Proksimale avdød Femur Forberedelse til Fracture Styrke Testing og kvantitativ CT-basert Finite Element Analysis

Summary

Vi presenterer en robust protokoll om hvordan å nøye bevare og forberede avdød lårben for brudd testing og kvantitativ computertomografi bildebehandling. Metoden gir presis kontroll over inngangsvilkår for det formål å bestemme forholdet mellom bentetthet, bruddstyrke, og definere finite element modellen geometri og egenskaper.

Abstract

Avdød brudd testing er rutinemessig brukt til å forstå hvilke faktorer som påvirker proksimale femur styrke. Fordi ex vivo biologisk vev er tilbøyelige til å miste sine mekaniske egenskaper over tid, prøven forberedelse for eksperimentell testing må utføres nøye for å få pålitelige resultater som representerer in vivo forhold. Av den grunn har vi utviklet en protokoll og et sett av oversikten for å fremstille de femorale prøvene slik at deres mekaniske egenskaper opplevd minimale endringer. De lårben ble holdt i en frossen tilstand bortsett fra under forberedelse trinn og mekanisk testing. De relevante kliniske tiltak av total hofte og lårhals beinmineraltetthet (BMD) ble oppnådd med en klinisk dual X-ray absorpsjonsmetri (DXA) bein densitometer, og 3D-geometri og distribusjon av beinmineral ble oppnådd ved bruk av CT med en kalibrerings fantom for kvantitative beregninger basert på gråtone verdier. Enhver mulig bensykdom, brudd, Eller tilstedeværelse av implantater eller gjenstander som påvirker beinstrukturen, ble utelukket med røntgenskanning. For forberedelse, ble alle bein nøye renset av overflødig bløtvevet, og ble kuttet og puttet på intern rotasjon vinkel av interesse. Et skjære lampen tillates den distale enden av benet som skal kappes av forlater den proksimale femur ved en ønsket lengde. Å tillate posisjonering av lårhalsen på foreskrevet vinkler under senere CT scanning og mekanisk testing, ble de proksimale femoral skaft puttet i polymethylmethacrylate (PMMA) med en armatur utviklet spesielt for ønskede orienteringer. De oppsamlede fra våre eksperimenter data ble deretter brukt for validering av kvantitativ computer tomografi (QCT) -baserte finite element analyse (FEA), som beskrevet i en annen protokoll. I dette manuskriptet, presenterer vi protokollen for nøyaktig bein forberedelse for mekanisk testing og påfølgende QCT / FEA modellering. Den nåværende protokollen ble vellykket anvendt for å forberede ca 200 cadaveric lårben over en 6-års periode.

Protocol

MERK: Alle studier presentert i denne protokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved Mayo Clinic. Benene ble oppnådd over en periode på 6 år fra ulike organisasjoner. Alle prøvene ble samlet inn i løpet av 72 timer etter døden, innpakket i saltvann mettet håndklær, og lagret ved -20 ° C til forberedelse.

1. Måling bentetthet ved bruk av DXA

1. Fjerne prøvene holdt ved -20 ° C fryser for å tine ved romtemperatur i ca. 24 timer; prøvestykker behøver ikke å bli fjernet fra originalemballasje hvis mest bløtvev er fjernet.
2. Bruk to 5 lb poser med ris til å gjøre rede for bløtvev. Dekke de to ris poser på DXA bordet med plastposer for å hindre forurensning. Ris-poser vil simulere omgivende bløte vev (in vivo) under skanning som vist i figur 1.
3. Beskytt overflaten av DXA skanner med plast linjert papir og plassere 2 plast brytes rice poser på skanneren bordet (figur 1A).
4. Lå 2 lårben (høyre og venstre) på toppen av ris poser slik at den proksimale enden (inkludert lårbenshodet) er sentrert på vesker og den bakre side er nede (figur 1B). Dette etterligner en pasient liggende på ryggen.
5. Cover anterior / utsatt proksimale femur ende med ytterligere to 5 lb ris poser (figur 1C).
6. Posisjon maskin hodet over proksimale femur og skanne femur i henhold til standarden institusjonelle prosedyre for pasient BMD måling (figur 1C). Følg de spesifikke DXA produsentens instruksjoner.
   1. Fra DXA maskinen programvaregrensesnitt utføre en normal femur scan. Velg femur eksamen, plasser DXA arm på toppen av avdød femur ved å trykke på venstre eller høyre pil tilsvar på DXA arm, og starte eksamen ved å klikke på "Start" -knappen. Utfør BMD analyse ved å klikke på "Analyze".
      IKKEE: Den resulterende automatisk T-score fra skanningen klassifiserer benet som normalt, osteopene eller osteoporotisk (figur 1D). Følg de spesifikke DXA produsentens instruksjoner.

