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संयुक्त Intravital माइक्रोस्कोपी और कंट्रास्ट-माउस Hindlimb की बढ़ी हुई स् ट्रा इंसुलिन प्रेरित Vasodilation और मांसपेशी छिड़काव का अध् ययन करने के लिए

Published: March 20, 2017 doi: 10.3791/54912
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1
1Laboratory for Physiology, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Institute for Cardiovascular Research (ICaR-VU), VU University Medical Center

Summary

इंसुलिन प्रेरित vasodilation मांसपेशी छिड़काव को नियंत्रित करता है और रक्त और ऊतक interstitium के बीच घुला विदेशी मुद्रा के लिए उपलब्ध microvascular सतह क्षेत्र (microvascular भर्ती) बढ़ जाती है । संयोजित intravital माइक्रोस्कोपी और कंट्रास्ट-एन्हांस्ड ट्रा को एक साथ बड़े जहाजों और vivo में microcirculation पर इंसुलिन की कार्रवाई का आकलन करने के लिए प्रस्तुत किया गया है ।

Abstract

यह प्रदर्शित किया गया है कि इंसुलिन संवहनी कार्यों इंसुलिन संवेदनशीलता के विनियमन के लिए योगदान. मांसपेशी छिड़काव पर इंसुलिन के प्रभाव पोषक तत्वों और हार्मोन इंसुलिन के प्रति संवेदनशील ऊतकों के भोजन वितरण को विनियमित. हम यहाँ intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) और कंट्रास्ट-एन्हांस्ड ट्रा (CEUS) माउस hindlimb के adductor डिब्बे के संयोजन के लिए एक तकनीक का वर्णन करने के लिए एक साथ मांसपेशियों की प्रतिरोधक धमनियों और छिड़काव की कल्पना microcirculation में vivo. इसके साथ ही संवहनी पेड़ के कई स्तरों पर इंसुलिन के प्रभाव का आकलन इंसुलिन के कई vasoactive प्रभाव और मांसपेशी छिड़काव के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस अध्ययन में प्रयोग चूहों में किया गया. सबसे पहले, पूंछ नस प्रवेशनी संज्ञाहरण, vasoactive यौगिकों और अल्ट्रासाउंड कंट्रास्ट एजेंट (लिपिड encapsulated microbubbles) के अर्क के लिए डाला जाता है । दूसरा, एक छोटा सा चीरा adductor मांसपेशी डिब्बे के धमनी के पेड़ को बेनकाब करने के लिए कमर क्षेत्र में किया जाता है । इसके बाद अल्ट्रासाउंड जांच दल क्रास सेक्शन में मांसपेशियों को देखने के लिए contralateral अपर hindlimb में तैनात है । आधारभूत मापदंडों का आकलन करने के लिए, धमनी व्यास का आकलन किया जाता है और microbubbles बाद में मांसपेशियों के रक्त प्रवाह और microvascular रक्त की मात्रा (MBV) का अनुमान लगाने के लिए एक निरंतर दर से संचार कर रहे हैं । जब पहले और एक hyperinsulinemic के दौरान लागू-euglycemic दबाना, संयुक्त IVM और CEUS धमनी व्यास, microvascular मांसपेशी छिड़काव और पूरे शरीर इंसुलिन संवेदनशीलता के इंसुलिन प्रेरित परिवर्तन के आकलन की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, microcirculation और इंसुलिन के लिए प्रतिरोध धमनियों की प्रतिक्रियाओं के बीच लौकिक संबंध मात्रा जा सकता है । यह भी समय में चूहों longitudinally पालन करने के लिए संभव है, यह संवहनी और पूरे शरीर इंसुलिन संवेदनशीलता में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रही है.

Introduction

रक्त शर्करा के स्तर में वृद्धि के जवाब में, अग्ंयाशय खून में इंसुलिन स्रावित करती है जहां यह जल्दी से इस तरह के कंकाल की मांसपेशी के रूप में अपने लक्ष्य ऊतकों को वितरित किया जाता है, प्रतिरोध धमनियों और केशिकाओं के द्वारा । कंकाल की मांसपेशी भोजन ग्लूकोज के ८०% के लिए जिंमेदार है1। कंकाल की मांसपेशी interstitium करने के लिए इंसुलिन का वितरण इंसुलिन की चयापचय क्रिया है कि ग्लूकोज निपटान2,3,4को बढ़ावा देने के लिए कदम सीमित दर होना दिखाया गया है । 10-15 मिनट के भीतर, इंसुलिन केशिका रक्त की मात्रा (microvascular भर्ती) बढ़ जाती है, एक प्रभाव है कि कुल रक्त प्रवाह बढ़ जाती है से पहले होता है5,6. Microvascular भर्ती पोषक तत्वों (और इंसुलिन)7,8के आदान प्रदान के लिए उपलब्ध endothelial सतह क्षेत्र का विस्तार । इंसुलिन मध्यस्थता microvascular भर्ती से पहले और स्वतंत्र रूप से कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है8,9. vasculature पर इंसुलिन के प्रभाव को ' संवहनी इंसुलिन संवेदनशीलता ' करार दिया गया है.

यह दिखाया गया है कि इंसुलिन मध्यस्थता microvascular भर्ती और इंसुलिन प्रेरित vasodilation मोटापे से ग्रस्त जुकर चूहों में ख़राब कर रहे हैं10,11. इसके अलावा, कम केशिका घनत्व प्रदर्शन मांसपेशी इंसुलिन प्रतिरोध के साथ दुबला चूहों12. अपने प्रभावशाली कार्य में, Kubota एट al. ने दिखाया है कि endothelial कोशिकाओं में बिगड़ा इंसुलिन संकेत इंसुलिन प्रेरित microvascular भर्ती में कमी का कारण बना है, जो लगभग ४०%13द्वारा कंकाल की मांसपेशी में ग्लूकोज को कम कर दिया । microvascular समारोह में इन विषमताओं न केवल मांसपेशियों में होते हैं, लेकिन यह भी दिल, रेटिना और गुर्दे के रूप में कई अन्य ऊतकों और अंगों में14,15,16. ये उदाहरण और अंय अध्ययन17,18,19,20 सुझाव है कि इंसुलिन के संवहनी प्रभाव इंसुलिन प्रतिरोध के (पैथो) फिजियोलॉजी में एक महत्वपूर्ण तंत्र और उसके जटिलताओं.

हालांकि पर्याप्त सबूत है कि इंसुलिन बढ़ जाती है microvascular रक्त की मात्रा (MBV) कंकाल की मांसपेशी में5,6, तंत्र जिसके द्वारा यह होता है पूरी तरह से9समझ में नहीं आता । Endothelium-निर्भर vasodilation संवहनी इंसुलिन संवेदनशीलता के कई पहलुओं में आवश्यक है21,22,23 vasculature के विभिन्न स्तरों पर. संवहनी इंसुलिन संवेदनशीलता ही इंसुलिन प्रेरित प्रतिरोध धमनियों की छूट द्वारा प्रकट कर सकते हैं और पूर्व केशिका धमनियों की छूट से perfused microvascular विनिमय सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए7,24, 25.

Intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) माउस के skinfold मंडलों सहित ऊतक की तैयारी की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है पीठ26, माउस और चूहे की अन्त्रपेशी27, अंग के ischemia के मॉडल माउस में28 और हंसटर गाल पाउच 29. कंट्रास्ट-एन्हांस्ड ट्रा (CEUS) एक और इमेजिंग तकनीक है जो कार्डियक30 के साथ-साथ कंकाल की मांसपेशी31में microcirculation के आकलन की अनुमति देती है । यह निष्क्रिय गैस-भरा microbubbles जो लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में rheologically व्यवहार और संवहनी लुमेन के भीतर पूरी तरह से रहने का इस्तेमाल करता है । इन microbubbles एक स्थिर राज्य पाने के लिए एक स्थिर दर पर नसों के साथ संचार कर रहे हैं । एक उच्च ऊर्जा अल्ट्रासाउंड वेव, तो, microbubbles को नष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । microbubbles ' ब्याज के क्षेत्र में भरपाई की गति (रॉय) प्रवाह वेग (MFV) का प्रतिनिधित्व करता है । इसके विपरीत छवि के कुल संकेत तीव्रता MBV का प्रतिनिधित्व करता है । CEUS बार (भी मनुष्यों में) प्रदर्शन किया जा सकता है और यह नाड़ी रोग है कि इंसुलिन प्रतिरोधी राज्यों में होता है की समझ उंनत है (बैरेट एट अल में चर्चा की । ३२).

वर्तमान अध्ययन में हम मांसपेशी छिड़काव के विनियमन के अध्ययन के लिए एक नई तकनीक का वर्णन, दोनों IVM और CEUS के एक साथ प्रयोग के माध्यम से । यहां हम माउस hindlimb के adductor डिब्बे में इंसुलिन की संवहनी क्रियाओं पर ध्यान देते हैं । इस डिब्बे का सबसे बड़ा माउस में कंकाल की मांसपेशी समूहों में से एक है, एक प्रतिनिधि मांसपेशी में स्थानीय ग्लूकोज के बारे में अधिक से अधिक अध्ययन को सक्षम करने । इस डिब्बे की तैयारी और धमनियों के दृश्य के रूप में IVM के लिए आदर्श है एक मानकीकृत शल्य प्रक्रिया द्वारा आसानी से सुलभ हैं28. इसके अलावा, हमारे अपने समूह और दूसरों को पता चला है कि CEUS इस डिब्बे में इस्तेमाल किया जा सकता है३३,३४।

संयुक्त IVM और CEUS तकनीक के लिए एक लाभ की संभावना बड़ा धमनियों (फ़ीड या प्रतिरोध धमनियों) और एक ही मांसपेशी समूह में microcirculation (केशिका बिस्तर) के स्तर पर इंसुलिन के प्रभाव का आकलन करने के लिए है । इसके अलावा, दो तरीकों के एक साथ आवेदन प्रतिरोध धमनियों और microcirculation के स्तर पर इंसुलिन की लौकिक कार्रवाई में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. यह संयुक्त IVM और CEUS तकनीक भी अंय संवहनी जीवविज्ञान के खेतों में कार्यांवित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रोटीन और endothelium को प्रभावित करने वाली कुछ pathophysiological स्थितियों की भूमिका को नॉकआउट मॉडलों का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, दोनों तकनीक समय और अनुसंधान की लागत को कम करने के कई समय अंक में एक माउस में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों को स्थानीय एनिमल केयर एंड एथिकल कमेटी ने मंजूरी दे दी है । hyperinsulinemic-euglycemic दबाना के अंत तक माउस में संज्ञाहरण के प्रेरण से पूरे प्रोटोकॉल लगभग 2 एच लेता है ।

१. Microsurgical तयारी

  1. एक पुरुष माउस में analgesia के साथ संज्ञाहरण प्रेरित एक 14 ज या एक Fentanyl के intraperitoneal इंजेक्शन के साथ रात भर उपवास के बाद 20-25 ग्राम वजनी (०.३१ मिलीग्राम/किग्रा), मिडियाजोलम (६.२५ मिलीग्राम/) और Acepromazine (६.२५ मिलीग्राम/किलोग्राम) (FMA संज्ञाहरण) और यह एक पर जगह रेक्टल-तापमान-नियंत्रित homeothermic हीटिंग पैड जो ३७ डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखता है ।
  2. ऑपरेशन टेबल और उपकरण कई बार एक शराब आधारित समाधान का उपयोग कर संक्रमित ।
  3. एक 10 सेमी लंबी पॉलीथीन ट्यूब (पीई-20) के लिए एक 27 जी सुई संलग्न और एक 4 तरह संबंधक के लिए ट्यूब संलग्न । पूंछ नस में सुई डालें और यह ऊतक चिपकने वाला जेल का उपयोग कर निर्धारण । यह प्रवेशनी microbubbles, इंसुलिन, ग्लूकोज और संज्ञाहरण के अर्क के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    नोट: हेपरिन जोड़ना (5 U/एमएल) बाँझ खारा में cannulation प्रक्रिया के दौरान पूंछ नस फ्लश (लगभग 10 µ एल) भरा cannulas की संभावना कम कर देता है ।
  4. सर्जिकल प्रक्रियाओं और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के दौरान, ३३.७५ µ एल की दर पर पूंछ नस प्रवेशनी के माध्यम से FMA संज्ञाहरण के एक सतत नसों में अर्क द्वारा संज्ञाहरण बनाए रखने/
  5. ventral पक्ष के साथ माउस प्लेस और एक thermostable टेप का उपयोग कर पैरों को ठीक करने के लिए ऊपरी जांघ क्षेत्र का पर्दाफाश । कूल्हे के एक मामूली exorotation का प्रयोग करें (hindlimb पंजे ऊपर का सामना करना पड़) और एक 40-60 ° कोण घुटने की जांघ के adductor डिब्बे में मांसपेशियों के खिंचाव को मानकीकृत करने के लिए संयुक्त ।
  6. कमर और ऊपरी जांघ क्षेत्रों में द्विपक्षीय एक लोमनाशक क्रीम का उपयोग कर बाल निकालें । एक नम कपास झाड़ू के साथ सभी ढीले बाल ले लीजिए ।
  7. एक stereomicroscope के तहत माउस प्लेस और निंनलिखित शल्य 16X आवर्धन के लिए 10x का उपयोग कर कदम प्रदर्शन करते हैं ।
  8. सिर्फ पेट वक्रता के लिए पार्श्व (चित्रा 1), वंक्षण बंध के समानांतर चल त्वचा कैंची का उपयोग कर एक 2 सेमी चीरा बनाओ. चीरा एक बुलडॉग दबाना (चित्रा 1 डी) का उपयोग कर के बाहर की ओर कर्षण लागू करें. यह जरूरत के रूप में खिड़की को समायोजित करने में मदद मिलेगी और आयल तेल (१.१२ में वर्णित) पकड़ो ।
  9. वसा ऊतक को उदर की दीवार से दूर टुकड़े. रक्तस्राव से बचने के लिए, धीरे से पैड के माध्यम से सीधे विदारक के बजाय दीवार से फैट पैड को अलग करें । बाहर की दिशा में वसा पैड पर कोमल कर्षण प्रक्रिया (चित्रा 1C) की सुविधा होगी ।
  10. ऊरु धमनी की पहचान और पहले प्रमुख शाखाओं (अधिजठर धमनी और gracilis धमनी) (चित्रा 2) के लिए नीचे का पालन करें । gracilis धमनी adductor मैगनस मांसपेशी पर चलने ऊरु धमनी की पहली बड़ी शाखा है और फिर gracilis मांसपेशी को गहरी चलाता है । IVM के लिए gracilis धमनी का इस्तेमाल किया जाएगा ।
  11. मांसपेशियों और जहाजों को कवर पारदर्शी गहरी प्रावरणी की पहचान करें । तेज संदंश का प्रयोग, प्रावरणी ऊपर की ओर खींच और एक microscissor का उपयोग कर इसे काट ।
  12. औषधीय तरल आयल (कमरे का तापमान, या ३७ डिग्री सेल्सियस से पूर्व गर्म) की एक बूंद (२०० µ एल) के साथ उजागर मांसपेशी को कवर बाहर सुखाने से तैयार ऊतक को रोकने के लिए । सुनिश्चित करें कि तेल की बूंद दूर रिसाव नहीं है । बुलडॉग दबाना का उपयोग कर चीरा की त्वचा परतों को समायोजित करने के लिए एक छोटा सा गुहा बनाने के लिए तेल कि जहाजों स्नान पकड़ ।
  13. ऐसे में पहले से नपे माइक्रोस्कोप (16X ऑप्टिकल आवर्धन) के तहत माउस को इस तरह रखें कि gracilis धमनी कंप्यूटर स्क्रीन पर वर्टिकल हो । एक कैमरा और कंप्यूटर आधारित विश्लेषण प्रणाली है कि ' जहाजों व्यास छवि डेटा सेट से निकालने के लिए माइक्रोस्कोप संलग्न कर सकते हैं । व्यास पोत के दो चमकीले किनारों के बीच की दूरी है । सतत निगरानी और धमनी व्यास की माप वांछनीय है ।
  14. प्रकाश से सिर चालन को कम करने के लिए hindlimb से पर्याप्त दूरी (न्यूनतम 20 सेमी) पर प्रकाश स्त्रोत रखें ।
  15. उच्च contralateral hindlimb के लिए गर्म अल्ट्रासाउंड transduction जेल लागू करें । अल्ट्रासाउंड जांच फीमर हड्डी की लंबी धुरी को सीधा रखें ।
  16. ध्यान से adductor मांसपेशी समूह का एक क्रॉस-अनुभागीय दृश्य प्राप्त करने के लिए अल्ट्रासाउंड जांच के कोण और दिशा को समायोजित करें । माउस के स्थिर होने के संबंध में अल्ट्रासाउंड जांच की स्थिति को आधारभूत और hyperinsulinemic मापन के लिए एक ही इमेजिंग विमान रखने के लिए ध्यान रखना.
  17. 30 मिनट के लिए माउस को स्थिर करते हैं । आधारभूत व्यास का दस्तावेजीकरण करने से पहले gracilis धमनी का व्यास १० मिनट के लिए स्थिर होना चाहिए.

