Summary
ACT-PRESTO (organlara makromoleküllerin aktif netlik tekniği basınçlı ilgili verimli ve istikrarlı transfer) pasif difüzyon veya basınç destekli teslimat temizlenir dokulara hızlı, verimli, ama ucuz doku takas ve hızlı antikor penetrasyon sağlar. Bu yöntemi kullanarak, dokuların geniş bir yelpazede, temizlenmiş birden antikorlar tarafından immunolabeled ve hacim-görüntülü olabilir.
Abstract
kimlik ve organların veya hücresel düzeyde tüm vücut detaylı örgüt keşif biyolojisinde temel sorunlardır. Geçici yöntemler sürecinin her adımında bilgi kaybına üreten önemli bir zaman ve 3D görüntü elde etmek için çaba miktarını ve sağlam dokuyu kesit immunolabeling dahil ve görüntüleme seri-kesitli doku gerektirir. bozulmamış dokusu içinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme için yeni geliştirilen yaklaşımlar, moleküler karakterizasyon proteinlerin etiketleme sınırlı olmuştur. Ancak organ temizlenmesi için mevcut protokoller zor laboratuarda doku temizleme teknikleri uygulamak için yapım, oldukça uzun bir süreç süresi gerektirir. Biz son zamanlarda hızlı ve yüksek tekrarlanabilir bir protokol ACT-PRESTO adlandırılan kurulmuş (bir ctive c rağbet görürdü t echnique- hava basıncı r e fficient ve s masa t ransfer sevinçliBirkaç saat içinde doku temizlenmeye izin verir O rgans) içine makro moleküllerin. Ayrıca, ACT-PRESTO geleneksel yöntemlerle hızlı immün sağlayan ve basıncı veya konveksiyon akımını uygulayarak yoğun oluşturulmuş, kalın örneklerin derin tabakası içine antikor penetrasyonu hızlandırır. Biz elektroforezi kullanılarak lipid kaldırılması suretiyle temizlemek nasıl dokuları, nasıl hazırlanacağını açıklayan ve nasıl bir basınç destekli teslimat bağışıklığı leke. Protokolün hızlılığı ve tutarlılık 3D histolojik araştırma ve hacim bazlı tanıların performansını hızlandırmak olacaktır.
Introduction
Sinirbilimdeki zorluklardan biri nöronal devre kablolama ve bozulmamış beyin dokusu içinde tek tek hücrelerin görselleştirme olduğunu. Yakın zamana kadar, bu şekilde nöronlar arasındaki bağlantıları gösteren dokuların 1) seri bölümlendirilmeleri gerekli; Bu tür akson veya protein gibi spesifik hedefler, 2) Moleküler etiketleme; hesaplamalı diğer kayıtların veya 2D seri görüntülerin 1 uyum yoluyla tüm beyin 3D rekonstrüksiyon ile ve 3) görselleştirme. Bu adımlar, zahmetli olan zaman büyük bir ihtiyaç ve nöronal ağ haritalama son derece zor hale kesit ve etiketleme sırasında bilgi kaybetmek yükümlüdür. Ancak, kesit olmadan sağlam doku görünüm için izin birçok yöntem geliştirilmiştir. Biyolojik dokuların doku temizleme teknikleri 2-10 optik olarak saydam hale getirilebilir. önemli yöntemlerden biri sağlam doku ve sırayla daldırma solüsyonu arasında refraktif indeks farklılıkları azaltmak içinböylece şeffaf doku oluşturma ve derin yapıların gözlem sağlayan sağlam doku ışık saçılmasını azaltmak için. Daldırma çözeltiler bazı tipleri dehidrasyon işlemi sırasında, hızlı fluoresan su verme neden hidrofobik özelliklere sahiptir. Bu nedenle, bu yöntemler zaman 11,12 uzun bir süre boyunca flüoresan görüntüleme ile uyumlu değildir. Yerine hidrofobik reaktiflerin, diğer yöntemler, biyolojik doku 4,6,8 yapısal bilgi ve floresan korumak gibi SeeDB 4 ve Sca l e 6 olarak doku temizleme için hidrofil reaktifleri, kullanın. Bununla birlikte, makro moleküller, antikorlar da dahil olmak üzere, tek başına difüzyon ile sağlam doku çekirdeğini ulaşamaz. Bu nedenle, yoğun dolu dokuların derin bölgelerde hedef moleküllerin ön etiketleme, teknik açıdan zor.
Son zamanlarda geliştirilen doku temizleme yönteminde, berraklık 3, bir hidrojel gömülü biyolojik doku Iakrilamid ile oluşturulan S ve lipidler, sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren çözeltiye altında elektroforez ile ayrılmıştır. Numune daha sonra ışık 3 saçılma azaltmak için uygun yansıtıcı indeks ile bir çözelti içine daldırılmaktadır. Lipid temizleme sistemi, daha sonra ileri CLARITY 13 ve PACT (pasif berraklık tekniği) 10 modifiye edildi. Polimerizasyondan sonra, akrilamid zincirleri hidrojel doku oluşturucu, proteinler ile çapraz bağlanır. Akrilamid ile çapraz bağ olamaz lipid bileşenleri; Bu nedenle, lipidler, SDS-ihtiva eden tampon altında elektroforez ile ortadan kaldırılabilir. Lipidlerin aktif ortadan kaldırılması yoluyla, beyin dokusu belirgin şeffaflık 9 artar. Bununla birlikte, bu yöntemler, serbest difüzyonu ile derin etiketleme imkansızlığını ele alınmamaktadır. Bu sınırlamayı aşmak için, kalın dokuların derin bölüme reaktiflerin aktif ulaşım teknikleri gereklidir.
AÇIKLIK doku takas ve derin doku izin versegörselleştirme, kolay bir veya hızlı bir işlem değildir. Bu bütün bir fare beyin 7,14 temizlemek için birkaç hafta sürebilir. dokuların hızlı temizleme yaşam bilim araştırma veya birim teşhisi için, bazik ya da klinik laboratuar ayarlarına gibi yöntemlerin uygulanması için gereklidir. Mevcut protokolü basınç destekli uygulama immüno-lekeleme ile, biyolojik doku temizleme ve daha sonra da protein tespiti için basitleştirilmiş bir işlem sağlar. Bu görüntüleme yöntemleri ile kombinasyonu ile açılan büyük ve 3D veri işleme sistemlerinin yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme için uygundur.
Protocol
Hayvan deneyleri ilgili tüm devlet ve kurumsal düzenlemelere uygun olmalıdır.
Reaktiflerin 1. Hazırlık
- Hidrojel monomer çözeltisi (A4P0) için: 0.1X fosfat tamponlu tuz 450 mL (PBS) akrilamid 20 gr ekleyin ve 0.1x PBS ile 500 mL göre ayarlayın.
DİKKAT: akrilamid monomerleri toksiktir. Bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket, eldiven ve kapalı parmak ayakkabılar dahil, kişisel koruyucu ekipman ile davlumbaz tüm prosedürleri uygulayın.- Kullanmak davlumbaz altında 50 ml konik bir tüp içinde 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-il) propan] hidrojel monomer çözeltisi 40 mL (A4P0) dihidroklorür, 100 mg eklemek için hemen önce .
- Elektroforetik doku temizleme (VB) tampon için: sodyum dodesil sülfat (SDS) ve deiyonize H2O (DH 2 O) 800 mL borik asit 12.37 g, 40 g ekleyin. NaOH ile 8.5 pH ayarlayın ve ses seviyesini ayarlamakEk DH 2 O. ile 1 L
DİKKAT: SDS bir zararlı kimyasal olduğu; Bu nedenle, dikkatli bir şekilde taşıyın. - Kübik bağlama çözeltisi için: sükroz 250 g üre 125 g ve N, N, N, 125 g dH 2 O 150 mL ', N' -tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin ekleyin ve hacmi getirmek dH 2 O 500 mL
2. Numune Hazırlama ve Fixation
- fare Ötenazi.
- Aynı şırıngada alfaksalondur (1 mg / kg) ve ksilazin (0.5 mg / kg) hazırlayın.
- Intraperitoneal alfaksalondur ve ksilizin karışımı enjekte ve fare için 3 dakika baygın hale gelmesini sağlar.
- anestezi fare artık devam etmeden önce, böyle bir kuyruk tutam gibi ağrılı uyaranlara, yanıt verene kadar bekleyin.
DİKKAT: hayvanları işlenmesi için uygun kurumsal yönergeleri izleyin.
- Transcardially 100 mL% 0.9 NaCl (pH 7.4-7.5) çözümü ile fare serpmek1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 100 mL (PFA) (pH 7.4), 14, ardından (100 U / ml) asıl bulbus olfaktoryusları alındı için heparin ihtiva ederler.
DİKKAT: PFA çözüm toksiktir. PFA çözüm ve sonraki tüm kullanım hazırlanması davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır. - Fare kafasını kesti cilt kadar açık ve küçük makas kullanarak gözler arasındaki kafatası kırmak.
- küçük, kavisli forseps kullanarak kafatası parçalarını çıkartın.
- beyin veya istenilen organları dışarı atın.
- gece boyunca 4 ° C'de post-düzeltme% 4 PFA çözeltisi içinde beyin ve organlar inkübe edin.
NOT: Belirli bölge doku temizleme için, belirli bir bölgeyi incelemek veya doku tespit sonrasında doku kırpın.
DİKKAT: PFA çözüm toksiktir. transcardial perfüzyon ve sonraki tüm fare kontrolü davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile yapılmalıdır.
3. Hidrojel Monomer İnfüzyon ve Polymerization
- hafifçe çalkalanarak, 12-24 saat boyunca 4 ° C 'de A4P0 hidrojel monomer çözeltisi içinde fikse edilmiş organlar inkübe edin.
- Hidrojel doku polimerizasyonu monomer aşılamıştır.
- Hidrojel monomer çözeltisi 5 mL, 10 ml lik yuvarlak dipli tüp örnek aktarın. Parafilm ile yuvarlak alt tüp üst sarın.
- 1 dakika boyunca sıvı içinden nitrojen kabarcıklanarak hidrojel infüzyon bütün fare beyin örneği içeren yuvarlak dipli tüp oksijeni uzaklaştırmak. Hızlı ve sıkıca örnek içeren tüp kapatın.
- 2 saat süre ile bir su banyosunda (37 ° C), tüp aktarın.
- Fazla hidrojel çıkarmak için 0.1x PBS ile kısaca polimerize örnek yıkayın.
DİKKAT: Hidrojel monomerler zehirlidir. Hidrojel monomer ile cilt temasından kaçınmak davlumbaz ve bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket ve eldiven gibi kişisel koruyucu ekipman ile tüm işlemleri gerçekleştirmek için.
NOT: polimerize dokular4 ° C de en az 2 hafta boyunca 0,1 x PBS içeren sodyum azid saklanabilir.
DİKKAT: Sodyum azit yüksek ve akut toksik değildir. Bir yüz maskesi, bir laboratuvar ceket ve eldiven gibi, davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman ile tüm prosedürleri uygulayın.
4. Elektroforetik Doku Takas (ETC)
- Bir doku kaba polimerize örnek aktarın ve ETC odasında doku kap yerleştirin.
- peristatic pompası kullanılarak kullanıcıya tampon ile VB bölmesini doldurmak.
- ETC koşullarını ayarlamak ve VS. çalıştırın Aşağıdaki ayarları kullanın.
- zaman (6.0 saat), pompa hızını (30 rpm) çalıştıran, (1.5 amp), sıcaklık (37 ° C): Bütün organlar için ETC ayarları için, aşağıdaki ayarları kullanın.
- zaman (2.0 saat), pompa hızını (30 rpm) çalışan akımı (1.5 amp), sıcaklık (37 ° C): 1- 2 mm kalınlığında fare beyin dilimleri için ETC ayarları için, aşağıdaki ayarları kullanın.
- aktarım tO 0.1x PBS 45 mL bir 50 mL konik tüp örnek temizlenir. Tüp kısaca sarsıldığında hiçbir kabarcıklar görülür kadar 0.1x PBS ile temizlenir örnek birkaç kez yıkayın (SDS tamamen kaldırılmasını onaylamak için).
ACT işlenmiş Dokuların 5. ile immün
- Fare tüm beyin için: 1 x PBS,% 6 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden bir antikor çözeltisi 3 ml hacminde örnek inkübe% 0.1 Triton X-100 ve% 0.01 sodyum azid (antikor seyreltme çözeltisi) seyreltme hafif çalkalama ile 37 ° C'de 4 gün boyunca tirosin hidroksilaz (TH) antikor 1/500 faktörü. 2. günde sonunda antikor çözüm değiştirin.
- 3 45 mL 0.1x PBS ile bir 50 mL konik tüp içinde örnek yıkayın - 5 saat ve tampon her saat değiştirin.
- Hafif çalkalama ile 37 ° C'de 4 gün boyunca eşek anti-tavşan sekonder antikor 488 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 3 ml hacminde örnek inkübe edin. repl2 gün seyreltilmiş antikor çözümler ace.
- 2 mm kalınlığında dilimlenmiş beyin dokusu: 1-: gece boyunca ya da 1 gün için 37 ° kollajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi bir 0.5- 1 ml hacim olarak örnek inkübe hafif sallayarak ° C.
- 1-2 saat boyunca 0,1 x PBS, 12 ml hacme sahip 15 ml konik bir tüp içinde örnek yıkayın. bir tampon her saat değiştirin.
- anti-tavşan sekonder antikor gece boyunca ya da hafif çalkalanarak 37 ° C'de en fazla 1 gün için Cy3-konjüge edilmiş 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi bir 0.5- 1 mL hacminde örnek inkübe edin.
- 3 0.1x PBS örnek yıkayın - 5 saat; bir tampon her saat değiştirin.
- görüntüleme öncesi, hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 1 st için kübik bağlama çözeltisi, uygun bir miktarda örnek inkübe edin. Taze kübik bağlama çözeltisi ile değiştirin ve ilave bir 1 saat daha inkübe edilir.
NOT: 14 de dahil olmak üzere, fare ACT işlenmiş dokuda iyi çalıştı. Önceden etiketlenmiş doku ACT işlenmiş doku iki florokromların immunolabeling ile birleştirilebilir.
Yoğun Dokuların 6. ile immün (PRESTO)
- Cı-PRESTO
Not: C-SAYGINLIK gibi tüm testis, tüm böbrek ya da daha büyük bir organ küçük bölümler gibi küçük boyutlu örnekleri, için uygundur.- Bir 1.5 ml tüp içine örnek aktarın kollajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 500 ul ekle ve 2 saat boyunca 600 x g'de santrifüj tüpü.
- 30 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleme ile 0.1x PBS ile lekelenmiş numunenin yıkayın.
- 2 saat süre ile 600 x g 'de Cy3-konjüge edilmiş anti-tavşan sekonder antikor ve santrifüj için 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 500 ul ekle.
- 0 ile boyandı örnek yıkayın.30 dakika süre ile 600 x g 'de santrifüj ile 1x PBS ile yıkandı.
- s-PRESTO
Not: S-PRESTO büyük dokular için uygundur.- Bir şırınga (30 ml hacim) hazırlayın ve 3 yollu vana (Şekil 1A) bağlayın. Yüksek basınç şartları (Şekil 1B) için bir tutkal tabancası ile vana Tutkal.
- kapalı valf pozisyonunda 3-yollu vana bağlantılı şırınganın içine örnek aktarmak.
- kolajen tip IV antikor 1/500 seyreltme faktörü ile antikor seyreltme çözeltisi 7 mL - 5 ekleyin. vanasını açarak numune içine antikor çözüm bırakın.
- infüzyon / çekme hareketi için yeterli oda sağlamak için 17-ml pozisyonuna şırınga pistonu ayarlayın. Bu açık valf pozisyonunda yapılabilir. şırınga ayarı bittikten sonra 3 yollu vanasını kapatın.
- Bir şırınga pompası örneğini içeren şırınga koyun. 10 mL / dak enfüzyon / çekme hacmi ve 4- şırıngayla koşulları ayarlamadk sürekli döngü modunda (Şekil 1C) üzerindeki duraklama süresi.
NOT: Bu hedef hacmi (10 ml) ve daha sonra kısa bir duraklama (4 dk) sonra akış değişiklikleri yönünü ulaşıncaya kadar pompa aşılamaktadır. - Oda sıcaklığında (Şekil 1F) 24 saat - 3 için enjektör pompasını çalıştırır.
- 3-yollu vanasını açın ve 0.1x PBS ile çözüm değiştirin.
- şırınga pompası kullanılarak 1 saat boyunca 0,1 x PBS ile iki kez, her zaman lekeli örnek yıkayın.
- Cy3-konjüge edilmiş anti-tavşan ikincil antikoru (1/500 seyreltme faktörü) ihtiva eden antikor seyreltme çözeltisi ile değiştirin ve 3 şırınga pompası çalıştırılır - 24 saat.
- 3-yollu vanasını açın ve 0.1x PBS ile çözüm değiştirin.
- görüntüleme öncesi, hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 1 st için kübik bağlama çözeltisi, uygun bir miktarda lekeli örnek inkübe edin. Taze kübik bağlama çözeltisi ile değiştirin ve ilave bir 1 saat daha inkübe edilir.
7. Benmaging
- Konfokal tabağına etiketli doku yerleştirin ve doku kaplıdır kadar CUBIC montaj çözüm ekleyin. doku üzerinde bir lamel yerleştirin. 10X objektif altında görüntüye doku 14 konfokal mikroskop kullanın.
Representative Results
ACT doku Clearing
Doku temizleme etkileyen önemli bir faktör doku tespit olduğunu. PFA fiksasyon ve akrilamid infüzyon bu protokol ayrı adımlardır. doku aşılanmış hidrojeller çapraz bağlanmış endojen makromoleküller olmasına rağmen dokuya hidrojel polimerizasyon adımından sonra, serbest A4P0 çözeltisi polimerize değildir. Bu nedenle, herhangi bir jel dokular (Şekil 2A) dışında oluşturmalıdır. proteinler ve akrilamid arasında daha az çapraz bağlama ACT prosedürü sonuçları AÇIKLIK protokolüne göre. Bu duruma göre, doku hidrojel örnek için gözeneklidir. Bu özellik, lipid hızlı çıkarma ve makro moleküllerin difüzyon sağlar. 2 saat (Şekil 2B) ve 5 - - fare beyin 1 yeteri 1 içinde temizlendi kalın ila 2 mm kesitleri ETC 6 saat c için yeterliBütün Fare beyinleri (Şekil 2C) learance. Hidrojel aracılı doku temizleme ETC aşamasından sonra doku genişleme kaynaklı, ancak doku yansıtıcı endeksi eşleştirilmiş çözelti içinde özgün boyutuna geri döndü. ACT prosedüründe oluşan doku hidrojel örneği oldukça gözeneklidir ve dolayısıyla küçük bileşiklerin ve makromoleküllerin verimli bir şekilde nüfuz olabilir ve kolay bir şekilde (Şekil 3) yayılır. Tirosin hidroksilaz (TH) ve kollajen tip IV antikoru ile 1 mm beyin kesitleri olan bir 2-saatlik inkübasyondan sonra, ikinci bir antikor ile ardışık 2-saat inkübasyon 500 um derinliğinde dopaminerjik nöronlar etiket için yeterli idi (Şekil 3) .
Presto-Doku ile immün
Yoğun organları genellikle dokulara antikorların nüfuz etki ECM liflerin yüksek konsantrasyonlarda mevcuttur. Dolayısıyla, antikorlar PENETinkübasyondan 12 saat sonra, sadece 20-30 um böbrek dokusu gibi yoğun dokularda bir derinliğe kadar. Bu sınırlamayı aşmak için, biz derin dokulara reaktiflerin teslimat, yani PRESTO (organlara makromoleküllerin etkin ve istikrarlı transferi ile ilgili basınç) (Şekil 4) etkinleştirmek aktif makromolekül penetrasyon yöntemleri tasarlanmış. Antikor çözümleri, bir masa üstü santrifüj ile merkezkaç kuvvetleri (600 xg) uygulaması (merkezkaç PRESTO, c-PRESTO) büyük ölçüde derin dokuya antikor teslim geliştirilmiş (Şekil 5) ile ACT işlenmiş böbrek dokusunun statik inkübasyon ile karşılaştırıldığında. Bu yoğun dokulara Cı-PRESTO prosedür uygulandığında, inkübasyon 3H 300 mikron derin yapıları 250 etiket için yeterliydi. önemli doku zarar vermeden doku bozulmasını geliştirmek için, biz de bir şırınga pompası (şırınga PRESTO, s-PRESTO) ile konveksiyon akımını sağlayan bir makine tasarladı. Bu işlem, benzer şekilde, antikor pe geliştirilmişyonunun pasif difüzyon (Şekil 5) göre.
S-PRESTO cihazının Şekil 1 hazırlanması. C. bir şırınga (30 mi) ve üç yollu musluk. B. üç yollu musluk bağlı ve şırınga yapıştırılmış. Numune, ve antikor çözeltisi ihtiva eden bir şırınga ve şırınga pompa üzerine yerleştirilecek bir şırınga. D. şırınga pompası ve çalışma koşulu kurulumu. E. pompası örnek olarak etiketleme ayıraçları ihtiva eden bir çözelti aşılar. belirlenen hacim, pompalama yön değişikliklerini ulaştı ve zaman belirli bir süre sonra çözümü çeker olduğunda. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fare beyninin Şekil 2. ACT doku temizleme. Polimerizasyon sonra A., ücretsiz A4P0 çözümleri polimerize değildir; doku aşılanmış hidrojeller endojen makromoleküller ile çapraz bağlanma ile jelleştirilebilmektedir edilir. 2 mm kalınlığında beyin dilimleri B. 1- 1 temizlendi - 2 saat ve yansıtıcı endeksi genişleme ve boyut kurtarma ölçüde (RI) -matching çözüm kaydedildi. Tamamen açık beyin için yeterli ETC 6 saat oldu - C. bütün fare beyninin kalınlığı yaklaşık 0,8 cm ve 5'tir. ETC 3 saat sonra olmayan temizlenmiş doku önemli miktarda oluştu. ETC 6 saat ile, ancak, tüm beyin takas ortaya çıkmıştı. ETC tamponunda ACT sonra dokuların rengi beyaz ya da opak. RI ayarı ile, dokular, şeffaf olur. Onu tıklayınızE bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
ACT temizlenmiş fare beyin dokusunda Şekil 3 ile immün. kolajen tip IV ve bir antikor ile boyanmış orta beyin parçası için bir antikor ile boyandı fare beyin korteks gösteren ACT işlenmiş 1 mm fare beyni dilimleri Çıkan hidroksilaz (TH) tirozin. Ölçek çubuğu, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. PRESTO immün yöntemleri. Antikorlar difüzyon ile yoğun dokulara nüfuz edemez. PRESTO immün yöntemleri aktif makromoleküller demlenmeye ve içine reaktifler sunmak için tasarlanmıştır edildiyoğun dokular. Standart bir masa üstü santrifüj (merkezkaç PRESTO, c-PRESTO) kullanılarak merkezkaç kuvvetinin uygulanması belirgin antikorların teslim kolaylaştırdı. Antikor penetrasyonu gelişmiş bir şırınga pompası (şırınga PRESTO, s-PRESTO) ile konveksiyon akımını dozajda. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ACT-temizlenmiş yoğun doku 5. PRESTO immün rakam. Cı-Presto, dokular, primer ve sekonder antikor nüfuz hızlandırmak için standart bir masa üstü santrifüj kullanılarak 3 st için 600 x g'de santrifüjlendi. s-Presto, bir şırınga pompası antikorları sağlamak için kullanılmıştır. , böbrekler ve karaciğer gibi fare organ, kollajen tip IV ile etiketlenmiştir. geleneksel yöntemler, 3 saat ile karşılaştırıldığındaC ya da s-SAYGINLIK belirgin markalama derinliğini artırır. 50 um (sol) - Kontrol numuneleri yalnızca 40 derinlikte etiketlenirken, PRESTO örnekleri (sağ) 350 um ya da daha derin - böbrek ve karaciğerde, Z ekseni derinliği 300 ulaşır. 3D yeniden görüntü konfokal mikroskop ile elde edilmiştir. Ölçek çubuğu, 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
dokulara yoksul tespit veya hidrojel daldırma proteinlerin kaybı ve doku temizleme işlemi sırasında doku bozulmalarına neden olabilir. hafifçe çalkalanarak 18 saat - tüm yetişkin fare beyni 12 hidrojel monomer çözeltisi 20 ml minimum hacimde daldırma izledi, bir gece boyunca 4% paraformaldehid inkübe edilmelidir. beyin dilimleri ve omurilik gibi insan dokusu da dahil olmak üzere geniş bir doku için, gerekli olan hidrojel monomer çözeltisi içinde ıslatma süresinden genişletilmiş. doku fiksasyon ve polimer infüzyon adımlar ayrılır çünkü ACT protokolü sabit dokuların temizlenmesi kolayca uygulanabilir. Doku temizleme sonrasında insan dokuları çeşitli antikorlar ile iyi boyandı. ACT temizleme tekniği, etanol ve metanol gibi alkollü sabitleyicilerle, uyumlu olmadığını not edin.
Doku hidrojel polimerizasyon aşaması, temizleme işleminin ardından iyi kalitede kâğıt temizlik ürünü üretmek için çok önemlidir. ÇünküOksijen akrilamidin polimerizasyonuyla inhibe eden bir azot gazı infüzyon sistemi altında doku içeren solüsyonun gazı ile çıkarılmalıdır. Seçenek olarak ise, de-oksijenasyonu 23 saat süreyle bir ısı bloğu ile bir vakum odası kullanılarak yürütülebilir.
Takas oranı Çoğu yetişkin fare dokular gecede ETC silinebilir vs. Organ boyutu, lipidler veya ECM lifli proteinler içeriğinin, tespitin durumunun da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Bununla birlikte, bir riski vardır gereksiz aşırı temizleme ve doku şişme; Bu şekilde, temizleme süresi farklar önemli göz vardır. Doku temizleme koşullar ampirik olarak belirlenmelidir. Önemlisi, ECM içeriği temizlenir dokusunun görünümünü etkileyebilir. ACT yoğun protein lifleri silmez çünkü dokuların rengi, hatta ETC tamponunda ACT sonra, beyaz veya opak kalır. Bununla birlikte, ne bu organların, RI uygun çözeltisine daldırıldı,y şeffaf hale geldi.
Doku şişme oranı yoğun organlar daha büyük bir şişme oranı gösteren, ECM dokuların içeriği ve beyin gibi yumuşak bir organ, bağlı olduğu görülmektedir. artan doku doku temizleme işlemi yardımcı olacaktır şişlik nedeniyle ACT rutin çoğu durumda su bazlı tampon distile kullanmaktadır. Doku şişme veya geçici şekil bozukluğu gibi embriyolar gibi istenen bir durum değildir, bazı durumlarda, bir tampon içeren 0,1 x PBS yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygulanabilir. Ayrıca, tampon maddesi içinde daha yüksek tuz konsantrasyonları, dokuların daralmasına neden olabilir dikkat edilmelidir.
ACT yöntemi bir fare 14 tüm organ ve hatta tüm vücudu açıklayabilir. Ancak, şeffaf doku derin doku görüntüleme özel mikroskoplar ve hedefleri gerektirir. Bu nedenle, kalın bir beyin dokusu 1 ila 2 mm, geleneksel bir konfokal mikroskop ile görüntüleme için çok etkilidir. Etiketin Bizim ellerde, kaldırmaACT işlenmiş dokulardan ed antikorlar, antikora bağımlı ve farklı antikor etiketleme tur tavsiye edilmez. Böyle TH ve GFAP gibi bazı antikorlar, tüm beyin 14 immün özellikle iyi çalıştı. Diğer yandan, Tuj1 ya map2 gibi bazı antikorlar, çoğu zaman doku sadece yüzey etiketli. Bu, anahtar 15 gibi diğer yöntemler ile daha iyi olabilir. Bir diğer potansiyel sınırlama nedeniyle doku doku temizleme adımı sırasında şişme ve büzülme ACT işlenmiş dokuda ince protein yapılarını korumak zor olabilir olmasıdır.
PRESTO tekniği doku etiketleme teknikleri çeşitli uygulanabilir. Örneğin, bu tür SeeDB 4 ile iDISCO 7 gibi, önceden etiketlenmiş doku kullanılarak doku saydam yöntemleri, yoğun doku immün gün ila birkaç hafta daha uzun kuluçka dönemleri gerektirmektedir. Bununla birlikte, SAYGINLIK birkaç saat inkübasyon süresi kısaltabilir, örneğin1 mm kalınlığında yoğun doku ile bir gün içinde tüm sürecin tamamlanmasını nabling. PRESTO kalın derin etiketleme, yoğun dokularda, hatta un temizlenmiş kalın dokuların etkinliğini artırabilir. PRESTO bir masa üstü santrifüj veya şırınga pompası kullanan ve herhangi bir özel ekipman gerektirmez, çünkü rutin laboratuvar işlemleri ile bu tekniği uygulamak için nispeten kolaydır.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
| Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
| 2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
| Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
| Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
| Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies - Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
| Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
| Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
| Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
| Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
| N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
| ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
| ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
| Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
| Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
| Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
| Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
| Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
| Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
| Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
| Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
| Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
| Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
| Syringe (30 mL) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S30 | s-PRESTO |
| 3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. NATURE. 497, 332-337 (2013).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Kim, S. -Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17, 596-599 (2013).
- Yushchenko, D. A., Schultz, C. Tissue clearing for optical anatomy. Angew Chem Int Edit. 52, 10949-10951 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163, 1500-1514 (2015).