2. Rengjøring, skjæring og boring den distale enden av Bone

1. Rengjør de proksimale 300 mm av femur ved å forsiktig fjerne eventuelle gjenværende mykt vev fra benet. Dette trinnet er nødvendig for å tillate PMMA til kontakt med benet i løpet av støpeprosessen i forberedelse for mekanisk testing. Benene behøver ikke tines til romtemperatur i denne prosessen.
2. Rense arbeidsplass med 70% isopropylalkohol og dekke bordet med absorberende papir pads med plastfilm på den ene siden (figur 2A). Sette hele lårbenet på bordet (figur 2B) for hele prosessen starter med å rense for å kutte (figur 2A til 2H). Bruk personlig verneutstyr (PVU) inkludert hanskerog vernebriller.
3. Skrap av overflødig periosteum og klippe bort overflødig vev med en skrape og skalpell (figur 2C, 2H).
4. Plasser bein i skreddersydde cutting ligaen som vist i figur 2D med hodet av femur mot akryl plate av ligaen.
5. Rett og hold diaphysis mot de to pinnene på skjære ligaen (figur 2D).
6. Fest benet til ligaen ved å stramme ned i sporet plate på diaphysis; hvis bein ikke ligge flatt på ligaen, henger distal ende av bordplaten og også eventuelt zip tie lårhalsen som nødvendig for å holde prøven på plass (figur 2D).
7. Skjær den distale skaftet av femur med støpt cutter (figur 2E) gjennom slotted plate som en guide; holde bein med en tørr klut / håndkle for bedre grep.
8. Fjern bein fra ligaen; normal beinlengde etter kuttet er 255 mm (figur2F).
9. Rengjør medullary hulrommet i margen ved hjelp av en curette ca 25 mm dypt. Deretter setter en gasbind svamp til å hjelpe tørke den indre overflaten. Fjern det gasbind like før plassere den distale enden av femur i formen. Grip bein med et tørt håndkle / klut og bore et 10 mm hull gjennom den ytre enden på ca 25 mm fra den proksimale kuttet slutten av prøven. Merk: Dette er for å tillate PMMA å trenge inn i kanalen og sikre benet fast.

3. Potting the Bone

1. Design og dikte potting container. De potting Beholderne er laget av 5 mm tykk akrylplater og har følgende utvendige dimensjoner: 50 mm x 50 mm kvadratisk tverrsnitt, og 100 mm høye (figur 3A).
2. Etikett potting beholder med riktig bein identifikasjon (figur 3A og 3B - se etikett på akryl boks).
3. Juster embedding ligaen til riktig retning (venstre beneller høyre ben; f.eks 15 ° eller 30 ° intern rotasjon).
4. Plasser potting beholder i bunnen av innebygging av ligaen, sted bein i potting beholder (figur 3B) og justere hals med pekeren i ligaen (figur 3C) for å justere intern rotasjon vinkelen på benet til ønsket verdi.
5. Måle 60 g av PMMA-pulver og blandes med 30 g flytende harpiks i henhold til avtrekkshette inntil pulveret er oppløst. Blandingen skal være hellbart. Bruk et papir cup for denne prosessen.
6. Hell blandingen i potting beholder med bein under en avtrekkshette (figur 3D), la det herde i ca 10 - 15 min før PMMA er klart og hardt. Dette skal kun fylle ~ 1/2 av potting container med PMMA. Vikle nøye bein i saltvann mettet håndklær for å hindre vev tørrhet på grunn av varmeutvikling under PMMA polymerisasjon (Figur 3E).
7. Med jevne mellomrom sjekke femur for å sikre at det forblir justert ibeholder under herding.
8. Fjern femur fra potting ligaen og pakk med en salt fuktet tørkepapir (Figur 3E).
9. Forbered 90 g PMMA under en avtrekkshette som forklart i trinn 3,5 og fylle potting beholderen helt. Kurere PMMA for ca 10 - 15 min før det blir vanskelig.
10. Etter harpiks har herdet, tett vikle / Bryt bein i saltvann gjennomvåt papirhåndklær, dekk med plast pose og lagre prøvene ved -20 ° C i fryseren.

4. Imaging Bone med X-ray

(OBS! Kjør med riktig pleie for røntgenstråling når du bruker maskinen)

1. Hvis du bruker filmer for røntgen, slår X-ray utbygger på minst 20 min (per produsent instruksjoner) før du skanner ved å vri bryteren med urviseren (i utbygger rom).
2. Sørg for at det er ueksponert film i kassetten før røntgen; kassett bør bare åpnes i et mørkt rom.
3. Slå maskinen tillåse opp og utvide maskinens hode.
4. Plasser en vogn under banen av strålen og plassere en kassett på vognen under bjelken (figur 4A).
5. Plass og posisjon femur på kassetten (figur 4B); to orienteringer vil bli tatt: medial-lateral view og anterior-posterior visning. Label prøvebilder tilsvarende.
6. Etter første eksponering, bytte ledelsen og bein steder.
7. Dekk allerede utsatt to med bly og eksponere bein i andre retningen på ueksponert side. Dette gjør det mulig for brukeren å bruke en X-ray film for et enkelt bein i to retninger (figur 4C-D).
8. Endre kassetten og roter hver femur inn i den andre retningen.
9. I tilfelle av en enkelt femur, dekke halvparten av kassetten med en ledning deksel for å unngå første eksponering av hele filmen for røntgenstråler.
10. Flytt bak bly-lined bærbar vegg for personlig beskyttelse og bruke avtrekkeren til å eksponerebein.
11. Ved fullføring, returnere X-ray hode for å låse og lagre posisjon, vri nøkkelen til OFF på X-ray maskin og fjerne synlige røntgenfilm.
12. Utvikle filmen for å få røntgenbilder (Figur 4E) ved hjelp av en vanlig film utvikler. Slå på det hvite lyset i rommet og finne filmen utvikler. Slå på rødt lys og slå av det hvite lyset før du åpner kassetten og fortsette med filmen utviklingsprosessen. Åpne kassett og sette filmen gjennom utbygger. Slå på det hvite lyset og slå av det røde lyset når filmen har blitt utviklet.

5. CT skanning av Bones

1. Fjern bein fra fryseren ca 24 timer før du skanner. Bones må være helt tint før du skanner.
2. Sørg bein er pakket inn i plastposer for skanning for å minimere opprydding på slutten.
3. Plasser og fest femur og kalibrerings fantom i CT scanning av ligaen (figur 5A-B). den fixture holder kalibrering fantom (figur 5C) og innehar også femur i en orientering (Figur 5D-E) identisk med den ønskede for påfølgende mekanisk testing orientering. Dette korset registrering er nødvendig å bruke data fra CT-skanning (figur 5F) i QCT / FEA modellering prosessen (beskrevet i en annen protokoll).
   MERK: Beslaget er utformet slik at den eksponerer femur for CT-skanning uten å hindre den proksimale femur (lårbenshodet, nakke, større trochanter, og proksimale skaftet).
4. Sørg for at ligaen sammen med femur i CT skanneren er riktig justert hjelp av system lasere som guider (Figur 5D-E). Re-sjekk justeringen av ligaen med CT lange aksen laser (ved å trykke på laser på / av-knappen). Den stiplede linjer trenger ikke å være på linje med laseren som det er festet i armaturen. Null bordet stilling fra kontrollpanelet på maskinen ved å trykke på null knapn (→ 0 ←) på kontrollpanelet.
5. Etter CT standard prosedyre, bruke CT-maskin på 120 kVp, 216 MAS, en rotasjon tid, og banen av en bruker ultrahøy oppløsning modus (Zuhr). Dette gir en skivetykkelse på 0,4 mm, og en pikselstørrelse på 0,30 til 0,45 mm avhengig av størrelsen av synsfeltet (FOV).
6. Sjekk CT-scan data før mekanisk testing for å sikre at bilder av interesse fanges og lagres. Fryses benet ved -20 ° C inntil dagen for forsøket.

Representative Results

De avdød lårben ble sendt frosset og holdt ved -20 ° C inntil fremstillingen begynte. BMD skanning ble utført ved hjelp av en DXA skanner for å måle total hofte og nakke BMD samt T-score for hver prøve (figur 1). En T-score er antall standardavvik av den målte BMD sammenlignet med gjennomsnittsverdier for unge, friske personer. Det kan være alt fra -2,5 eller lavere for osteoporotiske ben, mellom -1 og -2,5 til osteopene ben og høyere enn for vanlige -1 bein. Når ferdig, bein ble renset av overflødig vev, og kutt for å fjerne den ytre enden ved hjelp av en in-house designet og fabrikkert skjæring av ligaen (figur 2). Prøvene ble deretter puttet distalt ved hjelp av et innslag laget for å holde beina i den ønskede interne rotasjon orientering; etter å ha plassert den distale ende inn i støpebeholderen, PMMA i flytende form ble helt å fylle beholderen (Figur 3 (figur 4). I nærvær av slike avvik, må dokumenteres tilstanden på benet når de betraktes for fremtidig analyse. Til slutt, lårben ble CT-skannet, for å oppnå CT-bilder, ved anvendelse av en akryl-CT-scanning innslag konstruert for å holde benet i passende forhåndsbestemte orienteringer (adduksjon og innvendige rotasjonsvinkler) (figur 5). CT-bilder benyttes for å oppnå tre-dimensjonal geometri ben og volumetrisk benmineraltetthet fordeling som skal brukes i kvantitativt CT-baserte finite element analyse. Før etterfølgende brudd testing, ble alle relevante data som karakteriserer hver femur eksempel BMD verdier, røntgenbilder og CT-bilder kontrolleres for å sikre at data av interesse ble registrert og lagret.

Figur 1: BMD måling med DXA skanning. (A) Rice poser og plast linjert papir; (B) To beinprøver i ønskede retninger i skanneren; (C) proksimale femur ender dekket med 2 ris poser under skanning, (D) Hals og totalhofte BMD målinger med tilhørende T-score. DXA skanning utføres ved hjelp av en klinisk skanner for å måle beintetthet og estimat T-score. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Rengjøring og Cutting Bones. (A) Rengjøring og skjærebordet; (B) bein eksempel verktøy for rening; (C) rensing av akselen til en femur; (D) sikre en prøve i skjære ligaen; (E) kastet cutter; (F) fullført prøven etter klipping. En spesiell ligaen og bein rengjøring og skjæreverktøy brukes til å forberede den mest proksimale 255 mm lengde for testing; (G) kyrette brukes til rengjøring intramedullære kanal av femur; (H) verktøy for rengjøring overflatisk vev i prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Femur Rengjøring og Potting Process. (A) Potting ligaen; (B) å senke en femur i ligaen; (C) å justere indre dreievinkel til ønsket verdi; (E) puttet bein innpakket i en salt mettet håndklær. En spesiell ligaen brukes til å stille den interne rotasjonsvinkelen til en angitt verdi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Bone røntgen Process. (A) X-ray maskin; (B) ben prøven på en kassett med ueksponert film, blir en andre halvdel av kassetten er dekket av ledningen for å unngå eksponering av hele filmen; (C) plassere ueksponert film i lastebrett av utbygger i et mørkt rom; (D) som er utviklet film; (E) resulterende røntgenbilde av et sunt femur. Røntgenutstyr brukes til å skanne bein i to posisjoner for å utelukke før fractures, implantater, bein metastaser, eller noen strukturelle abnormiteter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: CT skanning ved hjelp av en akryl ligaen til Hold Bones i en ønsket orientering. (A) CT-skanner; (B) fiberglass lårben montert i en akryl innslag konstruert for å holde benene i en ønsket orientering; (C) montere en avdød femur i ligaen; (D) vertikal justering av lampen ved hjelp av CT lange aksen laser; (E) Justering av femur. En in-house utformet lampen brukes til å holde benet i en stilling som er identisk med den etterfølgende prøvestilling; ben innretting blir oppnådd ved hjelp av CT-innebygde lasere; (F) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi presenterte en robust bein forberedelse protokoll for å sikre mekanisk testing og QCT / FEA modellering av femoral styrke i en sidelengs fall på hoften konfigurasjon. Denne metoden ble vår standard in-house-protokollen. I løpet av 6 år, med varierende personell, ca 200 lårben ble vellykket fremstilt etter denne protokollen. Resultatene av protokollen omfatter klassifisere bein forhold ved hjelp av DXA, utelukker metastatisk sykdom, tidligere frakturer, eller implantater ved hjelp av røntgen, og skaffe mineral distribusjon og 3D geometri ved hjelp av CT for påfølgende QCT / FEA modellering. Cutting, potting og skanning inventar ble designet for å imøtekomme venstre og høyre lårben samt for ulike bein orienteringer som kreves for fremtiden testing, modellering og analyse. Husets inventar sikret repeterbarhet og reproduserbarhet av prøver.

På grunn av kompleksiteten av bein eksperimenter og behovet for kombinasjonen av BMD, røntgen, og CT-skanning før mekanisk testing, må lårben gjennomgå flere fryse / tine sykluser. Med en riktig protokoll som minimaliserer eksponering til romtemperatur, frysing bein prøvene bevarer vev for mekanisk testing, selv lang sikt ^{3, 4.} Tidligere studier viste at frysing bein ved -20 ° C ikke endrer deres mekaniske egenskaper og at noen få fryse / tine sykluser før testing er ansett som en trygg og gjennomførbar prosess ^{5, 6.} I vår studie, alle lårben opplevd tre fryse / tine-sekvenser ved -20 ° C og romtemperatur, henholdsvis for DXA skanning, CT-skanning, og mekanisk testing.

I tråd med flere tidligere studier ble standardiserte ris poser brukes mens måle BMD verdier av prøver ved hjelp av DXA å etterligne in vivo vevet rundt bein ^7. Vi sammenlignet BMD verdier i vår avdød cohort med BMD verdier av ulike pasientgrupper og funnet sine utdelinger til å være svært like, noe som tyder på robustheten vår protokoll for BMD målinger ^8.

Femoral prøver mangler flate overflater for å være lett og riktig justert til en ønsket retning for testing. Hvis det ikke gjøres ordentlig, kan dette påvirke repeterbarhet av fremgangsmåten og begrenser nøyaktigheten av de eksperimentelle resultatene ^9. For å løse dette problemet, ble flere inventar designet og fabrikkert og standard operasjonsprosedyrer ble iverksatt for å lage vev håndtering uavhengig av brukernes ferdigheter gjennom hele prøveopparbeidelse prosessen. Mens lårben ble kjøpt og testet over flere år, protokollen og maskinvare forble det samme å redusere de potensielle forberedelse feil.

Et viktig skritt i vår bein forberedelse prosessen var å utføre CT scanning for 3D-modellering av beinbrudd hjelpQCT / FEA. Dermed registrering mellom CT scanning og fremtidige brudd testing var et nødvendig skritt i vår lårbensprøveopparbeidelse protokoll ^10.

Den nåværende metoden for bein forberedelse har noen begrensninger. Selv om nøye planlegging ble gjennomført i løpet av oppkjøpet av kadavre, disseksjon, potting og CT-skanning, planlegging de ulike fasene av femur forberedelse kan være utfordrende på grunn av personell og utstyr tilgjengelighet. Vår prosess krever at prøvene som skal fryses og tines ved flere tidspunkter. Ikke desto mindre, frysetiden oversteg aldri mer enn to uker, og benene ble utsatt for en total av tre fryse / tine sykluser. Også bein forberedelsesprosessen er designet for å minimere operatørfeil. Vi har observert bare en feil i potting den distale enden av det proksimale femur. En høyre ben femur ble puttet i feil intern rotasjon vinkel som ble oppdaget først etter CT bildebehandling. Deretter this femur ble fjernet fra videre analyse av data. Derfor kan en annen operatør være behov for dette trinnet for å sjekke retningen på femur før helle PMMA for potting. Ingen andre feil ble observert i noen av de andre trinnene. Således er det vesentlig å merke seg at foreliggende fremgangsmåte var meget robust slik at for bare én feil, med flere operatører, under fremstillingen av omtrent 200 proksimale lårben i løpet av flere år.

For å gi en god kvalitetskontroll system som vil minimere sannsynligheten for operatørfeil, visse deler av protokollen må gjentas eller re-sjekket av en annen operatør. For eksempel bør man være forsiktig under potting å sikre at lårbens akselen bores for å tillate beinsement å gå inn i femur hulrom, som garanterer at femur er strengt fast og vil ikke løsne under testing. I tillegg potting femur på intern rotasjon vinkelen interesse er vanligvis utføres av en operatør. før the PMMA helles for potting distal ende, kan en annen operatør være nødvendig for å kontrollere at intern rotasjon vinkelen ble innstilt på ønsket verdi. Til slutt, i løpet av CT-scanning av femur, er justeringen av armaturen som holder benet på CT-skanneren kritisk. En operatør skal presist justere ligaen med CT-laserstråler og andre operatør bør bekrefte at ligaen er riktig justert.

Mens dagens protokollen ble utviklet spesielt for brudd testing og modellering av femoral eksemplarer i en sidelengs fall på hoften konfigurasjon, kan den lett utvides til andre laste scenarier inkludert ikke-destruktiv testing, eller vedtatt å teste andre bein typer med passende ligaen redesign .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CT potting container and scanning fixture	Internally manufactured	N/A	Custom designed and manufactured
CT scanner	Siemens	Somatom Definition scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT scanning equipment
Quantitative CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT calibration Phantom	Used for obtaining BMD values from Hounsfield units in the CT image
Dual Energy X-ray Absorptiometry scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA scanner for bone health or any similar BMD scanners
Hygenic Orhodontic Resin (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Controlled substance and can be purchased with proper approval
Freezer	Kenmore	N/A	This is a -20 °C storage for bones
X-ray scanner	General Electric	46-270615P1	X-ray imaging equipment.
X-ray films	Kodak	N/A	Used to display x-ray images
X-ray developer	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Used for developing X-ray images
X-ray Cassette	Kodak X-Omatic	N/A	Used for holding x-ray films
5-pound Rice Bags	Great Value	N/A	Used for mimicking soft tissue during the DXA scanning process
Physiologic Saline (0.9% Sodium Chloride)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Used for keeping samples hydrated
Scalpels and scrapers	Bard-Parker	N/A	Used to clean the bone from soft tissue
Cast cutter	Stryker	810-BD001	Used to cut femoral shaft
Drilling machine	Bosch	N/A	Used to drill the femoral shaft
Fume Hood	Hamilton	70532	Used for ventilation when using making PMMA