Proksimal afdød Lårben Forberedelse til brudstyrken Test og Quantitative CT-baserede Finite Element Analysis

Summary

Vi præsenterer en robust protokol om, hvordan man omhyggeligt bevare og forberede Nekro lår for fraktur test og kvantitativ computertomografi billeddannelse. Fremgangsmåden tilvejebringer præcis kontrol over input betingelser med henblik på at bestemme forholdet mellem knoglemineraltæthed, brudstyrken, og definere finite element model geometri og egenskaber.

Abstract

Nekro fraktur test anvendes rutinemæssigt til at forstå faktorer, der påvirker proximal femur styrke. Fordi ex vivo biologisk væv er tilbøjelige til at miste deres mekaniske egenskaber over tid, modellen skal udføres forberedelse til eksperimentelle test omhyggeligt for at opnå pålidelige resultater, der repræsenterer in vivo betingelser. Derfor har vi designet en protokol og et sæt inventar til at forberede de femorale prøver således, at deres mekaniske egenskaber oplevet minimale ændringer. Femora blev holdt i frossen tilstand, undtagen ved tilberedningen trin og mekanisk prøvning. De relevante kliniske foranstaltninger af total hofte og lårbenshals knoglemineraltæthed (BMD) blev opnået med et klinisk dobbelt røntgenabsorptiometri (DXA) knogle densitometer, og 3D-geometri og distribution af knoglemineral blev opnået ved anvendelse CT med en kalibrering fantom for kvantitative skøn baseret på gråtone værdier. Enhver mulig knoglesygdom, frakturEller tilstedeværelsen af ​​implantater eller artefakter påvirker knoglestruktur, blev udelukket med X-ray scanninger. For forberedelse blev alle knogler omhyggeligt renset for overskydende blødt væv, og blev skåret og potteplanter på det interne rotation vinkel af interesse. En skærende fikstur tillod den distale ende af knoglen, der skal afskæres forlader den proximale femur ved en ønsket længde. For at tillade positionering af lårbenshalsen på foreskrevne vinkler under senere CT scanning og mekanisk prøvning, blev de proximale femorale aksler pottet i polymethylmethacrylat (PMMA) med en armatur designet specielt til de ønskede orienteringer. De indsamlede fra vores eksperimenter data blev derefter anvendt til validering af kvantitativ computertomografi (QCT) -baseret finite element analyse (FEA), som beskrevet i en anden protokol. I dette manuskript, præsenterer vi protokol for den præcise forberedelse knogle til mekanisk afprøvning og efterfølgende QCT / FEA modellering. Den nuværende protokol blev anvendt med succes til at forberede omkring 200 cadaveric lårben over en 6-års periode.

Protocol

BEMÆRK: Alle undersøgelser præsenteres i denne protokol blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) på Mayo Clinic. Knoglerne blev opnået over en periode på 6 år fra forskellige organisationer. Alle prøver blev indsamlet inden for 72 timer død, svøbt i saltvand mættede håndklæder, og opbevares ved -20 ° C indtil forberedelse.

1. Måling Bone Mineral Density Brug DXA

1. Fjern eksemplarer, der holdes ved -20 ° C fryser tø op ved stuetemperatur i ca. 24 timer; prøver behøver ikke at blive fjernet fra original emballage, hvis de fleste blødt væv er blevet fjernet.
2. Brug to 5 lb poser ris til regnskab for blødt væv. Dæk de to ris poser på DXA bordet med plastikposer for at forhindre forurening. Ris tasker vil simulere omgivende bløde væv (in vivo) under scanningen som vist i figur 1.
3. Beskytte overfladen af ​​DXA scanner med plast foret papir og placere 2 plast indpakket rice poser på scanneren bordet (figur 1A).
4. Lå 2 femora (højre og venstre) på toppen af risprodukter poser, således at den proksimale ende (herunder femurhovedet) er centreret på poser og den bageste side er nede (figur 1B). Dette efterligner en patient, der ligger på ryggen.
5. Cover anterior / eksponerede proksimale femur ende med yderligere to 5 lb ris poser (Figur 1C).
6. Position maskine hovedet over proksimale femur og scanne lårbenet i henhold til standarden institutionelle procedure for patient BMD måling (figur 1C). Følge de specifikke DXA producentens instruktioner.
   1. Fra DXA maskine software interface udføre en normal femur scanning. Vælg lårbenet eksamen, placere DXA arm oven på Nekro lårben ved at trykke på den venstre eller højre pil i overensstemmelse hermed på DXA armen, og start eksamen ved at klikke på knappen "start". Udfør den BMD-analyse ved at klikke på "Analyze".
      IKKEE: Den resulterende automatiske T-score fra scanningen klassificerer knoglen som normalt, osteopeni eller osteoporose (Figur 1D). Følge de specifikke DXA producentens instruktioner.