2. आधारभूत और Hyperinsulinemic मापन

  1. सुनिश्चित करें कि आधार रेखा gracilis धमनी व्यास कंप्यूटर प्रोग्राम IVM के लिए प्रयुक्त द्वारा सहेजा गया है ।
  2. ३५ और कल्टर काउंटर के साथ २.५ x 109 बुलबुले के एक एकाग्रता के लिए और गिनती के रूप में वर्णित अग्रिम में microbubbles तैयार करें बस प्रयोग से पहले ।
  3. के रूप में microbubbles केवल अल्ट्रासाउंड मशीन के विपरीत मोड में देखा जा सकता है, जो छवि को प्रभावित करने वाले मापदंडों और कंट्रास्ट डेटा एकत्र नियंत्रण (2.3.1 में वर्णित) और अधिग्रहण के दौरान लगातार इस्तेमाल करते हैं ।
    1. अल्ट्रासाउंड मशीन पर निंनलिखित सेटिंग्स का प्रयोग करें: ३५ डेसीबल में इसके विपरीत लाभ; समय से लाभ मुआवजा बंद करने के लिए; उच्च करने के लिए लाइन घनत्व; व्यापक करने के लिए फोकल क्षेत्रों की संख्या; 4% करने के लिए शक्ति संचारित; मानक के लिए बीम चौड़ाई संचारित; एसवी गेट टू 4; 1 के लिए संवेदनशीलता; हठ बंद करने के लिए । फोकल क्षेत्रों के हित के क्षेत्र के केंद्र में स्थान स्तर ।
  4. एक छोटी (5 एस) क्लिप सहेजें । यह पृष्ठभूमि संकेत की गणना करने के लिए उपयोग किया जाएगा ।
  5. एक वर्दी निलंबन करने के लिए हाथ से microbubbles युक्त शीशी हिला । एक 5 µ l/न्यूनतम दर पर पूंछ नस प्रवेशनी का उपयोग कर microbubbles infusing शुरू । एक हिल भंवर पर अर्क ट्यूब प्लेस (प्रति मिनट 200x) microbubbles के एक वर्दी निलंबन बनाए रखने के लिए ।
  6. microbubbles के निरंतर अर्क के 5 मिनट की अनुमति दें ताकि एक स्थिर राज्य स्तर तक पहुंच गया है । अल्ट्रासाउंड मशीन पर 5 मिनट में microbubble संहार समारोह (MBD) का उपयोग कर बुलबुले के समय तीव्रता curves प्राप्त करने के साथ आगे बढ़ें और microbubbles अर्क (चित्रा 3ए) के शुरू होने के बाद 10 मिनट में । आधारभूत छिड़काव डेटा प्राप्त करने के लिए इन दो मापनों का औसत संकेत लें.
  7. आधारभूत डेटा प्राप्त करने के बाद,३४वर्णित के रूप में hyperinsulinemic-euglycemic दबाना प्रारंभ करें । (१.३ में रखा) प्रवेशनी पूंछ इंसुलिन और ग्लूकोज (और संज्ञाहरण) प्रशासन के लिए उपयोग करें ।
    1. संक्षेप में, एक २०० म्यू/किलोग्राम इंसुलिन बोल्स के बाद सतत इंसुलिन अर्क (७.५ म्यू/kg/min) के लिए शुरू करके एक hyperinsulinemic राज्य प्रेरित euglycemia बनाए रखने के लिए 20% D-ग्लूकोज की एक चर अर्क का उपयोग करें ।
    2. एक ग्लूकोज निगरानी डिवाइस के साथ हर 5 मिनट पूंछ नस से रक्त ग्लूकोज का आकलन, और चर ग्लूकोज अर्क दर का समायोजन करके 5 मिमी पर बनाए रखने. पिछले 30 मिनट के दौरान मतलब ग्लूकोज अर्क दर औसत से इंसुलिन संवेदनशीलता का निर्धारण ।
  8. सुनिश्चित करें कि gracilis धमनी का व्यास वांछित समय अवधि में प्रलेखित है (उदाहरण के लिए 10, 30 और ६० मिनट पर) hyperinsulinemic-euglycemic कंप्यूटर प्रोग्राम के साथ दबाना की शुरुआत की ।
  9. 25 मिनट और/या इंसुलिन क्लैंप के ५५ मिनट के बाद, क्रमशः 30 और/या ६० मिनट पर MBV दस्तावेज़ के लिए दूसरा (hyperinsulinemic) CEUS माप प्रारंभ करें । २.४ और २.५ में वर्णित समान चरणों का पालन करें । अलग और microbubbles को भ्रमित करने के लिए 4 तरह संबंधक के संज्ञाहरण बंदरगाह का उपयोग करें । microbubbles अर्क के अंत के बाद संज्ञाहरण ट्यूब reattach ।
  10. IVM और CEUS मापन के पूरा होने के बाद ६० मिनट इंसुलिन अर्क के शुरू होने के बाद, एक दिल के द्वारा माउस से रक्त निकालने के बाद विश्लेषण के लिए प्रक्रिया पंचर. इससे माउस भी euthanize होगा । ध्यान से gracilis और ऊरु धमनियों को टुकड़े और उन्हें आगे वांछित प्रयोगों के लिए स्टोर करें ( उदा., वेस्टर्न ब्लाट्स, Immunohistochemistry, ex vivo प्रेशर myography गडबड३६,३७, ३८).

3. ऑफलाइन विश्लेषण

नोट: IVM और CEUS माप का विश्लेषण एक अंधा अंवेषक द्वारा ऑफ़लाइन किया जाना चाहिए । CEUS अस्थाई रूप से उच्च तीव्रता अल्ट्रासाउंड तरंगों MBD समारोह का उपयोग करके microbubbles का संहार द्वारा बड़े जहाजों से microcirculation भेद करने की संभावना प्रदान करता है । संकेत (मनमाना इकाइयों (ए. यू.) में मापा बड़े जहाजों में microcirculation की तुलना में जल्दी बहाल कर रहा है क्योंकि इसी जहाजों में microbubbles गति की ।

  1. एक ऑफ़लाइन कार्य केंद्र या अल्ट्रासाउंड मशीन पर सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए विश्लेषण करती है ।
  2. microcirculation को शामिल करने के लिए रुचियों का क्षेत्र (ROI) आरेखित करें. बड़ा ऊरु वाहिकाओं (चित्रा 3) शामिल करने के लिए एक अलग रॉय ड्रा.
  3. इस सॉफ्टवेयर में निर्मित रॉय कॉपी समारोह का उपयोग करके पृष्ठभूमि, आधारभूत और hyperinsulinemic माप के लिए microcirculation के और बड़े जहाजों ' ROIs डुप्लिकेट ।
  4. आधारभूत और hyperinsulinemic माप से पृष्ठभूमि माप की तीव्रता संकेत घटाना.
  5. ऊरु जहाजों की तीव्रता संकेत द्वारा microcirculation की तीव्रता संकेत विभाजित । बेसलाइन और hyperinsulinemic MBVs की अब तुलना की जा सकती है.

Representative Results

hyperinsulinemic-euglycemic दबाना (इंसुलिन संवेदनशीलता) के दौरान ग्लूकोज अर्क दर १८०.२१ ± १९.८१ µmol/kg/min. adductor मांसपेशी डिब्बे पर आयल तेल के स्थानीय अनुप्रयोग पोत को स्थिर औसत आधारभूत व्यास बदल नहीं किया था की धमनियों (७३.६ ± २९.० µm बनाम ६८.८ ± १७.९ µm; p = ०.५८) लेकिन मदद की भिन्नता जानवरों का परीक्षण (चित्रा 4a) को कम. इंसुलिन लगातार gracilis धमनी व्यास (६० मिनट में १४.५८ ± ६.२% की वृद्धि हुई; N = 9) जो खारा अर्क की वजह से व्यास परिवर्तन से काफी अलग (पी < 0.0001) था (-६.३ ± ४.९%; N = 6). इंसुलिन प्रेरित vasodilation 10 मिनट के बाद प्रशंसनीय था (१०.०९ ± ५.१%; p = ०.००२) और 30 मिनट के बाद अपनी अधिकतम dilatory क्षमता का लगभग ९५% तक पहुंच गया ।

CEUS का उपयोग करते हुए, इंसुलिन लगातार मांसपेशी MBV (चित्र 5) ३३.५% (± ३१.०४%, n = 7; p = ०.०००९) जब खारा अर्क की तुलना में (-१०.६३ ± २७.८७%, एन = 6) (चित्रा 5B) के द्वारा । प्रस्तुत डेटा ऊरु वाहिकाओं में है कि द्वारा विभाजित मांसपेशी MBV के संकेत तीव्रता रहे हैं । यह विभिन्न माप के बीच और विभिन्न चूहों के बीच प्रयोगात्मक भिन्नता को कम कर देता है (दिखाया नहीं डेटा). ऊरु वाहिकाओं में संकेत तीव्रता संचलन में microbubbles की एकाग्रता के साथ रैखिकता से मेल खाती है (चित्रा 3सी). ऊरु ' जहाजों संकेत के लिए सुधार सैद्धांतिक रूप से इस्तेमाल किया microbubbles की सांद्रता में मतभेदों के लिए सही (चित्रा 3 डी) । डेटा इस अनुभाग में अर्थ ± मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Figure 1
चित्र 1: Hindlimb के Adductor डिब्बे के सर्जिकल प्रदर्शनी । (क) एक चीरा कमर, वंक्षण बंधन की दिशा के समानांतर में किया जाता है । (ख) बाहर की दिशाओं (काले तीर) में वसा पैड पर कोमल कर्षण संयोजी ऊतक (*) वसा पैड और पेट की दीवार के बीच पेश करेंगे । (ग) चीरा की त्वचा परतों का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता बुलडॉग दबाना एक छोटे से गुहा बनाने के लिए आयल तेल कि जहाजों स्नान पकड़ । (घ) अल्ट्रासाउंड जांच को contralateral अपर hindlimb पर तैनात किया जाता है जिसके बाद तैयार gracilis धमनी को एक नपे माइक्रोस्कोप के प्रयोग से देखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: माउस का Intravital माइक्रोस्कोपी Hindlimb. ऊरु धमनी (ए) अधिजठर धमनी (बी) और gracilis धमनी (सी) को जन्म देती है जो adductor मांसपेशी समूह (D) से अधिक चलती है । gracilis धमनी एक नपे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर IVM के लिए प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: कंट्रास्ट की सिग्नल तीव्रता-मांसपेशी Microvascular रक्त की मात्रा और ऊरु वाहिकाओं में बढ़ाया ट्रा । (क) एक पुरुष माउस ऊपरी hindlimb में microbubbles लगातार अर्क के दौरान डिजिटल इमेजिंग मंच के रैखिक विपरीत इमेजिंग मोड के दृश्य । दायां पैनल: दो ROIs मांसपेशियों MBV और ऊरु जहाजों का प्रतिनिधित्व करने के लिए तैयार कर रहे हैं । केवल adductor मांसपेशी डिब्बे के सतही हिस्सा रॉय में शामिल है के रूप में संकेत तीव्रता गहराई के साथ कम हो जाती है । बाएं पैनल: मांसपेशी MBV रॉय से समय तीव्रता वक्र । ऊर्ध्वाधर लाइनों उच्च ऊर्जा तरंगों के साथ microbubbles (MBD) के विनाश का प्रतिनिधित्व करते हैं । MBD के तुरंत बाद, इमेजिंग विमान में कोई कंट्रास्ट एजेंट मौजूद नहीं होता है जो धीरे-microbubbles से भरना शुरू करता है । 10-15 s के बाद, इसके विपरीत वृद्धि की चोटी पर पहुंच गया है । (बी-डी) एक स्थिर राज्य के संकेत के बाद पहुंच गया था, २.५ x 109 बुलबुले के अर्क की दर (5, 10, 20 µ एल/ मांसपेशी MBV (ख) और ऊरु जहाजों (सी) से संकेत तीव्रता संचलन में microbubble एकाग्रता के दोहरीकरण समानांतर । (D) ऊरु वाहिकाओं के संकेत के लिए मांसपेशी MBV को सही करना भिंन microbubble सांद्रता (N = 9; त्रुटि-पट्टियां मानक विचलन दर्शाते हैं) के कारण संकेत तीव्रता में परिवर्तनशीलता को हटा देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: Gracilis धमनी के Intravital माइक्रोस्कोपी माप । (क) आयल आयल विभिन्न जंतुओं की gracilis धमनियों की भिन्नता को कम करता है (जो तेल को लगाने के बाद आयल बनाम १७.९ µm के बिना २९.० µm है) जबकि औसत आधारभूत व्यास स्थिर रखते हुए (७३.६ µm बनाम ६८.८ µm; p = ०.५८) । (ख) आधार रेखा पर धमनी के व्यास और इंसुलिन या खारा अर्क के ६० मिनट के बाद । ६० मिनट के बाद इंसुलिन आधान लगातार खारा अर्क की तुलना में जब gracilis धमनी (पी < 0.0001) फैली हुई है । (ग) इंसुलिन प्रेरित vasodilation अर्क (पी = ०.००२) के शुरू होने के बाद 10 मिनट में होता है और अधिकतम 30 मिनट में ९५% तक पहुंचता है । त्रुटि-पट्टियां मानक विचलन दर्शाते हैं; ख़राब छात्र का टी-टेस्ट आँकड़ों के लिए किया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: Microvascular रक्त की मात्रा मापन कंट्रास्ट का उपयोग करते हुए-माउस Hindlimb के Adductor मांसपेशी डिब्बे का एन्हांस्ड ट्रा. (क) इंसुलिन के परिणामस्वरूप इंसुलिन आधान की शुरुआत के बाद MBV ३० मिनट में लगातार वृद्धि हुई. (ख) hyperinsulinemic और आधारभूत मापन (MBV change) के बीच का अंतर इंसुलिन की मध्यस्थता microvascular भर्ती के रूप में चिह्नित है । इंसुलिन ३३.५% प्रेरित (± ३१.०४%, p = ०.०१६; n = 7) खारा अर्क की तुलना में microvascular भर्ती (-१०.६३ ± २७.८७%, N = 6) । त्रुटि-पट्टियां मानक विचलन दर्शाती हैं; ख़राब छात्र का टी-टेस्ट आँकड़ों के लिए किया जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हम एक तकनीक विकसित करने के लिए एक साथ बड़ी धमनियों (IVM का उपयोग) और कंकाल मांसपेशी microcirculation (CEUS का उपयोग) पर इंसुलिन संवहनी कार्रवाई का अनुमान है । सफल और विश्वसनीय माप के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सही ढंग से खून बह रहा बिना gracilis धमनी को उजागर; 2) तेल की धमनी में स्नान के रिसाव को रोकने; 3) vasoactive यौगिकों (इंसुलिन) और इसके विपरीत एजेंट (microbubbles) के अर्क के लिए एक पेटेंट शिरापरक पहुंच (पूंछ नस प्रवेशनी) ।

मांसपेशी में microvascular शिथिलता का अध्ययन मोटापे और इंसुलिन प्रतिरोध के संदर्भ में ध्यान प्राप्त कर रहा है14,25,३९,४०. मोटापा और संवहनी समारोह पर इंसुलिन प्रतिरोध का नकारात्मक प्रभाव संवहनी पेड़ के विभिन्न स्तरों पर प्रकट होता है । इसके बाद, इन परिवर्तनों का मूल्यांकन करने के लिए विभिंन दृष्टिकोणों की आवश्यकता है । एक ही माउस में IVM और CEUS तकनीकों का संयुक्त उपयोग vasculature के विभिन्न स्तरों पर इंसुलिन के प्रभाव को बढ़ाता है करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. IVM प्रत्यक्ष दृश्य और प्रतिरोध धमनी और CEUS के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है इंसुलिन की मांसपेशी में प्रेरित परिवर्तन के आकलन के लिए अनुमति देता है छिड़काव.

adductor मांसपेशी डिब्बे के अध्ययन के कई फायदे हैं । धमनियों आसानी से सुलभ है और चीरा की सतही प्रकृति प्रयोग समाप्त हो गया है के बाद यह संभव एक ५.० अवशोषित बाँझ टांका के साथ त्वचा चीरा बंद करने के लिए बनाता है । जानवरों buprenorphine के साथ चमड़े के नीचे एक खुराक में एक एनाल्जेसिक के रूप में प्रयोग के बाद इंजेक्शन थे ०.१ मिलीग्राम/kg और एक गर्म वातावरण में ठीक करने की अनुमति दी । चूहों प्रक्रिया बहुत अच्छी तरह से सहन किया और हम और न ही पशुओं का कोई नुकसान का अनुभव किया और अधिक से अधिक ३५ पशुओं में hindlimb के संक्रमण का अध्ययन किया । यह संभव अनुवर्ती या एक अनुदैर्ध्य फैशन में जानवरों का अध्ययन करने के लिए बनाता है । इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जानवरों, तथापि, anesthetized थे १.८% सांस isoflurane ऑक्सीजन के साथ संतुलित ०.४ एल पर बह/ isoflurane संज्ञाहरण४१,४२, FMA संज्ञाहरण के विपरीत परिधीय इंसुलिन संवेदनशीलता को परेशान नहीं करता । एक भविष्य की योजना कैसे अच्छी तरह से चूहों FMA संज्ञाहरण से उबरने का अध्ययन करने के लिए है ।

adductor मांसपेशी डिब्बे भी उपयोगी है के बाद से विभिंन vasoactive स्थानीय और बहाव नाड़ी प्रभाव मध्यस्थता यौगिकों का मूल्यांकन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, लक्ष्य ऊतक के लिए इन यौगिकों के सामयिक आवेदन superfusion तकनीक का उपयोग कर व्यवहार्य है28 या शल्य चिकित्सा हेरफेर और दवा के आरोपण-eluting वाहिकाओं४३आसपास के कफ. इसके अलावा, gracilis धमनी अलग और दबाव myograph में अध्ययन किया जा सकता है । हमारे समूह और दूसरों के दबाव myograph का उपयोग करने के लिए इस धमनी पर इंसुलिन और अन्य vasoactive यौगिकों के प्रभाव दस्तावेज़ करने के लिए पर्याप्त प्रयोगात्मक सबूत इकट्ठा किया है विवो३६,३७,३८.

एक सीमा IVM तकनीक के उपयोग के लिए अंतर्निहित मांसपेशी और आयल तेल के आवेदन के सर्जिकल प्रदर्शनी के लिए जहाजों को स्थिर है । यह स्पष्ट नहीं है कि इन क्रियाओं से धमनी का देशी वातावरण प्रभावित होता है या नहीं. हालांकि, चित्रा 3 ए से पता चलता है कि आयल तेल में नहाया gracilis धमनी का आधारभूत व्यास काफी परिवर्तन नहीं करता है । यह भी दिखाया गया है कि खनिज तेल सफलतापूर्वक ऑक्सीजन के प्रसार को रोकता है, hyperoxic शर्तों से ऊतक की रक्षा४४। इसके अलावा, तेल धमनियों के आधारभूत व्यास में भिन्नता को कम करने में मदद करता है । यही कारण है कि हम आयल आयल का प्रयोग करने की वकालत करते है और तैयारी को आराम देते है । ध्यान दें की, के बजाय तेल के बफर खारा का उपयोग करें-या कोई तेल सब पर-अत्यधिक चर व्यास और पोत के कसना (नहीं दिखाया डेटा) के परिणामस्वरूप । इसके अलावा, प्रयोगों के अंत में, हम gracilis धमनियों-आयल तेल में नहाया-अलग है और myograph के दबाव में अपनी जेट परीक्षण विवो । आयल तेल से नहाया धमनियों जब इंसुलिन और acetylcholine (एक vasodilator) (डेटा दिखाया नहीं) के साथ उत्तेजित धमनियों को नियंत्रित करने के लिए इसी तरह प्रतिक्रिया व्यक्त की । लगातार इंसुलिन प्रेरित vasodilation स्पष्ट रूप से पता चलता है कि इस अध्ययन में वर्णित IVM प्रोटोकॉल विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है ।

एक ही माउस में दोनों तकनीकों को लागू करने का लाभ अंय द्वारा एक तकनीक की आंतरिक सीमाओं में से कुछ पर काबू पा: CEUS अनुमान vivo में परेशान मांसपेशी में MBV, लेकिन व्यक्तिगत जहाजों को देखा नहीं जा सकता; IVM यह व्यक्तिगत जहाजों को देखने के लिए संभव बनाता है, हालांकि यह MBV अनुमान नहीं कर सकते । एक भविष्य की योजना के लिए contralateral पक्ष पर adductor मांसपेशी के CEUS के साथ संयोजन में cremaster मांसपेशी के IVM माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए है । इस संशोधन MBV (CEUS का उपयोग करके) और केशिकाओं (IVM का उपयोग) के लिए एक प्रत्यक्ष ऑप्टिकल का उपयोग का अनुमान प्रदान कर सकते हैं । प्रोटोकॉल आगे संशोधित किया जा सकता है; टेल प्रवेशनी के लिए इस्तेमाल होने वाले 4 तरह के कनेक्टर को 5 तरह के कनेक्टर में स्विच किया जा सकता है । इस के द्वारा, हम संज्ञाहरण ट्यूब अलग से बचने जबकि दूसरा CEUS माप प्रदर्शन कर सकते है (२.९ बिंदु में वर्णित) । हमारे अनुभव में, चूहों वर्तमान प्रोटोकॉल अच्छी तरह से सहन । इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है कि एक और संशोधन इंसुलिन दबाना दर का इस्तेमाल किया है । हम इस्तेमाल किया ७.५ म्यू/kg/min क्लैंप दर जो ऊपर अर्थ का उपसर्ग-शारीरिक माना जाता है । अध्ययन के आधार पर, एक कम इंसुलिन दबाना दर (उदाहरण के लिए 3 म्यू/kg/min) का उपयोग किया जा सकता है ।

जब तक हम वर्णित प्रोटोकॉल विश्वसनीय पाया है, वहां विशिष्ट सीमाएं है कि ध्यान देने की जरूरत है । वहाँ स्थितियों रहे हैं जब धमनी व्यास की माप इष्टतम नहीं है । तैयारी चरणों को निष्पादित करने से मॉडल के साथ कुछ अनुभव की आवश्यकता होती है. यह महत्वपूर्ण है कि आयल तेल पोत पर्यावरण से रिसाव नहीं के रूप में यह नए तेल के साथ पूरक है पोत परेशान और व्यास बदल जाएगा, यह आवश्यक बनाने के लिए एक और 30 मिनट के लिए धमनी आराम करो । इसके अलावा, प्रकाश का प्रतिबिंब (प्रोटोकॉल के चरण १.१४ में वर्णित) आयल की सतह पर कभी कभार भी चमकीला होता था, जिससे धमनी को देखने में कठिनाई होती है । इस प्रकाश स्रोत इतना है कि प्रकाश आयल तेल की सतह के लिए एक कोण पर गिर जाता है और धमनी के समानांतर द्वारा प्रभावहीन किया जा सकता है ।

अंत में, इस अध्ययन में वर्णित IVM और CEUS तकनीकों के संयोजन यह vasculature के विभिन्न स्तरों पर इंसुलिन के विभिन्न प्रभावों को बढ़ाता है संभव बनाता है. IVM gracilis धमनी के ऊपर संवहनी microvascular छिड़काव CEUS का उपयोग कर मापा करने के लिए योगदान में परिवर्तन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । हम बेहतर संवहनी समारोह का आकलन करने के लिए एक ही माउस में कई प्रयोगात्मक तकनीकों के संयोजन की वकालत.

Disclosures

दृश्य सोनिक इंक ओपन एक्सेस फीस कवर, जबकि संरचना और लेख की सामग्री के लेखकों की पूरी जिंमेदारी बनी रही ।

Acknowledgments

हम धंयवाद । डंकन वान Groen इस अध्ययन में प्रयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (ImageGrabber) प्रोग्रामिंग के लिए । इस शोध के लिए फंडिंग नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर साइंटिफिक रिसर्च (ग्रांट 016.136.372) से विडि ग्रांट द्वारा प्रदान की गई है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 Mice Charles river Mice used were bred in-house
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system VisualSonics inc.
MS250 non-linear transducer VisualSonics inc.
Vevo 2100 software VisualSonics inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009 Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Vortex VWR international 58815-234
Heating pad  Pantlab
Freestyle Precision Xceed  Abbott To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp
Insulin Novorapid Novo Nordisk
Glucose monohydrate  Merck Millipore 1083421000
Buffered saline solution B. Braun 152118062
PE-20 medical tubing Becton, Dickinson and Company 427405
Needle, 27 Gauge  Becton-Dickinson & Co 305109
Medical tape 3M
Ultrasound probe holder Built In-house
Cotton swabs Multiple Equivalent
Creme depilator Multiple Equivalent
Gel tissue adhesive Derma+flex GA30005-2222
Infusion pump Harvard Apparatus Harvard Apparatus PHD 2000
Small fine straight scissors Fine Science Tools (FST) 14090-09
Needle holder Fine Science Tools (FST) 12500-12
Straight forceps with fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-20
Stereomicroscope Olympus SZX12
Camera Basler scA1390-17gc
Image Grabber program Built in-house Image acquisition system
Timer VWR 33501-418
Syringes, 1 mL Fisher 14-817-25
Light source, fiber-optic Schott KL1500 Ideally has adjustable arms
Paraffin oil Multiple Equivalent
Name Company Catalog Number Comments
Microbubbles
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine  Avanti Polar Lipids 850365C
polyoxyethylene stearate   Sigma p3440
perfluorobutane gas  F2 Chemicals C4F10(g)
Decon FS200 ultrasonic bath  Decon Ultrasonics Ltd
Vialmix  Lantheus Medical Imaging 515370-0810
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter Inc

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References

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संयुक्त Intravital माइक्रोस्कोपी और कंट्रास्ट-माउस Hindlimb की बढ़ी हुई स् ट्रा इंसुलिन प्रेरित Vasodilation और मांसपेशी छिड़काव का अध् ययन करने के लिए
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Turaihi, A. H., van Poelgeest, E. M., van Hinsbergh, V. W. M., Serné, E. H., Smulders, Y. M., Eringa, E. C. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. J. Vis. Exp. (121), e54912, doi:10.3791/54912 (2017).

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