Vasodilation הנוצרות על-ידי אינסולין מווסת את השריר זלוף ומגביר את microvascular על פני השטח אזור (גיוס microvascular) זמין לחילופי ממס בין interstitium דם ורקמות. מיקרוסקופ intravital משולב, בדיקת אולטרה סאונד משופרת לעומת זאת מוצג להעריך בו זמנית של אינסולין פעולה בכל כלי גדול יותר, את microcirculation ויוו.
זה הוכח, כי פעולות כלי הדם של אינסולין לתרום רגולציה של הרגישות לאינסולין. ההשפעות של אינסולין על השריר זלוף לווסת postprandial אספקת חומרים מזינים והורמונים רקמות הרגישים אינסולין. נתאר כאן טכניקה לשילוב מיקרוסקופ intravital (IVM) ואת משופרת לעומת זאת בדיקת אולטרה סאונד (CEUS) של התא המתוויך הגדול של hindlimb העכבר בו-זמנית להמחיש שריר התנגדות העורקים זלוף של מנתחי מיקרו ויוו. במקביל הערכת ההשפעה של אינסולין ברמות מרובות של העץ כלי הדם חשוב ללמוד את קשרי הגומלין בין אפקטים vasoactive מרובים של אינסולין זלוף שריר. הניסויים במחקר זה בוצעו בעכברים. קודם כל, הצינורית וריד הזנב נוסף עבור העירוי של הרדמה, תרכובות vasoactive, אולטרסאונד הסוכן ניגוד (encapsulated השומנים microbubbles). שנית, חתך קטן עשוי באזור המפשעה לחשוף את עץ עורקי של תא השריר המתוויך. החללית אולטרסאונד ממוקם אז-contralateral hindlimb העליונה כדי להציג את השרירים חתך הרוחב. להערכת פרמטרים בסיסית, שקובעת את קוטר העורקים, microbubbles מעורבבים לאחר מכן בקצב קבוע כדי להעריך את זרימת הדם שריר ונפח הדם microvascular (MBV). בעת החלת לפני ובמהלך מלחציים hyperinsulinemic-euglycemic, המשולב IVM CEUS לאפשר הערכה של אינסולין-induced שינוי קוטר העורקים, שריר microvascular זלוף, הרגישות לאינסולין לכל הגוף. יתר על כן, הקשר טמפורלית בין התגובות של microcirculation העורקים עמידות לאינסולין ניתן לכמת. אפשרי גם מעקב עכברים longitudinally בתוך הזמן, שהופך אותו כלי חשוב ללמוד שינויים ברגישות לאינסולין וסקולרית, לכל הגוף.
בתגובה לעלייה ברמת הגלוקוז בדם, הלבלב מפריש אינסולין לזרם הדם ומשם במהירות למחזור לרקמות היעד שלה כגון שרירי השלד, באמצעות התנגדות העורקים, הנימים. שרירי השלד אחראית ~ 80% של ספיגת הגלוקוז postprandial1. המסירה של אינסולין כדי interstitium שרירי השלד הוכח להיות שיעור הגבלת שלב עבור הפעולות מטבולית של אינסולין המקדמים גלוקוז סילוק2,3,4. בתוך 10-15 דקות, אינסולין מגדילה את האחסון נימי דם (microvascular גיוס), אפקט המתרחשת לפני מגביר זרימת דם הכולל5,6. גיוס microvascular מרחיבה אנדותל שטח זמין עבור חילופי חומרים מזינים (ו אינסולין)7,8. גיוס microvascular בתיווך אינסולין מקדים והיא קשורה באופן עצמאי עם שינויים שרירי השלד גלוקוז ספיגת8,9. ההשפעה של אינסולין על להערכת כינה ‘הרגישות לאינסולין כלי הדם’.
הוכח, כי גיוס microvascular בתיווך אינסולין, אינסולין-induced vasodilation לקוי שמנים צוקר חולדות10,11. יתר על כן, עכברים רזה עם צפיפות מופחתת נימי להציג שריר אינסולין ההתנגדות12. בעבודתם השפעה, ל”באנ. et al. הראה כי לקוי אינסולין איתות בתאי האנדותל נגרם צמצום בגיוס הנוצרות על-ידי אינסולין microvascular, אשר נוכה ספיגת הגלוקוז בשריר השלד כ 40%13. ליקויים אלו בתפקוד microvascular לא להתרחש רק בשריר, אלא גם ב מרובים רקמות ואיברים אחרים כגון הלב, כליות ואת הרשתית14,15,16. אלה דוגמאות אחרות מחקרים17,18,19,20 להציע כי ההשפעות כלי הדם של אינסולין הם מנגנון חשוב בפיזיולוגיה (פתו) של תנגודת לאינסולין שלה סיבוכים.