2. Rengøring, Skæring og Boring den distale ende af Bone

1. Rengør mest proximale 300 mm fra lårbenet ved omhyggeligt at fjerne eventuelt resterende blødt væv fra knoglen. Dette trin er nødvendigt for at tillade PMMA at kontakte knogle under pottet processen som forberedelse til mekanisk afprøvning. Knoglerne behøver ikke at blive optøet til stuetemperatur i denne proces.
2. Sanitize arbejdsområdet med 70% isopropylalkohol og dække bordet med absorberende papir pads med plastfolie på den ene side (figur 2A). Sætte hele lårben på bordet (figur 2B) for hele processen starter med rengøring udklipning (figur 2A til 2H). Brug personligt beskyttelsesudstyr (PPE), herunder handskerog øjenbeskyttelse.
3. Skrabes overskydende periosteum og skæres overskydende væv væk med en skraber og skalpel (figur 2C, 2H).
4. Placer knogle i skræddersyet skæring stativ som vist i figur 2D med lederen af lårben mod akryl plade af armaturet.
5. Juster og hold diafysen mod de to stifter på skærende armaturet (figur 2D).
6. Fastgør knoglen til fastholdelsesanordningen ved at stramme ned den opslidsede plade på diafysen; hvis ben ikke udgør ligge fladt på stativ, hænge distale ende off bordplade og også eventuelt zip binde lårbenshalsen efter behov for at holde prøven på plads (figur 2D).
7. Skær den distale skaft af femur under anvendelse af støbte kniv (figur 2E) gennem slidsede plade som en vejledning; hold knogle med en tør klud / håndklæde for bedre greb.
8. Fjern knoglen fra opspændingsanordningen; normal knogle længde efter cut er 255 mm (figur2F).
9. Rens medullære kavitet marv under anvendelse af en curette ca. 25 mm dyb. Sæt derefter en gaze svamp til at hjælpe tørre den indvendige overflade. Fjern gaze lige før anbringelse af den distale ende af lårbenet i formen. Grip knoglen med et tørt håndklæde / klud og bore et 10 mm hul gennem den distale ende på ca. 25 mm fra den proksimale skåret ende af prøven. Bemærk: Dette er for at tillade PMMA at trænge kanalen og fastgøre knoglen fast.

3. Potting Bone

1. Design og fabrikere pottemuld container. De pottemuld beholdere er fremstillet af 5 mm tykke acrylplader og har følgende ydre dimensioner: 50 mm x 50 mm kvadratisk tværsnit og 100 mm høj (figur 3a).
2. Label pottemuld beholder med passende knogle identifikation (figur 3A og 3B - se label på akryl boks).
3. Juster indlejring armaturet til den korrekte orientering (venstre beneller højre ben; fx 15 ° eller 30 ° intern rotation).
4. Placer pottemuld beholder i bunden af indlejring fikstur, sted knogle i pottemuld beholder (figur 3B) og ret hals med markøren i stativet (figur 3C) for at justere det indre drejningsvinkel af knoglen til den ønskede værdi.
5. Mål 60 g PMMA pulver og blandes med 30 g flydende harpiks under stinkskabet indtil pulveret er opløst. Blandingen skal være hældbart. Brug en papir kop til denne proces.
6. Hæld blandingen i pottemuld beholder med knogle under en emhætte (figur 3D), tillader at hærde i cirka 10 - 15 min, indtil PMMA er klar og hård. Dette bør kun fylde ~ 1/2 af pottemuld beholder med PMMA. Wrap forsigtigt knogle i saltvand mættet håndklæder til at forhindre væv tørhed på grund af varme generation under PMMA polymerisation (figur 3E).
7. Tjek jævnligt lårbenet at sikre, at det forbliver justeret ibeholder under hærdning.
8. Fjern lårben fra pottemuld stativ og wrap med en saltvand gennemblødt køkkenrulle (figur 3E).
9. Forbered 90 g PMMA under en emhætte som forklaret i trin 3.5 og fylde pottemuld beholderen fuldstændigt. Helbrede PMMA for cirka 10 - 15 min, indtil det bliver hårdt.
10. Efter harpiks er hærdet, stramt wrap / Linjebrydning knogle i saltvand gennemblødt papirservietter, dække med plast pose og opbevar prøver ved -20 ° C i fryseren.

