckglas på gonaderna). Den lilla flackare könskörtlarna ger bättre avbildning av en annars runt gonadal rör.
- När täckglaset är monterad, inte för att applicera tryck på toppen av täckglas med fingrarna. Ofta resulterar detta i en snedvridning av könskörtlarna och förlust av dpERK signalen.
- Platta gonaderna natten bara för en mer effektiv avbildning. Objektglasen är klara för att visas så snart de är hopsatta. Att omedelbart ta bilder, försiktigt absorberaöverflödig vätska mellan täckglas och objektglaset från hörnen med en ren lab vävnad.
- Efter natten period, täta bilden och täckglas med genomskinlig nagellack täck på de fyra hörnen av täck och glid gränsen. Nagellack / täck tätning säkerställer att täck inte rör sig medan avbildning och skyddar mot förstörelse av proverna.
- Bild gonader med mikroskop vid 63X. Men objektiv och mikroskop kan varieras baserat på tillgängligheten av mikroskop och användarprogram. Eftersom storleken på hela gonad från proliferativa regionen oocyterna är större än vad som kan fångas i en bild, är bilderna tas som ett montage med överlappande gränser som visas i 4. Figur 11-14, 18.
- I många fall, redigera slaktkroppen efter den slutliga bildgivande och montering, så länge inga större ändringar görs på könscellinjen bilden. store than råbilder längs den sammansatta bilden för att möjliggöra jämförelser av "före" montering / redigering och "efter" montering / redigering av bilderna.
OBS: mikroskopiska bilder får inte ändras för signalstyrka eller mättnad under monteringen av montage.
- I många fall, redigera slaktkroppen efter den slutliga bildgivande och montering, så länge inga större ändringar görs på könscellinjen bilden. store than råbilder längs den sammansatta bilden för att möjliggöra jämförelser av "före" montering / redigering och "efter" montering / redigering av bilderna.
Representative Results
I WT vuxna hermafroditiska djur är dpERK typiskt visualiseras i mitten pachytene region, zon 1, och i de mest mogna ägg från -1 till -4 eller -5 (zon 2). Störningar i denna aktiveringsmönster spegla förändringar i signalväg. Kvinnliga germlines inte anger sperma, och därför inte visa aktivering av ERK i zon 2, med endast svag aktivering i zon 1. Dessa representeras i figur 5.
Figur 1: C. elegans nedärvda morfologi. Differential Interference kontrast (DIC) bild av en vuxen hermafrodit med en U-formad gonad arm skisseras med den vita linjen. Den vuxna hermafroditiska gonad innehåller mitotiska celler vid den distala spetsen. De mitotiska cellerna anger meios och framsteg genom meiotisk profas (pachytene) utvecklas till mature ägg i den proximala gonad. Zon 1 och zon 2 märke stereotypa lokalisering av dpERK i en vuxen hermafroditiska gonad. Skala:. 20 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Demonstration av nålpositioner under dissektioner vänster. Fotografera av en dissektion i processen. Till höger:. Nålpositioner med hänvisning till masken Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Demonstration av Agarose preparatet. (A) Placera en tejp lengthwise över 2 rena objektglas. Placera en ny ren objektglas mellan de två bilder med bandet som visas. De tre bilderna är bredvid varandra i längdriktningen. (B) Lägg smält agaros till bilden i mitten. (C) Placera en ny objektglas vinkelrätt mot, och ovanpå den mellersta bilden, bär droppe agaros. ( D) Låt agarosen stelna. (E) Ta bort den övre glid lämnar bakom den stelnade agarosen pad. Använd den nedre bilden med agarosen pad för montering dissekeras och färgade germlines. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Imaging Slides som Montage Montage av en vild typ könsceller med DAPI (t.op) och dpERK (botten) kanal. Bilder tagna vid 63X med överlappande gränser, var vita lådor för panel A och B och gröna rutor för panel B och C. DAPI och dpERK bilder för varje panel tas samtidigt i två olika kanaler. Den sammansatta bilden visas i figur 5A. Skala bar:. 20 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Dynamisk Temporal / Spatial Aktivering av ERK. (AC) WT (N2) vuxen (24 timmar tidigare mid-L4 utvecklingsstadium) hermafroditiska germlines färgade för DNA (B, DAPI, vit) och dpERK (C, röd). Den dpERK signalen i zon 1, den pachytene regionen, och zon 2, de mogna oocyter markeras. (DF)dimma-2 (oz40) kvinnliga germlines (vid 8 h förbi mitten L4 utvecklingsstadium) färgade för DNA (E, DAPI) och dpERK (F). Unga kvinnliga germlines visa svag dpERK i zon 1, och i en enda oocyt i en spermie oberoende sätt. Zon 2 är spermier beroende, och därmed saknas i den kvinnliga könsceller. Skala bar:. 20 pm klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Aktiv ERK (dpERK) följer en stereotyp rumslig och dynamisk lokaliseringsmönster i C. elegans arvslinje. Detta stereotypa dpERK rumsliga mönstret (figur 5), och amplitud hos en vuxen C. elegans gonad, kan effektivt korreleras med de många biologiska processer som ERK reglerar. Till exempel, en oförmåga att aktivera ERK i zon 2 resulterar i ett gripande i oocyter i profas av meios, en fenotyp observerats hos kvinnliga germlines som inte anger sperma, och därför inte aktiverar ERK i mogna ägg (Figur 5). Parning med hanar resultat i effektiv ackumulering av dpERK i zon 2 i den kvinnliga germlines 11,13, tillsammans med uppkomsten av äggcellen mognad och ägglossning. Således analys av rumsliga mönster och tids aktivering av dpERK på vissa genetiska störningar (t.ex. RNA-interferens medierad geninaktivering) eller kemiska behandlingar möjliggör identifiering av faktorer som förordsen ERK signaleringen och därmed ERK beroende biologiska processer. Sådana analyser möjliggör också upptäckten av nya genetiska interaktioner mellan signalvägar.
En kritisk flaskhals för varje avbildning baserad analys är tillgången på funktionella reagens såsom antikroppar som är specifika för ansökan. Om en sådan reagens existerar sedan metoder såsom den som beskrivits ovan kan lätt anpassas för analys av lokalisering mönster för vilket protein som helst av intresse. Ansökan är således begränsad av tillgången på en fungerande antikropp. Dessutom, eftersom metoden beskriver dissekering och färgning vid en given utvecklings tid, endast gör det möjligt att fånga information i en tidsram, och inte belysa dynamiken eller protein reglering i realtid eller hastigheten av proteinomsättningen.
Den ovan beskrivna metoden är anpassad från Francis et al. 23, som är skild från den Seydoux och Dunn metod 24 för gonad extrudering och antikroppsfärgning. Metoden bygger på Francis et al. Kommer att kallas "suspensionsmetoden" och Seydoux och Dunn metod som kallas "frys sprickbildning metod" för jämförelse. Upphängnings Metoden har varit mycket effektiva i våra händer för att erhålla reproducerbara lokaliseringsmönster signalmolekyler som dpERK, som till sin natur är mer känsliga för hårda hantering. När det gäller dpERK lokalisering, i vår erfarenhet, är signalen i zon 1 praktiskt taget omöjlig att upptäcka med frys sprickbildning metoden. Dessutom provtorkning, som ofta kan förekomma med den fryst sprickbildning metod, resulterar i falska signaler antikropps. Suspensionen metod minimerar prov torkning, eftersom gonaderna suspenderas i vätska under hela processen. Vi finner också att upphängnings metoden är användbar för att avbilda flera olika genotyper på en enda bild. Till exempel, om två genotyper, såsom hermafroditer vshonor är att direkt jämföras för dpERK lokalisering, de två genotypema kan blandas samman och bearbetas. Detta är möjligt eftersom de fenotyper är distinkta och kan urskiljas via DAPI morfologier. Färgning i samma rör följt av avbildning på samma glas möjliggör direkt jämförelse mellan könskörtlarna från olika genotyper. Alternativt, om DAPI morfologier inte kan särskiljas, då kan antas en tvåstegs antikroppar färgning. Först varje enskild genotyp behandlas med två olika antikroppar, antikropp A för WT och antikropp B för mutant (båda antikropparna måste höjas i en värd som skiljer sig från den dpERK antikropp). När väl de två genotyper har färgats med den primära antikroppen, och tvättas, kan de blandas samman i ett rör och nu färgades med dpERK antikropp, följt av en sekundär antikroppsbehandling för att visualisera alla antikropparna i röret. En möjlighet att jämföra olika genotyper på en enda bild, speciellt när deductions av aktiveringsmönster görs säkerställer korrekta tolkningar som inte påverkas av distinkta färgningsförhållanden.
Medan fördelaktig, det finns flera steg i hela upphängningsmetod som kräver noggrann hantering. Det är viktigt att de dissektioner uppträder på ett tidseffektivt sätt; viktigare, bör de dissektioner inte ta över 5 min. Längre dissektion gånger resulterar i variabel dpERK signal, som ofta kan misstolkas som reglerade förändringar i ERK aktivering, snarare än som tekniska fel. Det är viktigt att börja med över 100 till 150 djur för varje dissektion eftersom hela olika tvättsteg könskörtlar kan lätt förloras från rören på grund av pipetteringsfel. Förlust av könskörtlar kan minskas antingen genom att dissekera i flera små partier (t.ex. tre partier av 50 djur vardera) som kan kombineras, eller genom att dissekera en stor sats av 150. En annan utmaning är att få könskörtlarna att ligga i en väl fördelade bildningpå objektglaset, så att hela distala gonad kan avbildas. För att möjliggöra detta, använda en ögonfrans på en tändsticka eller en drog pipett till rymden ut könskörtlarna. Emellertid bör man vara noga med att inte skada gonaderna under denna process. Ofta med dessa tekniker tar det flera försök att bemästra de dissektioner samt arrangemang i könskörtlarna på bilderna.
När denna teknik har bemästrat, tjänar den som en kraftfull metod för varierande biologiska analyser, och kan användas för att studera mer än bara dpERK nivåer. Exempelvis kan denna metod användas för att visualisera aktiva p38 nivåer, eller aktiva CDK nivåer, eller vilket protein som helst för vilken en antikropp-reagens existerar. Dessutom kan förfarandet vara kopplad med en kemisk inhibering skärmen i hela djur för analys av nya inhibitorer eller aktivatorer av reaktionsvägen, via analys med avseende på dpERK nivåer. Detta kommer att möjliggöra en in vivo avläsning av både reaktion och känslighet för de hämmare som kan interact med RTK-RAS-ERK signalväg. Dessutom kan denna metod användas i antikroppskombinationer med ett flertal signalutgångar som alla kan användas och visualiseras på en gång. Använda flera antikroppar medger korrelation mellan flera vägar, deras aktiveringsstatus, och utfall alla inom samma vävnad, vilket möjliggör en bättre förståelse av dessa interaktioner. Dessa är bara några exempel på ytterligare tillämpningar av denna metod, men detta system kan modifieras för att studera flera forskningsintressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution |
| Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass because dissected gonads often stick to plastic |
| 25 G needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| Syringes (could be 1 or 5 mL) | BD Syringes | 1 mL: BD 309659 | |
| Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
| Coverslips (24 x 50 mm) | Corning | 2935-245 | |
| 5 mL glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
| 9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Clinical bench top centrifuge | |||
| Glass tubes (6 x 50 mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
| *M9 solution | |||
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
| 1x PBS-T | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBS-T |
| MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
| Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| *M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. | ||
| **PBS (1x) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L | ||
| Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. |
References
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
- McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
- Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
- Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
- Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
- Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
- Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
- Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
- Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
- Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
- Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
- Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
- Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
- Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
- Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
- Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
- Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
- Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
- Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
- Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).