אמנם יש עדויות משמעותיות אינסולין מגדילה את נפח הדם microvascular (MBV) שרירי השלד5,6, המנגנון שבו זה יקרה אינם לגמרי מובן9. תלויי-אנדותל vasodilation חיוני בהיבטים רבים של כלי הדם אינסולין רגישות21,22,23 ברמות שונות של להערכת. הרגישות לאינסולין כלי הדם יכול להתבטא על ידי אינסולין-induced הרפיה של התנגדות העורקים על ידי הרפיה של רבים נימי מראש כדי להגדיל את perfused microvascular exchange שטח7,24, 25.
מיקרוסקופ intravital (IVM) שימש במגוון רקמות ההכנות כולל צ’יימברס skinfold של העכבר dorsum26, מצע המעי של עכבר, חולדה27, מודלים של איסכמיה איבר של העכבר28 ו כיס לחי של אוגר 29. בדיקת אולטרה סאונד משופרת לעומת זאת (CEUS) היא טכניקת הדמיה אחרת המאפשר להערכת microcirculation הלב30 , כמו גם שרירי השלד31. הוא מנצל microbubbles גז אינרטי מלא אשר מתנהגים rheologically כמו תאי דם אדומים ולהישאר לחלוטין בתוך כלי הדם לומן. Microbubbles אלה מעורבבים לווריד בקצב קבוע להשגת מצב יציב. גל אולטרסאונד אנרגיה גבוהה, לאחר מכן, יכול לשמש כדי להרוס את microbubbles. מהירות חידוש המלאי של microbubbles באזור של הריבית (ROI) מייצגת מהירות הזרימה (MFV). עוצמת אות סה של חדות התמונה מייצגת את MBV. CEUS יכול להתבצע שוב ושוב (גם אצל בני אדם), כולל מתקדמת את ההבנה של תפקוד כלי הדם המתרחשת במדינות אינסולין עמידים (שעלון בארט. et al. 32).
במחקר הנוכחי אנו מתארים שיטה חדשה ללימוד ויסות זלוף שריר, באמצעות שימוש בו-זמני של IVM והן CEUS. כאן אנו מתמקדים פעולות כלי הדם של אינסולין בתא המתוויך הגדול של hindlimb העכבר. אחת מקבוצות הגדולות שרירי השלד העכבר, הפעלת מחקרים של ספיגת הגלוקוז המקומי ב שריר נציג את התא. תא זה הוא אידיאלי עבור IVM כפי ההכנה הדמיה של העורקים נגישים בקלות באמצעות הליך כירורגי מתוקננת28. יתר על כן, קבוצה משלנו ואחרים הראו כי ניתן להשתמש CEUS זה33,תא34.
יש יתרון הטכניקה IVM ו CEUS המשולב הוא האפשרות להעריך את ההשפעה של אינסולין ברמה של רבים גדולים יותר (הזנה או התנגדות העורקים), את microcirculation (מיטות נימי) באותה קבוצת שרירים. בנוסף, היישום בו זמנית של שתי השיטות מספק תובנה הפעולה הזמנית של אינסולין ברמות של התנגדות העורקים, מנתחי מיקרו. זה בשילוב IVM, ניתן ליישם טכניקה CEUS גם בתחומים אחרים לביולוגיה. לדוגמה, התפקיד של חלבונים שונים בתנאים מסוימים הקשורים pathophysiological המשפיעים על אנדותל שניתן ללמוד באמצעות מודלים נוקאאוט. יתר על כן, ניתן להשתמש בשתי הטכניקות עכבר אחד בנקודות זמן מרובים לצמצם את זמן ועלות של מחקר.
פיתחנו שיטה להערכת בו-זמנית פעולות כלי הדם של אינסולין על העורקים גדול יותר (באמצעות IVM), את microcirculation שרירי השלד (באמצעות CEUS). השלבים הקריטיים למדידות מוצלחת ואמינה הם: 1) בצורה נכונה לחשוף את העורק העדין ללא דימום; 2) מניעת דליפה של שמן פרפין רוחצים את העורק; 3) יש גישה ורידית פטנטים (בצינורית וריד הזנב) עבור אינפוזיה של תרכובות vasoactive (אינסולין) ושל סוכן ניגודיות (microbubbles).
