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Developmental Biology

Analyse spatiale et temporelle d'Active ERK dans le Published: November 29, 2016 doi: 10.3791/54901
Automatic Translation
1, 1,2
1Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine, 2Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center

Summary

Nous proposons une méthode basée sur la formation d' image par immunofluorescence pour la localisation spatiale et temporelle de ERK actif dans le disséqué C. gonades elegans. Le protocole décrit ici peut être adapté à la visualisation de toute signalisation ou d'une protéine structurelle du C. elegans gonades, pourvu d' un réactif d'anticorps convenable est disponible.

Abstract

Le signal extracellulaire évolutivement conservée transduction voie RTK-RAS-ERK est une importante cascade de kinases de signalisation qui contrôle les processus cellulaires et de développement multiples principalement par l' activation de ERK, la kinase terminale de la voie. réglementation stricte de l'activité ERK est essentielle pour le développement normal et l'homéostasie; résultats ERK trop actifs dans la prolifération cellulaire excessive, tandis que underactive ERK provoque la mort cellulaire. C. elegans est un système modèle puissant qui a aidé caractériser la fonction et la régulation de la voie de signalisation RTK-RAS-ERK au cours du développement. En particulier, la voie RTK-RAS-ERK est essentielle pour C. elegans développement de la lignée germinale, qui est l'objet de cette méthode. En utilisant des anticorps spécifiques à la forme active, diphosphorylé de ERK (dpERK), le modèle de localisation stéréotypée peut être visualisé au sein de la lignée germinale. Parce que ce modèle est à la fois spatialement et temporellement controlled, la capacité de dosage reproductible dpERK est utile pour identifier les régulateurs de la voie qui affectent dpERK la durée du signal et de l'amplitude et le développement ainsi germinale. Ici , nous démontrons comment réussir à disséquer, tache, et l' image dpERK dans le C. gonades elegans. Ce procédé peut être adapté pour la localisation spatiale d'une signalisation ou d'une protéine structurale du C. elegans gonades, fourni un anticorps compatible avec immunofluorescence est disponible.

Introduction

Le récepteur de la tyrosine kinase (RTK) -Rat Sarcome (RAS) de signal -Extracellular Regulated Kinase (ERK) , de la voie relaie des signaux extracellulaires à travers une cascade de kinase conservée qui se traduit par la phosphorylation et l' activation de ERK 03/01. Les protéines ERK sont membres du conservée de sérine / thréonine MAP-proline dirigée (Mitogene protéine activée) de la famille des kinases, et sont directement actionnés par MEK par l' intermédiaire d'une phosphorylation double de la thréonine (T) et la tyrosine (Y) du motif TEY conservé. ERK actif (appelé diphosphorylé ERK ou dpERK) régule ensuite de nombreux processus cellulaires et de développement par sa phosphorylation d'une pile de substrats en aval 1-3. Ainsi , l' activité de ERK anormale conduit à de nombreuses cellules et les défauts de développement 4-7.

Une réglementation stricte de l'activité ERK est essentielle pour le développement normal: dans les systèmes mammifères trop d'activité ERK entraîne excessive de premier plan de la prolifération cellulaireà la croissance tumorigène; trop peu d' activité conduit à la mort cellulaire 4,6. En outre, les variations de la durée de l' activité ERK peuvent également conduire à des résultats distincts: dans les cellules PC12, l' activation ERK pendant 30 minutes ou moins induit la prolifération cellulaire, mais l' activation ERK pendant 60 minutes ou plus induit une différenciation neuronale 8,9. réglementation stricte de l'activité ERK est donc clairement essentiel pour le développement normal et l'homéostasie.

C. elegans est un système de modèle puissant et génétiquement malléable pour disséquer la fonction et la régulation de la voie de signalisation RTK-RAS-ERK 3,10-15. Par rapport aux systèmes de mammifères, qui contiennent de multiples gènes pour la RAS et ERK, C. elegans contient un gène RAS (let-60) et d' un gène de ERK (MPK - 1), ce qui rend ce système génétiquement plus facile à disséquer , dans lequel la fonction de cette voie 3,10-14. C. elegans germinale est essentiellement un tube qui consiste en mitosedes cellules souches , à son extrémité distale et d' ovocytes matures , à son extrémité proximale (figure 1) 16. Les cellules germinales initient la méiose juste en amont de la zone de mitotique distale, et le progrès à travers une prophase méiotique prolongée (pachytène), après quoi ils commencent à se former dans des ovocytes de la région de boucle, finalement subir la maturation ovocytaire dans la région proximale 16.

Les études génétiques provenant de plusieurs laboratoires, dont le nôtre, ont montré que la voie RTK-RAS-ERK est essentielle pour le développement de la lignée germinale en C. elegans 12,13,15,17-19. Plus précisément, nous avons constaté que les contrôles de ERK et coordonnées au moins neuf processus biologiques distincts au cours du développement de la lignée germinale, allant des commutateurs de développement tels que l' apoptose des cellules germinales à la cellule processus biologiques tels que 11,18 de croissance de l' ovocyte. Tout comme dans les systèmes de mammifères, trop d' activité ERK dans le C. elegans résultats germinales dans la production de plusieurs petits ovocytes, tandis que trop lirésultats de l' activité TTLE dans une grande ovocyte 11. Ainsi une réglementation stricte des dpERK est essentielle pour le développement de la lignée germinale normale. La forme active de ERK, comme visualisé par un anticorps spécifique de dpERK, affiche une dynamique modèle stéréotypé, bimodal localisation: dpERK est élevé au cours de la mi-pachytène (Zone 1, Figure 1), faible dans la région de la boucle et haute de nouveau en maturité oocytes (zone 2, figure 1). Récemment, nous avons constaté que la nutrition agit à travers le facteur de croissance de l' insuline-like receptor-1 (daf-2) pour activer ERK dans la zone 1 12; les travaux antérieurs ont montré que le signal de spermatozoïdes (via le récepteur tyrosine kinase éphrine) active ERK dans la zone 2 13.

Étant donné que les fonctions ERK actifs comme un rhéostat dans la lignée germinale pour réguler la croissance de l'ovocyte, la localisation spatiale et temporelle, ainsi que l'amplitude des dpERK, est la clé de la compréhension de son aboutissement normal de signalisation. Utilisation de la méthode décrite ici, les changements dans lalocalisation stéréotypée de dpERK peut être facilement contrôlé et les prévisions dérivées sur l'impact des perturbations environnementales ou génétiques sur l'activité de ERK et donc la fonction. Ainsi, le dosage de dpERK permet une compréhension globale de son rôle au cours du développement de la lignée germinale.

Protocol

Le protocole décrit ici est surtout pour le système modèle invertébré C. elegans, et suit toutes les règles éthiques fixées par l'institution.

1. Entretien des animaux

  1. Maintenir C. elegans travail cultures mères sur nématode croissance moyenne 20,21 (NGM, voir Matériaux Table) gélose ensemencée avec E. coli OP50.
  2. Maintenir les stocks de vis sans fin à des températures entre 16 ° C et 25 ° C.
    NOTE: La culture des vers à des résultats plus élevés des températures dans le taux de croissance plus rapide, souvent, le développement de la lignée germinale aberrante et taille des couvées inférieurs. En outre, les génotypes sensibles à la température affichent des phénotypes différents à différentes températures.
  3. Transfert vers de nouvelles plaques NGM tous les 2 - 3 jours en fonction de leur taux de croissance de manière à maintenir un approvisionnement constant de vers bien nourris.
    NOTE: Pour toute expérience donnée impliquant des niveaux dpERK, les vers ne doivent PAS être obtenus à partir d'un mort de faim ou de fouleplaque ed. Surpeuplement ou impacts de famine signalisation de l' insuline dans les vers 22 et signalisation de l' insuline régule ERK 12 activité. Ainsi les vers de plaques affamés ou surpeuplés se traduira par des motifs de coloration variables et difficiles à reproduire.

2. Dissection des adultes Worms pour l'obtention gonades

  1. Choisir 100-150 WT (N2) ou le génotype désiré de vers au stade de développement souhaité et spécifique (L1, L2, L3, L4, adultes, etc.) Dans 100 pi de tampon M9 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  2. Remplissez le tube de microcentrifugation avec 900 ul de tampon M9 (voir le tableau Matériaux). Centrifuger les tubes à 1 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 minute à température ambiante.
  3. Retirez délicatement 900 ul du tampon M9 et le jeter. Retirer le tampon sous un microscope à dissection pour faire en sorte que les vers soient pas accidentellement enlevés.
  4. Répétez les étapes 2.2 - 2.3 plus de deux fois avec frais M9 tampon à chaque fois.Cela garantit que toutes les bactéries qui ont été reportés avec les vers sont efficacement éliminées.
  5. Après le lavage final supprimer 900 ul de tampon M9 du tube et défausse.
  6. Transférer 100 ul de M9 tampon restant contenant les 100 - 150 vers avec une pointe de 200 pi-micropipette à un fond plat de montre en verre plat. Assurez-vous que la pointe de la micropipette est coupé à la marque de 10 pi avant utilisation. Non coupe la pointe se traduira par cisaillement des vers.
  7. Ajouter 1 - 3 pi de 0,1 M lévamisole à la boîte de montre en verre contenant les vers dans le tampon M9. Agitez doucement le lévamisole et le M9 pour permettre même mélanger jusqu'à ce que les vers cessent de bouger.
    NOTE: les stocks levamisole peut être stocké à -20 ° C pour le stockage à long terme. Ici, utiliser la plus forte concentration de 1 - 3 mM que ce qui a été décrit dans la littérature 23 de 0,2 - 0,25 mM de levamisole afin d'obtenir une perte rapide de la mobilité chez les animaux. Si les animaux écorchent autour de trop long dans la suspension liquide, les motifs résultant de dpERK dans les gonades peuvent être variables (à cause du stress ou le manque de nutrition ou les deux). motifs de coloration plus reproductibles ont été obtenus avec 1-3 lévamisole mM pour la dissection.
  8. Fixez les deux 25 aiguilles G à deux seringues 1 ml (la taille de la seringue n'a pas d'importance, la jauge de l'aiguille est critique). Position une seringue dans chaque main (Figure 2).
  9. Sous un microscope à dissection, positionner chaque aiguille sous et sur chaque vis sans fin comme le montre la figure 2 et placez une coupe fine sur le ver près de la deuxième ampoule pharyngée dans un mouvement de ciseaux. Après une coupe dans le ver de passer à l'animal suivant jusqu'à ce que tous les animaux dans le plat ont été coupés au moins une fois.
    NOTE: Soyez conscient que les étapes 02.08 à 02.09 sont sensibles au temps. Disséquer tous les vers dans le plat en moins de cinq minutes pour un motif de dpERK reproductible. De plus longs temps de dissection se traduira par une rotation hors du signal dpERK, en particulier dans Zun 1. Régler le nombre de vers par tour de dissection (c. -à- 50 vers vs. 150) si nécessaire pour rester dans le délai imparti.
    1. Dans le cas où un gonades extrudé est pas visible lors de la dissection, ne pas essayer une autre coupe dans le même animal. Habituellement, cela ne fera que cisailler l'animal et non se traduire par extrusion de la gonade. Au lieu de cela, passer à l'animal suivant. Worms où les gonades n'extruder pas apparaîtront en tant que telle sur les diapositives qui seront apportées à l'article 6 et peuvent être ignorées lors de l'imagerie
      NOTE: Grâce à l'ensemble de la dissection et les étapes de traitement, il est important de garder à l'esprit que la gonade restera attaché au corps / carcasse. Ne pas forcer la gonade et le corps à part avec l'aiguille. Souvent, une lacrymaux aberrante dans le tissu gonadique dans une tentative de rompre la gonade du corps peut entraîner des signaux d'anticorps parasite. Le corps / carcasse peuvent être ignorées pendant les étapes d'imagerie (section 6), et seulement la gonade imagés. En outre, sometimes les cellules intestinales peuvent également servir de témoins internes / contrôles somatiques pour l'anticorps en cours d'analyse.

3. gonades Fixation

  1. Après la dissection est terminée, ajouter 2 mL de 3% de paraformaldehyde (PFA) directement à la boîte de montre en verre contenant 100 pi de M9 et les animaux disséqués et couvrir avec Parafilm. Placer le plat recouvert de verre de montre dans une hotte chimique.
    Attention: PFA est un produit chimique dangereux. Ainsi, la fixation doit être réalisée dans la hotte d'aspiration chimique.
  2. Incubation à température ambiante pendant 10 min.
  3. L' utilisation d' un jetable pipette 9 "Pasteur en verre ajouter 3 ml de PBS 1x-T (voir tableau des matériaux) à la boîte de verre de montre contenant les animaux disséqués. Mix en tirant la solution PFA et 1x PBS-T avec les animaux disséqués dans le Pasteur pipette et en relâchant doucement dans le plat de verre de montre. ne pas vortex les tubes pendant les lavages.
  4. L'utilisation d'un freverre sh pipette Pasteur tirer le 5 ml de liquide (contenant des vers disséqués, PFA et 1x PBS-T) de la boîte de verre de montre dans la pipette Pasteur et transférer le contenu dans un nouveau tube mL 5 conique en verre.
  5. Centrifuger les tubes coniques de 30 secondes dans une centrifugeuse clinique à 1000 x g. Utilisez verre pipettes Pasteur et des tubes coniques comme gonades disséquées collent au plastique.
  6. Retirer et jeter le surnageant en prenant soin afin de ne pas déranger les animaux disséqués. Retirer le liquide après chaque lavage du tube conique sous un microscope de dissection afin de ne pas affecter les gonades disséquées, et minimiser leur perte.
  7. En utilisant une pipette Pasteur fraîche, ajouter 5 ml de PBS 1x-T pour les tubes coniques. Les centrifuger les tubes coniques dans une centrifugeuse clinique pendant 30 secondes à 1000 x g. Retirer et jeter le surnageant en prenant soin afin de ne pas déranger les animaux disséqués.
  8. Répétez l'étape 3.7 pour un total de trois fois.
  9. En utilisant une pipette Pasteur fraîche, ajouter 2 mL de 100%méthanol dans les tubes et mélanger doucement les gonades avec le méthanol en tirant dans la pipette Pasteur. Incuber le tube à -20 ° C pendant au moins 1 h.
    NOTE: Dissected gonades peuvent être stockés dans le méthanol jusqu'à 2 jours pour dpERK coloration. Stockage pendant plus de 2 jours et jusqu'à 2 semaines est compatible avec d'autres applications de coloration d'anticorps, tels que les anticorps anti-lamine, mais pas avec l'anticorps dpERK.
  10. Après le temps d'incubation désirée, répéter l'étape 3.7 pour un total de trois fois afin de se laver les gonades. Ne pas vortexer les tubes pendant les lavages. Après le lavage final laisser 500 ul de 1 x PBS-T dans le tube conique de 5 ml.
  11. À l'aide d'une pipette Pasteur fraîche transférer le contenu du tube en verre conique dans un nouveau tube 1 ml en verre (6 mm x 50 mm). Laisser les animaux disséqués à régler par gravité pendant 5 - 10 min.
  12. En utilisant une pipette Pasteur fraîche et sous un microscope de dissection, enlever autant de lavage que possible à partir du 1 mL tubes de verre without déranger les gonades disséquées.

4. Blocage et traitement Anticorps primaire

  1. Ajouter 100 pi de 30% normal sérum de chèvre (NGS) dilué dans 1x PBS-T (voir tableau des matériaux) aux animaux disséqués dans les tubes 1 ml en verre. 30% de NGS sert de tampon de blocage. Recouvrir le tube avec du Parafilm afin d'éviter l'évaporation du liquide. Incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit.
  2. Après le temps désiré d'incubation, enlever le tampon de blocage à l'aide d'une pipette Pasteur frais, enlever autant de liquide que possible. Utiliser un microscope disséquant pour veiller à ce que les gonades ne sont pas établis dans la pipette Pasteur.
  3. Diluer l'anticorps MAPKYT (voir tableau des matériaux, visée à cette méthode comme dpERK) à 1: 400 dans 30% NGS. Préparer suffisamment dilution d'anticorps à utiliser 100 pi par tube. Non utilisé, anticorps dilué peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
  4. Ajouter 100 ul de l'anticorps anti-dpERK dilué de manièrerésolu- aux tubes mL 1 de verre contenant les animaux disséqués. Sceller les tubes avec Parafilm. Incuber les tubes à 4 ° C pendant une nuit.
  5. Après incubation pendant une nuit, ajouter 800 pl de 1 x PBST aux tubes à la température ambiante.
  6. Dessinez l'échantillon dans une pipette Pasteur en verre fraîche et relâchez doucement pour assurer que les gonades sont régulièrement suspendus dans le 1x PBS-T. Que les gonades se déposent au fond avec la gravité. Retirer le surnageant. Cela garantit que les gonades disséquées sont lavés mais pas endommagés pendant le processus.
  7. Répétez les étapes 04.05 à 04.06 pour un total de trois lavages. Ne pas vortexer les tubes pendant les lavages. Après le troisième lavage être sûr d'enlever et jeter autant que possible surnageant sans déranger les animaux disséqués. Assurez-vous que d'une pipette Pasteur frais est utilisé à chaque fois.

5. Traitement secondaire Anticorps

  1. Au cours de l'anticorps primaire lavages préparer la dilution de l'anticorps secondaire. Diluer l'anti-souris seanticorps condaire à 1: 500 dans 30% NGS. Comme avec l'anticorps primaire, utiliser 100 pi par tube. anticorps non utilisé peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine.
  2. Ajouter 100 pi de solution d'anticorps secondaire aux tubes mL 1 de verre contenant les animaux disséqués. Couvrir chaque tube avec Parafilm, puis envelopper les tubes dans une feuille d'aluminium pour garder le contenu du tube dans l'obscurité. Incuber les tubes à la température ambiante pendant 2 h, ou bien à 4 ° C durant la nuit.
  3. Après la durée souhaitée de l'incubation, ajouter 800 ul de 1 x PBS-T aux tubes et répéter les étapes 04.05 à 04.06 pour un total de trois fois. Après le lavage final, enlever et jeter autant de surnageant que possible sous un microscope à dissection à l'aide d'une pipette Pasteur frais.
  4. Préparer la solution de DAPI pendant les lavages à l'anticorps secondaire. Diluer 1 pl de DAPI (à partir d'un 1,000x mère de 1 mg / mL stocké à -20 ° C) in- 1 ml de PBST 1x.
  5. Ajouter 800 ul de la solution diluée DAPI aux tubes contenant leanimaux disséqués. Couvrir la bouche du tube avec du Parafilm, et envelopper chaque tube dans une feuille d'aluminium. Incubation à température ambiante pendant 20 min.
  6. Après l'incubation avec DAPI, enlever autant de la solution DAPI que possible avec une pipette Pasteur frais, sous un microscope de dissection afin de ne pas déranger les animaux disséqués.
  7. Ajouter 1 goutte de solution pour les tubes de montage. Enveloppez chaque tube dans une feuille d'aluminium.
    REMARQUE: Pour visualiser dpERK coloration, les gonades colorées doit être monté pour la microscopie immédiatement. Pour d'autres applications d'anticorps tels que la serine phosphorylée 10 l'histone H3, les gonades peuvent être conservées dans un milieu de montage pendant jusqu'à 2 semaines à 4 ° C dans l'obscurité.

6. Assemblage Diapositives et imagerie

  1. Placez une couche de ruban de laboratoire de la longueur, sur le dessus, de deux lames de microscope en verre (25 mm x 75 mm x 1 mm) comme on le voit sur la figure 3. Placez un propre lame de microscope en verre frais entre les deux diapositives enregistrées.
    NOTE: L'épaisseurde la bande permet de générer un tampon d'agarose sur la glissière centrale. Épaisseur du tampon d'agarose est à peu près égale à celle de la bande, lorsque la bande sert d'entretoise pour créer le coussin d'agarose.
  2. ~ Goutte 200 ul de 2% d'agarose fondu (fabriqué dans l'eau distillée) sur la lame de microscope dans le milieu. Placez rapidement une lame propre et fraîche, perpendiculaire et au-dessus, de l'agarose.
  3. Laissez le Solidifier d'agarose (1 - 2 min).
  4. Retirer la lame de microscope dessus très doucement, de telle sorte que le tampon d'agarose ne soit pas détruit. Le tampon d'agarose peut rester attaché soit en haut ou en bas de la diapositive. Il n'a pas d'importance qui coulissent le pad agarose reste attaché à, tant qu'elle est une surface lisse d'agarose.
  5. En utilisant une pipette Pasteur transférer les animaux disséqués sur le tampon d'agarose. Retirer tout excès de liquide de la diapositive à l'aide d'une pipette Pasteur sous un microscope à dissection.
  6. L'utilisation d'un cheveu cils ou capillaire finement dessiné, pousser les gonades et les intestins d'unchemin d'un autre dans le but de répartir les gonades sur la diapositive.
  7. Couvrir la lame de microscope avec un 24 mm x 50 mm taille lamelle. Prenez soin de veiller à ce que la lamelle est abaissée doucement sur la lame avec des bulles d'air minimal étant formés entre la lamelle et la lame.
  8. Conserver à 4 ° C pendant la nuit dans une boîte de glissement (une boîte de glissement opaque avec les lames à plat, Coverslip up) pour permettre l'excès de liquide à évaporer et gonades pour devenir quelque peu aplatie (en raison du poids de la lamelle sur les gonades). Le léger aplatissement des gonades permet une meilleure imagerie d'un tube gonadique autrement ronde.
    1. Une fois que la lamelle est montée, ne pas exercer une pression sur la partie supérieure de la lamelle avec les doigts. Souvent, cela se traduit par une distorsion des gonades et de la perte du signal dpERK.
    2. Aplatir les gonades nuit seulement pour une imagerie plus efficace. Les lames sont prêts à être consultés dès qu'ils sont assemblés. Pour prendre des photos immédiatement, d'absorber doucementl'excès de liquide entre la lamelle et la lame à partir des coins à l'aide d'un tissu de laboratoire propre.
  9. Après la période du jour au lendemain, sceller la lame et lamelle avec du vernis transparent de finition vernis sur les quatre coins de la lamelle et la limite de la diapositive. Le joint vernis à ongles / lamelle assure que la lamelle ne bouge pas pendant l'imagerie et protège contre la destruction des échantillons.
  10. Image gonades avec un microscope composé à 63X. Cependant l'objectif et objectif de microscope peuvent varier en fonction de la disponibilité des microscopes et l'application utilisateur. Étant donné que la taille de l'ensemble de la région gonadique proliférative des ovocytes est plus grande que peut être capturé dans une image, les images sont prises comme un montage dont les limites se chevauchent comme le montre la figure 4. 11-14, 18.
    1. Dans de nombreux cas, modifier la carcasse après l'imagerie finale et l'assemblage, aussi longtemps qu'aucune des modifications importantes sont apportées à l'image germinale. Magasin til les images brutes le long de l'image assemblée pour permettre la comparaison de l' 'avant' assemblage / montage et 'après' assemblage / montage des images.
      REMARQUE: Les images de microscopie ne doivent pas être modifiées pour la force du signal ou de saturation lors de l'assemblage du montage.

Representative Results

Dans WT adultes animaux hermaphrodites, dpERK est généralement visualisé dans la région mi-pachytène, Zone 1, et dans les ovocytes les plus matures de -1 à -4 ou -5 (Zone 2). Perturbations dans ce modèle d'activation reflètent les changements à la voie de signalisation. Lignées germinales femelles ne précisent pas le sperme, et donc ne pas afficher l' activation de ERK dans la zone 2, avec seulement une activation faible dans la zone 1. Ils sont représentés à la figure 5.

Figure 1
Figure 1: C. elegans image de contraste interférentiel différentiel (DIC) d'un hermaphrodite adulte avec bras gonades en forme de U celle décrite avec la ligne blanche germinale Morphologie.. L'adulte gonade hermaphrodite contient des cellules mitotiques à l'extrémité distale. Les cellules en mitose entrer la méiose et le progrès par la méiose (pachytène) développer en mature oocytes dans la gonade proximale. Zone 1 et Zone 2 marque la localisation stéréotypée de dpERK dans une gonade hermaphrodite adulte. Echelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Démonstration de positions de l' aiguille au cours de dissections Gauche:. Photo d'une dissection en cours. A droite:. Positions d'aiguilles en référence au ver S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Démonstration de Agarose Préparation de la lame. (A) Placez un lengthwis de bandee sur 2 lames de microscope propres. Placez une lame de microscope propre et fraîche entre les deux lames avec le ruban comme indiqué. Les trois diapositives sont à côté de l'autre sens de la longueur. (B) Ajouter fondue agarose à la diapositive dans le centre. (C) Placer une lame de microscope fraîche perpendiculaire à, et au - dessus de la glissière médiane, portant la goutte d'agarose. ( D) laisser l'agarose se solidifier. (E) Retirez le chariot supérieur en laissant derrière le pad agarose solidifié. Utilisez la lame de fond avec le tampon d' agarose pour montage lignées germinales disséqués et colorées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Imagerie du Diapositives comme Montage Montage d'un type germinale sauvage avec DAPI (t.op) et dpERK ( en bas) canal. Images prises à 63X avec chevauchement des frontières, des boîtes blanches pour panneau A et B et les boîtes vertes pour le panneau B et C. Le DAPI et dpERK images pour chaque panneau ont été prises simultanément dans deux canaux différents. L'image assemblée est représentée sur la figure 5A. Barre d' échelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Dynamique temporelle / Activation spatiale de ERK. (AC) WT (N2) adulte (24 heures après l' étape à mi-L4 du développement) lignées germinales hermaphrodites colorées pour l' ADN (B, DAPI, blanc) et dpERK (C, rouge). Le signal dpERK dans la zone 1, la région pachytène et Zone 2, les ovocytes matures est mis en évidence. (DF)brouillard-2 (oz40) lignées germinales femelles (à 8 h passé de la scène mi-L4 du développement) colorées pour l' ADN (E, DAPI) et dpERK (F). Les jeunes femmes affichent lignées germinales faible dpERK dans la zone 1, et dans un seul ovocyte d'une manière indépendante de sperme. Zone 2 est dépendante du sperme, et donc absent dans la lignée germinale femelle. Barre d' échelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

ERK active (dpERK) suit un schéma de localisation spatiale et dynamique stéréotypée dans le C. germinale elegans. Ce modèle stéréotypé dpERK spatiale (Figure 5), et de l' amplitude dans un adulte C. elegans gonades, peut être efficacement en corrélation avec les nombreux processus biologiques qui ERK réglemente. Par exemple, une incapacité à activer ERK dans la zone 2 résultats à une arrestation dans les ovocytes en prophase de la méiose, un phénotype observé dans des lignées germinales femelles qui ne spécifient pas le sperme, et donc ne pas activer ERK dans les ovocytes matures (figure 5). Accouplement avec les résultats de mâles dans l' accumulation effective de dpERK dans la zone 2 dans les lignées germinales femelles 11,13, associée à l' apparition de la maturation ovocytaire et l' ovulation. Ainsi l'analyse des configurations spatiales et activation temporelle de dpERK sur certaines perturbations génétiques (tels que l'interférence ARN médiée par inactivation génique) ou des traitements chimiques permet d'identifier des facteurs qui REGUsignalisation ERK fin et les processus biologiques ainsi ERK-dépendants. Ces analyses permettent également la découverte des interactions génétiques entre les nouvelles voies de signalisation.

Un goulot d'étranglement critique pour toute analyse fondée sur l'imagerie est la disponibilité des réactifs fonctionnels tels que des anticorps qui sont spécifiques à l'application. Si un tel réactif existe alors des procédés tels que celui décrit ci-dessus peut être facilement adapté pour l'analyse du motif de localisation pour toute protéine d'intérêt. L'application est donc limitée par la disponibilité d'un anticorps fonctionnel. En outre, parce que la méthode décrit la dissection et la coloration à un temps de développement donné, il ne permet la saisie des informations dans un laps de temps, et ne jette pas la lumière sur la dynamique ou la régulation des protéines en temps réel ou le taux de renouvellement des protéines.

Le procédé décrit ci - dessus est adapté de Francis et al. , 23, qui est distincte de la Seydoux et Dunn mÉTHODE 24 pour gonades extrusion et la coloration des anticorps. La méthode basée sur Francis et al. Sera appelée la «méthode de suspension" et la méthode Seydoux et Dunn appelé le «gel fissuration méthode" pour la comparaison. La méthode de suspension a été très efficace dans nos mains pour obtenir des modèles de localisation reproductibles de molécules de signalisation telles que dpERK, qui sont par nature plus sensibles aux conditions de manipulation difficiles. Dans le cas de dpERK localisation, dans notre expérience, le signal dans la zone 1 est pratiquement indétectable avec la méthode de gel de craquage. En outre, l'échantillon de séchage, ce qui peut souvent se produire avec le procédé de congélation de craquage, se traduit par des signaux parasites d'anticorps. Le procédé de suspension minimise le séchage de l'échantillon, puisque les gonades sont mises en suspension dans un liquide tout au long du processus. Nous constatons également que la méthode de suspension est utile pour l'imagerie multiples génotypes différents sur une seule lame. Par exemple, si deux génotypes, tels que hermaphrodites vsles femmes doivent être directement comparés pour dpERK localisation, les deux génotypes peuvent être mélangés et traités. Ceci est possible car les phénotypes sont distincts et peuvent être distingués par les morphologies DAPI. Coloration dans le même tube suivi par imagerie sur la même lame permet une comparaison directe entre les gonades de différents génotypes. En variante, si les morphologies DAPI ne se distinguent pas, alors une coloration d'anticorps à deux étapes peut être adoptée. Tout d'abord chaque génotype individuel est traitée avec deux anticorps différents, un anticorps pour un anticorps et WT B pour le mutant (les deux anticorps ont besoin d'être soulevée dans un hôte différent de l'anticorps dpERK). Une fois que les deux génotypes ont été colorées avec l'anticorps primaire et on l'a lavé, ils peuvent être mélangés ensemble dans un tube et maintenant colorées avec l'anticorps dpERK, suivie d'un traitement avec l'anticorps secondaire de visualiser tous les anticorps présents dans le tube. Une capacité à comparer les différents génotypes sur une seule lame, en particulier lorsque deductions des modèles d'activation sont faits assure des interprétations exactes ne sont pas affectées par les conditions de coloration distinctes.

Bien avantageux, il y a plusieurs étapes à travers la méthode de suspension qui nécessitent une manipulation minutieuse. Il est essentiel que les dissections se produisent dans un temps de manière efficace; surtout, les dissections ne devraient pas prendre plus de 5 min. De plus longs temps de dissection se traduisent par signal dpERK variable, ce qui peut souvent être interprété comme des changements réglementés dans l'activation de ERK, plutôt que comme des échecs techniques. Il est crucial de commencer avec plus de 100 - 150 animaux pour chaque dissection, car tout au long des différentes étapes de lavage des gonades peuvent facilement être perdues à partir des tubes en raison d'erreurs de pipetage. Perte de gonades peut être réduite soit en disséquant dans plusieurs petits lots (tels que trois lots de 50 animaux chacun) qui peuvent être combinés, ou en disséquant un grand lot de 150. Un autre défi consiste à convaincre les gonades de se coucher dans un bien espacés formationsur la lame de telle sorte que la totalité de la gonade distale peut être imagée. Pour ce faire, utiliser un cil sur une allumette ou une pipette tiré à l'espace sur les gonades. Cependant, il faut prendre soin afin de ne pas endommager les gonades pendant ce processus. Souvent avec ces techniques, il prend de multiples tentatives pour maîtriser les dissections ainsi que des arrangements des gonades sur les lames.

Une fois que cette technique a été maîtrisé, il sert une méthode puissante pour les analyses biologiques variées, et peut être utilisé pour étudier plus que les niveaux dpERK. Par exemple, cette méthode peut être utilisée pour visualiser les niveaux actifs de p38, ou le niveau de CDK actifs, ou toute protéine pour lequel un réactif anticorps existe. En outre, le procédé peut être couplé à un écran d'inhibition chimique dans des animaux entiers de dosage pour de nouveaux inhibiteurs ou activateurs de la voie, par l' intermédiaire de dosage pour les niveaux dpERK. Ceci permettra une lecture in vivo à la fois la sensibilité à la réaction et d' un inhibiteur qui peut interact avec la voie de signalisation RTK-RAS-ERK. De plus, cette méthode peut être utilisée dans les combinaisons d'anticorps avec de multiples sorties de signalisation qui peuvent tous être utilisés et visualisées en une seule fois. En utilisant des anticorps multiples permet corrélation entre de multiples voies, leur état d'activation, et les résultats tout dans le même tissu, ce qui permet une meilleure compréhension de ces interactions. Ce ne sont que quelques exemples de nouvelles applications de cette méthode, mais ce système peut être modifié pour étudier les intérêts de recherche multiples.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma Inc. A9539 Dissolve 2 g in 100 mL to make the 2% solution
Flat bottom glass watch dish Agar Scientific AGL4161 We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles BD PrecisionGlide 305122
Syringes (could be 1 or 5 mL) BD Syringes 1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisherbrand 12-550-343
Coverslips (24 x 50 mm) Corning 2935-245
5 mL glass conical tube Corning 8060-5
9" disposable Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20D
Clinical bench top centrifuge
Glass  tubes (6 x 50 mm) Fisherbrand 14-958-A
*M9 solution
Levamisole Sigma L9756
3% Paraformaldehyde (PFA) Electron microscopy services 17500 Obtained as 16% solution in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer
1x PBS-T 1x PBS with 0.1% Tween 20
Methanol Electron microscopy services 18510
Normal goat serum (NGS) Cell Signaling 5425 Diluted to 30% in 1x PBS-T
MAPKYT (dpERK) antibody  Sigma Inc. M9692 Dilution 1:400 in 30% NGS
Secondary antibody Invitrogen A-11005 Dilution 1:500 in 30% NGS
DAPI Sigma D9542
Vectashield Vector Labs H-1000
*M9 Buffer Recipe 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. 
**PBS (1x) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2, 0.10 g MgCl2, H2O to 1 L
Nematode Growth Medium (NGM) 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 min. Cool, and add 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1 M MgSO4 and 25 mL of 1 M KPO4. 

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References

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Developmental Biology numéro 117 RAS-ERK, Germinale, des protéines de signalisation immunofluorescence
Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale
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Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial… More

Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. (117), e54901, doi:10.3791/54901 (2016).

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