4. Imaging Bone med røntgen

(ADVARSEL! Betjen med ordentlig pleje for røntgenstråling ved brug af maskinen)

1. Hvis du bruger film til røntgenstråler, drej X-ray udvikler på mindst 20 min (pr producent instruktioner) før scanning ved at dreje knappen med uret (i udvikleren værelse).
2. Sørg ueksponerede film i kassetten før røntgenstråling; kassette bør kun åbnes i et mørkt rum.
3. Tænd maskinen på tillåse og udvide maskinens hoved.
4. Placer en vogn under strålens bane og placere en kassette på vognen under bjælken (figur 4A).
5. Sted og placere lårbenet på kassetten (figur 4B); to orienteringer vil blive fanget: medial-lateral view og anterior-posterior view. Mærk de eksemplar billeder i overensstemmelse hermed.
6. Efter første eksponering, bytte føringen og knogler steder.
7. Dæk allerede eksponerede halvdel med bly og udsætte knogle i den anden retning på den ikke-udsatte side. Dette giver brugeren mulighed for at bruge en røntgenfilm for en enkelt knogle i to orienteringer (figur 4C-D).
8. Skift kassetten og drej hver lårbenet ind i den anden retning.
9. I tilfælde af en enkelt lårben, dække halvdelen af ​​kassetten med en ledende dække for at undgå initial eksponering af hele filmen for røntgenstråler.
10. Flyt bag bly-foret bærbare væg til personlig beskyttelse og brug udløseren for at eksponereknoglerne.
11. Ved afslutningen, returnere røntgen hoved til at låse og gemme position, drej nøglen til OFF på X-ray maskine og fjern udsat røntgenfilm.
12. Udvikle filmen til opnåelse røntgenbilleder (Figur 4E) under anvendelse af en regelmæssig film udvikler. Tænd det hvide lys i rummet og find filmen udvikler. Tænd for rødt lys, og sluk det hvide lys, før du åbner kassetten og fortsætte med filmen udvikler processen. Åbn kassetten og sætte filmen gennem udvikleren. Tænd for hvidt lys og slukke det røde lys, når filmen er blevet udviklet.

5. CT Scanning of Bones

1. Fjern knogler fra fryseren ca. 24 timer inden der scannes. Knogler skal være helt optøet før scanning.
2. Sørg knoglerne er pakket ind i plastikposer til scanning for at minimere oprydning i slutningen.
3. Sted og fastgør lårben og kalibreringen fantom i CT scanning stativet (figur 5A-B). fixture holder kalibreringen fantom (figur 5C) og har ligeledes lårbenet i en orientering (figur 5D-E) er identisk med den, der ønskes til efterfølgende mekanisk test orientering. Denne cross registrering er påkrævet for at bruge data fra CT-scanning (figur 5F) i QCT / FEA modelleringsprocessen (beskrevet i en anden protokol).
   BEMÆRK: Armaturet er udformet således, at det udsætter lårbenet for CT scanning uden at hindre den proksimale femur (femorale hoved, hals, store lårbensknude, og proksimale skaft).
4. Sørg for, at stativet sammen med lårbenet i CT-scanneren er korrekt justeret ved hjælp af systemet lasere som guider (Figur 5D-E). Re-check tilpasningen af ​​armaturet med CT lange akse laser (ved at trykke på laser on / off-knappen). Fantomet behøver ikke at være på linie med den laser som den er fastgjort i armaturet. Nul tabellen position fra kontrolpanelet på maskinen ved at trykke på knap e nuln (→ 0 ←) på kontrolpanelet.
5. Efter CT standardprocedure, betjene CT maskine ved 120 kVp, 216 mAs, 1 s rotation tid, og tonehøjden af ​​en bruger ultrahøj opløsning mode (Zuhr). Dette giver en skivetykkelse på 0,4 mm, og en pixelstørrelse på 0,30 - 0,45 mm afhængigt af størrelsen af ​​synsfeltet (FOV).
6. Tjek CT-scanning data forud for mekanisk test for at sikre, at billeder af interesse indfanges og gemmes. Refreeze knoglen ved -20 ° C, indtil dagen for eksperimentet.

Representative Results

De kadaver lårben blev afsendt frosset og holdt ved -20 ° C indtil fremstilling begyndte. BMD scanning blev udført under anvendelse af en DXA scanner til at måle total hofte og BMD samt T-score for hver prøve (figur 1). En T-score er antallet af standardafvigelser af målte BMD sammenlignet med gennemsnitlige værdier for unge raske forsøgspersoner. Det kan være lige fra -2,5 eller lavere for osteoporotiske knogler, mellem -1 og -2,5 for osteopeniske knogler og højere end -1 for normale knogler. Når det er afsluttet, knogler blev renset for overskydende væv og skæres for at fjerne den distale ende ved hjælp af en in-house designet og fremstillet skæring stativet (figur 2). Prøverne blev derefter pottes distalt ved anvendelse af et armatur til fastholdelse knoglerne i den ønskede indadrotation orientering; efter anbringelse af den distale ende i pottemuld beholderen, PMMA i flydende form blev hældt at fylde beholderen (figur 3 (figur 4). I nærvær af sådanne abnormiteter, bør tilstanden af ​​knoglen dokumenteres ved betragtning ved senere analyser. Endelig femora var CT-scannes for at opnå CT billeder, ved hjælp af en acryl CT scanning armatur udformet til at holde knoglen i passende forudbestemte orienteringer (adduktion og indadrotation vinkler) (figur 5). CT billeder bruges for at opnå 3-dimensional knogle geometri og volumetrisk knoglemineral distribution, der anvendes i kvantitativt CT-baserede finite element analyse. Forud for efterfølgende fraktur test, blev alle relevante data, der kendetegner hver lårbenet såsom BMD værdier, røntgenbilleder og CT-billeder kontrolleres for at sikre, at data af interesse blev registreret og gemt.

Figur 1: BMD Måling Brug DXA scanning. (A) Ris poser og plast foret papir; (B) To knogle prøver i de ønskede orienteringer i scanner seng; (C) proksimale femur ender dækket med 2 ris poser under scanningen; (D) Hals og hofte BMD-målinger med tilhørende T-scores. DXA scanningen udføres under anvendelse af en klinisk scanner til at måle knoglemineraldensitet og skøn T-score. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Rengøring og Cutting Bones. (A) Rengøring og opskæring skrivebord; (B) knogle prøve værktøjer til rening; (C) rengøring skaftet af en femur; (D) at opnå en prøve i den skærende stativ; (E) støbt cutter; (F) afsluttet prøve efter opskæring. En særlig stativ og knogler rengøring og skærende værktøjer bruges til at forberede den mest proksimale 255 mm længde til test; (G) curette anvendes til rensning intramedullære kanal af femur; (H) værktøj til rengøring overfladiske væv i prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Femur Rengøring og Potting Process. (A) Potting stativ; (B) potning et lårben i armaturet; (C) indstilling indadrotation vinkel til den ønskede værdi; (E) potteplanter knogle pakket ind i en saltvand mættede håndklæder. En særlig fikstur anvendes til at indstille det indre drejningsvinkel til en bestemt værdi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Bone X-ray Process. (A) X-ray maskine; (B) knogle prøve på en kassette med eksponerede film, er en anden halvdel af kassetten er dækket af bly for at undgå eksponering af hele filmen; (C) anbringelse ueksponerede film i lastning bakke af bygherren i et mørkt rum; (D) fremkaldte film; (E) resulterende røntgenbillede af en sund lårbenet. X-ray udstyr anvendes til at scanne knoglerne i to positioner for at udelukke forudgående fractures, implantater, knoglemetastaser, eller eventuelle strukturelle abnormiteter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: CT Scanning Brug af en Akryl Fixture til Hold Bones i en ønsket retning. (A) CT-scanner; (B) glasfiber femur monteret i en akryl armatur til at holde knoglerne i en ønsket orientering; (C) montering af en afdød lårben i armaturet; (D) lodrette justering af fiksturen med CT længdeakse laser; (E) Justering af lårbenet. Et in-house designet fikstur anvendes til at holde knoglen i en stilling identisk med den efterfølgende testning position; knogle alignment opnås ved hjælp af CT indbyggede lasere; (F) Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi præsenteret en robust knogle forberedelse protokol for at sikre mekanisk afprøvning og QCT / FEA modellering af femoral styrke i en sidelæns fald på hoften konfiguration. Denne metode blev vores standard in-house-protokol. I løbet af 6 år, med varierende personale, omkring 200 lårben lykkedes udarbejdet efter denne protokol. Resultaterne af protokollen omfatter klassificere knogle betingelser ved hjælp af DXA, udelukke metastatiske sygdomme, tidligere frakturer, eller implantater ved hjælp af røntgen, og få mineralsk distribution og 3D geometri ved hjælp af CT til efterfølgende QCT / FEA modellering. Skæring, pottemuld, og scanning fixtures blev designet til at rumme venstre og højre lår samt for forskellige knogle orienteringer nødvendige for de kommende afprøvning, modellering og analyse. De in-house inventar sikret repeterbarhed og reproducerbarhed af prøver.

På grund af kompleksiteten af ​​knogle- eksperimenter og behovet for kombinationen af ​​BMD, X-ray, og CT scanning før mekanisk afprøvning, skal lårben gennemgå flere fryse / tø cykler. Med en ordentlig protokol, der minimerer udsættelse for stuetemperatur, frysning knogleprøver bevarer vævet til mekanisk prøvning, endog lang sigt ^{3, 4.} Tidligere undersøgelser har vist, at frysning knogler ved -20 ° C ikke ændrer deres mekaniske egenskaber, og at et par fryse / tø cykler før afprøvning betragtes som en sikker og gennemførlig proces ^{5, 6.} I vores undersøgelse, alle femora oplevet tre fryse / tø-sekvenser ved -20 ° C og stuetemperatur, henholdsvis for DXA scanning, CT-scanning, og mekanisk prøvning.

På linje med flere tidligere undersøgelser blev standardiserede ris poser bruges under måling BMD værdier af prøver vha DXA at efterligne in vivo bløde væv omkring knogler ^7. Vi sammenlignede BMD værdier i vort Nekro cohort med BMD værdier af forskellige patientpopulationer og fundet deres distributioner til at være meget ens, hvilket tyder robustheden af vores protokol for BMD-målinger ^8.

Femorale prøver mangler plane overflader til at være let og korrekt justeret til en ønsket orientering til testning. Hvis ikke gøres ordentligt, kan det påvirke gentagelsesnøjagtighed af proceduren og begrænse nøjagtigheden af de eksperimentelle resultater ^9. For at løse dette problem blev flere armaturer designet og fabrikeret og standardprocedurer blev gennemført for at gøre væv håndtering uafhængige af brugernes færdigheder gennem hele prøven forberedelsesprocessen. Mens lår blev erhvervet og afprøvet over flere år, protokollen og hardware forblev den samme reduktion af potentielle fejl forberedelse.

Et vigtigt skridt i vores knogle forberedelse proces var at udføre CT-scanning for 3D-modellering af knoglebrud ved hjælpQCT / FEA. Således registrering mellem CT-scanning og fremtidige fraktur test var et nødvendigt skridt i vores femoral prøveforberedelse protokol ^10.

Den nuværende fremgangsmåde til knogle præparat har nogle begrænsninger. Selv omhyggelig planlægning blev gennemført under købet af kadavere, dissektion, pottemuld og CT-scanning, planlægning de forskellige faser i lårbenet forberedelse kan være udfordrende på grund af personale og udstyr tilgængelighed. Vores proces kræver prøverne skal fryses og optøs ved forskellige tidspunkter. Alligevel indfrysningstiden oversteg aldrig mere end to uger, og knoglerne blev udsat for i alt tre fryse / optøningscykler. Også knoglen fremstillingsproces var designet til at minimere operatørfejl. Vi observerede kun en fejl i pottemuld den distale ende af den proximale lårben. Et højre ben lårben blev pottet på det forkerte indadrotation vinkel, som blev opdaget efter CT scanning. Efterfølgende this lårben blev kasseret fra yderligere dataanalyse. Derfor kan der være behov en anden operatør for dette trin for at kontrollere, om orienteringen af ​​lårben før hælde den PMMA for indstøbning. Ingen andre fejl blev observeret i nogen af ​​de andre trin. Således er det væsentligt at bemærke, at vores proces var meget robust tillader kun én fejl, med flere operatører, under fremstillingen af ​​ca. 200 proximal femur i løbet af flere år.

At give en god kvalitetskontrol system, der vil minimere sandsynligheden for betjeningsfejl, visse dele af protokollen skal gentages eller kontrolleres igen af ​​en anden operatør. For eksempel bør der udvises forsigtighed under pottemuld at sikre, at lårbensskaftet bores at tillade knoglecement at indtaste lårbenet hulrum, der garanterer, at lårbenet stift er fast og vil ikke løsnes under testen. Derudover pottemuld lårbenet i den interne rotation vinkel af interesse er normalt udføres af én operatør. Før the PMMA hældes til potning den distale ende, kan en anden operatør være forpligtet til at kontrollere, at den interne rotation vinkel blev fastsat til den ønskede værdi. Endelig under CT scanning af lårbenet, tilpasning af armaturet holder knoglen på CT-scanner sengen er kritisk. En operatør skal præcist tilpasse armaturet med CT-laserstråler og en anden operatør skal bekræfte, at armaturet er korrekt justeret.

Mens den nuværende protokol designet specielt til fraktur test og modellering af femorale prøver i en sidelæns fald på hoften konfiguration, kan det let udvides til andre lastning scenarier, herunder ikke-destruktiv prøvning, eller vedtaget for at teste andre knogle typer med passende armatur redesign .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CT potting container and scanning fixture	Internally manufactured	N/A	Custom designed and manufactured
CT scanner	Siemens	Somatom Definition scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT scanning equipment
Quantitative CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT calibration Phantom	Used for obtaining BMD values from Hounsfield units in the CT image
Dual Energy X-ray Absorptiometry scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA scanner for bone health or any similar BMD scanners
Hygenic Orhodontic Resin (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Controlled substance and can be purchased with proper approval
Freezer	Kenmore	N/A	This is a -20 °C storage for bones
X-ray scanner	General Electric	46-270615P1	X-ray imaging equipment.
X-ray films	Kodak	N/A	Used to display x-ray images
X-ray developer	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Used for developing X-ray images
X-ray Cassette	Kodak X-Omatic	N/A	Used for holding x-ray films
5-pound Rice Bags	Great Value	N/A	Used for mimicking soft tissue during the DXA scanning process
Physiologic Saline (0.9% Sodium Chloride)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Used for keeping samples hydrated
Scalpels and scrapers	Bard-Parker	N/A	Used to clean the bone from soft tissue
Cast cutter	Stryker	810-BD001	Used to cut femoral shaft
Drilling machine	Bosch	N/A	Used to drill the femoral shaft
Fume Hood	Hamilton	70532	Used for ventilation when using making PMMA