המחקר של תפקוד microvascular בשריר יש כבר צובר תשומת לב בהקשר של השמנת יתר, אינסולין ההתנגדות14,25,39,40. ההשפעה השלילית של השמנת יתר, תנגודת לאינסולין על תפקוד כלי הדם מתבטאת ברמות שונות של העץ כלי הדם. מעתה ואילך, גישות שונות נדרשים להעריך שינויים אלה. שימוש בשילוב של טכניקות IVM ו CEUS העכבר באותו מספק כלי רב עוצמה כדי לכמת את ההשפעות של אינסולין ברמות שונות של להערכת. IVM מאפשרת פריט חזותי ישיר וניתוח כמותי של העורק ההתנגדות, CEUS מאפשר הערכה של אינסולין-induced לשינויים שריר זלוף.
לומד תא השריר המתוויך יש מספר יתרונות. העורקים נגישים בקלות ומאפשר הטבע שטחית של החתך לסגור את העור החתך בתפר סטרילי שנספג 5.0 בסיום הניסוי. החיות היו הזריק subcutaneously הבופרנורפין לאחר הניסויים בתור מקבל במינון של 0.1 mg/kg, מותר לשחזר בסביבה חמה. העכברים נסבל היטב את ההליך, שחווינו אין איבוד חיות ולא זיהומים של hindlimb חיות יותר מ-35 למד. זה מאפשר מעקב או ללמוד החיות בצורה אורכית. החיים בניסויים אלה, עם זאת, היו ומורדמת באמצעות כ- 1.8% בשאיפה איזופלוריין מאוזן עם חמצן לזרום ב 0.4 L/דקה של מסיכת ההרדמה. בניגוד איזופלוריין הרדמה41,42, FMA הרדמה לא להפריע הרגישות לאינסולין היקפיים. תוכנית עתידית היא ללמוד כמה טוב העכברים להתאושש FMA הרדמה.
תא השריר המתוויך שימושי גם מאז vasoactive תרכובות שונות מתווכים מקומיים, ניתן להעריך השפעות וסקולרית במורד הזרם. לדוגמה, יישום מקומי של תרכובות אלו ברקמות היעד הוא ריאלי באמצעות טכניקות superfusion28 או השתלה של האזיקים משחררי המקיפים את כלי43מניפולציה כירורגי. יתר על כן, העורק העדין יכול להיות מבודדת ולמד ב myograph הלחץ. הקבוצה שלנו ואחרים נאספו ראיות משמעותי באמצעות myograph את הלחץ כדי לתעד את ההשפעות של אינסולין ותרכובות אחרות vasoactive על זה העורק שמחוץ36,37,38.
מגבלה הטמונה בשימוש של הטכניקה IVM הוא אקספוזיציה כירורגי של שריר ויישום של שמן פראפין לייצב את כלי הדם. . זה לא ברור אם פעולות אלה השפעה על הסביבה המקורית של העורק. עם זאת, איור 3A מראה כי הקוטר בסיסית של העורק העדין טובל בשמן פרפין אינו משתנה במידה ניכרת. גם הוכח כי שמן מינרלי מעכבים בהצלחה פעפוע של חמצן, הגנה על הרקמה מפני תנאים hyperoxic44. יתר על כן, השמן מסייע להפחית את הווריאציה קוטר הבסיס של העורקים. זו הסיבה מדוע אנו עו ד כדי להשתמש בשמן פרפין. ותן הכנה במשך לפחות 30 דקות. ראוי לציין, השימוש במאגר תמיסת. סאלין במקום שמן – או בלי שמן בכלל – הביא קטרים משתנה מאוד, כיווץ של כלי השיט (נתונים לא מוצג). יתר על כן, בסוף הניסויים, אנחנו מבודדים את העורקים העדין – טובל בשמן פרפין – ובדק תגובתיות שלהם ב- myograph הלחץ ex-vivo. העורקים שטוף שמן פרפין הגיבו באופן דומה כדי לשלוט העורקים אחרי גירוי עם אינסולין, אצטילכולין (מרחיב כלי דם) (נתונים לא מוצג). Vasodilation עקבית אינסולין-induced מראה בבירור כי הפרוטוקול IVM המתוארים במחקר זה מייצרת תוצאות אמינות.
היתרון של החלת בשתי הטכניקות העכבר באותו מתגבר על חלק מהמגבלות מהותי של טכניקה אחת בידי הצד השני: CEUS העריכה MBV ב השריר ללא הפרעה ויוו, אבל ניתן לראות כלי שיט פרטניים; IVM מאפשר לראות כלי בודדים, גם אם זה לא יכול להעריך MBV. תוכנית עתידית היא לנצל IVM מיקרוסקופיה של שריר cremaster בשילוב עם CEUS של השריר המתוויך בצד contralateral. שינוי זה יכול לספק הערכה של MBV (באמצעות CEUS), גישה ישירה אופטי הנימים (באמצעות IVM). הפרוטוקול ניתנות לשינוי נוסף; המחבר 4-way המשמש את הצינורית הזנב יכולים לפעול מחבר חמישה כיוונים. על ידי זה, נוכל להימנע ניתוק הצינור הרדמה תוך כדי ביצוע המדידה CEUS השני (המתוארים בפוינט 2.9). מניסיוננו, העכברים נסבל היטב את הפרוטוקול הנוכחי. שינוי אחר שניתן לעשות כדי פרוטוקול זה הוא הקצב קלאמפ אינסולין משמש. השתמשנו 7.5 קצב מו/kg/min קלאמפ הנחשב העל-פיזיולוגיים. המחקר, קצב קלאמפ אינסולין נמוך יותר (לדוגמה 3 מו/kg/min) יכול לשמש בהתאם.
אמנם מצאנו את הפרוטוקול המתואר אמין, ישנם מגבלות מסוימות שדורשים תשומת לב. ישנם מקרים בהם המידה של קוטר העורקים אינה אופטימלית. מבצע ההכנה דורש קצת ניסיון עם הדגם. זה הכרחי כי שמן פרפין אינה דולפת מהסביבה כלי שכשהם אותו בשמן החדש להפריע את כלי הקיבול, לשנות את הקוטר, ולכן יש צורך קילדאש עורק למשך עוד 30 דקות. בנוסף, השתקפות האור (שמתואר בשלב 1.14 לפרוטוקול) על פני השטח של שמן פרפין היה לפעמים בהירים מדי, ולכן קשה להציג את העורק. זה יכול להיות counteracted על ידי הפניית מקור האור כך שהאור מגיע בזווית כדי שמן פרפין משטח, במקביל העורק.
לסיכום, השילוב של IVM וטכניקות CEUS המתוארים במחקר זה מאפשר לכמת אפקטים שונים של אינסולין ברמות שונות של להערכת. IVM של העורק העדין מספק תובנה לגבי השינויים בכלי הדם במעלה לתרום זלוף microvascular במורד הזרם נמדד באמצעות CEUS. אנחנו עו ד השילוב של מספר טכניקות ניסיוני העכבר אותו טוב יותר להעריך את תפקוד כלי הדם.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים Ing. דאנקן השמש ואן בתיכנות את תוכנת ניתוח התמונה (ImageGrabber) נעשה שימוש במחקר זה. מימון עבור מחקר זה סופק על ידי מענק להם מארגון הולנד למחקר מדעי (גרנט 016.136.372).
C57BL/6 Mice | Charles river | Mice used were bred in-house | |
Vevo 2100 high-resolution ultrasound system | VisualSonics inc. | ||
MS250 non-linear transducer | VisualSonics inc. | ||
Vevo 2100 software | VisualSonics inc. | ||
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves |
Vortex | VWR international | 58815-234 | |
Heating pad | Pantlab | ||
Freestyle Precision Xceed | Abbott | To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp | |
Insulin Novorapid | Novo Nordisk | ||
Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1083421000 | |
Buffered saline solution | B. Braun | 152118062 | |
PE-20 medical tubing | Becton, Dickinson and Company | 427405 | |
Needle, 27 Gauge | Becton-Dickinson & Co | 305109 | |
Medical tape | 3M | ||
Ultrasound probe holder | Built In-house | ||
Cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
Creme depilator | Multiple Equivalent | ||
Gel tissue adhesive | Derma+flex | GA30005-2222 | |
Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
Small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Straight forceps with fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-20 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
Camera | Basler | scA1390-17gc | |
Image Grabber program | Built in-house | Image acquisition system | |
Timer | VWR | 33501-418 | |
Syringes, 1 ml | Fisher | 14-817-25 | |
Light source, fiber-optic | Schott | KL1500 | Ideally has adjustable arms |
Paraffin oil | Multiple Equivalent | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microbubbles | |||
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
polyoxyethylene stearate | Sigma | p3440 | |
perfluorobutane gas | F2 Chemicals | C4F10(g) | |
Decon FS200 ultrasonic bath | Decon Ultrasonics Ltd | ||
Vialmix | Lantheus Medical Imaging | 515370-0810 | |
Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc |