Proximal Cadaveric Femur Preparação para Análise de Elementos Finitos baseado no CT Fracture Força Testes e Quantitativa

Summary

Nós apresentamos um protocolo robusto sobre como preservar com cuidado e preparar fémures cadavérico para testes de fratura e tomografia computadorizada quantitativa. O método oferece um controle preciso sobre as condições de entrada para o propósito de determinar as relações entre a densidade mineral óssea, resistência à fratura, e definir finito geometria e propriedades elemento do modelo.

Abstract

testes de fratura Cadaveric é rotineiramente usado para entender os fatores que afetam a força do fêmur proximal. Porque ex vivo tecidos biológicos são propensos a perder as suas propriedades mecânicas ao longo do tempo, Preparação de amostras para o teste experimental deve ser realizada com cuidado para obter resultados confiáveis que representam as condições in vivo. Por essa razão, foi elaborado um protocolo e um conjunto de acessórios para preparar os espécimes femorais de tal forma que as suas propriedades mecânicas experientes alterações mínimas. Os fémures foram mantidos em um estado congelado, exceto durante as etapas de preparação e ensaios mecânicos. As medidas clínicas relevantes do total do quadril e fêmur densidade pescoço mineral óssea (DMO) foram obtidos com um densitômetro ósseo clínica dupla absorciometria de raios-X (DXA), e da geometria e distribuição de mineral óssea 3D foram obtidos utilizando CT com um fantasma de calibração para estimativas quantitativas baseadas nos valores de escala de cinzentos. Qualquer possível doença óssea, fratura, Ou a presença de implantes ou artefactos que afectam a estrutura óssea, foi descartada com exames de raios-X. Para a preparação, todos os ossos foram cuidadosamente limpos de tecido mole em excesso, e foram cortados e em vaso, com o ângulo de rotação interna de interesse. Um dispositivo de corte permitiu a extremidade distai do osso que se pretende cortar o fémur proximal, deixando a um comprimento desejado. Para permitir o posicionamento do colo do fêmur em ângulos prescritos durante a tarde tomografia computadorizada e ensaios mecânicos, os eixos proximais do fêmur foram envasadas em polimetilmetacrilato (PMMA), utilizando um dispositivo elétrico projetado especificamente para orientações desejadas. Os dados recolhidos a partir de nossas experiências foram então usados ​​para validação da tomografia computadorizada quantitativa (QCT) à base de análise de elementos finitos (FEA), como descrito em um protocolo diferente. Neste artigo, apresentamos o protocolo para a preparação óssea preciso para testes mecânicos e subsequente modelagem QCT / FEA. O actual protocolo foi aplicado com sucesso para preparar cerca de 200 cadfémures Averic ao longo de um período de tempo de 6 anos.

Protocol

NOTA: Todos os estudos apresentados neste protocolo foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) na Mayo Clinic. Os ossos foram obtidas durante um período de 6 anos a partir de várias organizações. Todas as amostras foram recolhidas no prazo de 72 horas após a morte, envolvido em toalhas de solução salina saturada, e armazenadas a -20 ° C até à preparação.

1. medir a densidade mineral óssea usando DXA

1. Retirar amostras mantidas à temperatura de -20 ° C congelador a descongelar à temperatura ambiente durante cerca de 24 h; espécimes não precisa de ser removido da embalagem original, se a maioria dos tecidos moles foram removidos.
2. Use duas 5 lb sacos de arroz para dar conta dos tecidos moles. Cobrir os dois sacos de arroz na mesa de DXA com sacos plásticos para evitar a contaminação. Os sacos de arroz irá simular tecidos moles circundantes (in vivo) durante o varrimento como se mostra na Figura 1.
3. Proteger a superfície do scanner DEXA com papel de plástico revestido e colocá-2 RI plástico envolvidosacos ce na mesa do scanner (Figura 1A).
4. Coloque 2 fémures (direita e esquerda) na parte superior de sacos de arroz de modo a que a extremidade proximal (incluindo a cabeça femoral) é centrada em sacos e o lado posterior é para baixo (Figura 1B). Este imita um paciente deitado sobre suas costas.
5. Tampa anterior / expostos final do fêmur proximal com dois sacos de arroz de 5 libras adicionais (Figura 1C).
6. Cabeça da máquina de posição ao longo do fêmur proximal e digitalizar o fêmur de acordo com o procedimento institucional padrão para medição da DMO do paciente (Figura 1C). Siga as instruções específicas do fabricante DXA.
   1. A partir da interface do software da máquina DXA executar uma varredura normal fêmur. Selecione o exame fêmur, posicionar o braço DXA na parte superior do fémur cadavérico, pressionando a seta para a esquerda ou para a direita, consequentemente, o braço DXA, e iniciar o exame, clicando no botão "Iniciar". Realizar a análise BMD clicando em "Analisar".
      NÃOE: A T-score automática resultante da varredura classifica o osso como normal, osteopenia ou osteoporose (Figura 1D). Siga as instruções específicas do fabricante DXA.

2. Limpeza, corte e perfuração do Distal End of the Bone

1. Limpe as mais proximais 300 mm do fêmur pela remoção cuidadosa de qualquer tecido mole restante do osso. Este passo é necessário para permitir que o PMMA em contactar o osso durante o processo de envasamento em preparação para o teste mecânico. Os ossos não necessitam de ser descongeladas a temperatura ambiente, durante este processo.
2. Higienizar o espaço de trabalho com álcool isopropílico a 70% e cobrir a mesa com almofadas de papel absorvente com filme plástico de um lado (Figura 2A). Conjunto do fémur sobre a mesa (Figura 2B) para a totalidade do processo começando com a limpeza de corte (Figura 2A a 2H). Use equipamento de proteção individual (EPI), incluindo luvase proteção para os olhos.
3. Raspe o excesso de periósteo e cortar o excesso de tecido, utilizando um raspador e bisturi (Figura 2C, 2H).
4. Coloque o osso no suporte de corte feito por medida, como mostrado na Figura 2D com a cabeça do fémur contra a placa de acrílico do dispositivo.
5. Alinhar e segurar a diáfise contra os dois pinos no dispositivo elétrico de corte (Figura 2D).
6. Fixe o osso para a fixação apertando para baixo a placa entalhada na diáfise; se o osso não deitar no dispositivo elétrico, pendurar extremidade distal da mesa ao topo e também zip opcionalmente amarrar o colo do fêmur, conforme necessário para manter a amostra no lugar (Figura 2D).
7. Cortar o eixo distai do fémur usando o cortador de molde (Figura 2E) através da placa ranhurada como guia; segure osso com um pano seco / toalha para uma melhor aderência.
8. Retirar o osso do imóvel; comprimento do osso normal após corte é 255 mm (Figura2F).
9. Limpar a cavidade medular da medula utilizando uma cureta de aproximadamente 25 mm de profundidade. Em seguida, insira uma gaze para ajudar a secar a superfície interior. Remover a gaze imediatamente antes da colocação da extremidade distai do fémur no molde. Agarrar o osso com uma toalha seca / pano e fazer um furo 10 milímetros através da extremidade distal em cerca de 25 mm a partir da extremidade proximal corte do espécime. Nota: Este é para permitir que o PMMA para penetrar no canal e fixe o osso com firmeza.

3. Potting the Bone

1. Concepção e recipiente de envasamento fabricar. Os recipientes são feitos de envasamento de 5 mm de espessura folhas de acrílico e tem as seguintes dimensões externas: 50 mm de secção quadrada 50 mm e 100 mm de altura (Figura 3A).
2. Etiqueta do recipiente envasamento com a identificação óssea adequada (Figura 3A e 3B - ver etiqueta na caixa de acrílico).
3. Ajuste o dispositivo elétrico de incorporação para a orientação certa (perna esquerdaou perna direita; por exemplo, 15 ° ou 30 ° de rotação interna).
4. Coloque recipiente envasamento na base da incorporação de fixação, local óssea no recipiente de envasamento (Figura 3B) e alinhar pescoço com ponteiro no dispositivo elétrico (Figura 3C) para ajustar o ângulo de rotação interna do osso para o valor desejado.
5. Medir 60 g de PMMA em pó e misturar-se com 30 g de resina líquida sob hotte até que o pó esteja dissolvido. A mistura deve ser que se pode vazar. Use um copo de papel descartável para este processo.
6. Despeje a mistura em um recipiente de envasamento com o osso sob uma coifa (Figura 3D), deixar curar por cerca de 10 - 15 min até PMMA é claro e duro. Isso só deve preencher ~ 1/2 do recipiente envasamento com PMMA. Cuidadosamente embrulhar o osso em solução salina saturada toalhas para prevenir o ressecamento do tecido devido à geração de calor durante o PMMA de polimerização (Figura 3E).
7. Verifique periodicamente o fêmur para garantir que ele permanece alinhada nacontentor durante a cura.
8. Remover fémur da luminária envasamento e enrole com uma solução salina embebida de toalha de papel (Figura 3E).
9. Prepare 90 g de PMMA sob uma coifa como explicado no passo 3.5 e encher o recipiente envasamento completamente. Curar o PMMA durante cerca de 10 - 15 min até que se torne difícil.
10. Depois de resina cura, enrole firmemente osso / rewrap em soro fisiológico embebido toalhas de papel, cubra com espécimes saco de plástico e armazenar a -20 ° C no congelador.

4. Imaging o osso com raios-X

(CUIDADO! Operar com a devida atenção para a radiação de raios-X ao utilizar a máquina)

1. Se estiver usando filmes para raios-X, por sua vez developer de raios-X em pelo menos 20 min (por fabricante instruções) antes da digitalização, girando o botão no sentido horário (na sala de desenvolvedor).
2. Garantir que há o filme não exposto na cassete antes de radiografar; cassete só deve ser aberta em um quarto escuro.
3. Ligue máquina sobre adesbloquear e alargar a cabeça da máquina.
4. Coloque um carrinho no caminho do feixe e colocar uma cassete no carrinho sob o feixe (Figura 4A).
5. Lugar e posição do fémur na cassete (Figura 4B); duas orientações serão capturados: Vista medial-lateral e vista ântero-posterior. Rotular as imagens de amostra em conformidade.
6. Após a primeira exposição, troque os locais de chumbo e ossos.
7. Cubra a metade já exposto com chumbo e expor o osso no segundo orientação do lado não exposto. Isso permite que o usuário use um filme de raios-X para um único osso em duas orientações (Figura 4C-D).
8. Mudar a cassete e girar cada fémur na segunda orientação.
9. No caso de um único fémur, cobre metade da fita com uma cobertura de chumbo para evitar a exposição inicial de todo o filme para raios-X.
10. Mova atrás da parede portátil a revestida de chumbo para proteção pessoal e usar o gatilho para exporos ossos.
11. Na conclusão, o retorno da cabeça de raios-X para bloquear e posição loja, gire a chave para OFF na máquina de raio-X e remover filme de raios-X exposto.
12. Desenvolver o filme para obter imagens de raios-X (Figura 4E) usando um colaborador da película regular. Ligue a luz branca no quarto e localizar o desenvolvedor filme. Acender a luz vermelha e desligar a luz branca antes de abrir a gaveta e prosseguir com o processo de revelação de filmes. Abra a gaveta e colocar o filme através do desenvolvedor. Ligar a luz branca e desligar a luz vermelha quando o filme tem sido desenvolvido.

5. CT Scanning of Bones

1. Retire os ossos do congelador cerca de 24 h antes da digitalização. Ossos devem ser completamente descongeladas antes da digitalização.
2. Assegurar os ossos são embrulhados em sacos de plástico para a digitalização para minimizar clean-up no final.
3. Lugar e prenda o fémur e o fantasma de calibração no suporte tomografia computadorizada (Figura 5A-B). a fixture prende o fantasma calibração (Figura 5C) e também segura o fémur numa orientação (Figura 5D-E) idêntico com a orientação desejada para o teste mecânico subsequente. Este registro cruz é necessário para usar os dados da tomografia computadorizada (Figura 5F) no processo de modelagem QCT / FEA (descrito em um protocolo diferente).
   NOTA: O dispositivo elétrico é projetado de tal forma que ele expõe o fêmur para a digitalização CT sem obstruir o fêmur proximal (cabeça femoral, pescoço, trocânter maior, eo eixo proximal).
4. Verifique se o dispositivo elétrico junto com o fêmur no scanner CT está devidamente alinhada com os lasers do sistema como guias (Figura 5D-E). Re-verifique o alinhamento do dispositivo com o laser eixo longo CT (pressionando a laser botão on / off). O fantasma não necessita de estar alinhado com o laser, uma vez que é fixado no suporte. Zerar a posição da tabela no painel de controle da máquina, pressionando o butto de zeron (→ 0 ←) no painel de controle.
5. Seguindo o procedimento operacional padrão CT, operar a máquina CT em 120 kVp, 216 mAs, 1 s tempo de rotação, e arremesso de 1 usando o modo de alta resolução ultra-(Zuhr). Isto dá uma espessura de corte de 0,4 mm e um tamanho de pixel de 0,30-0,45 mm, dependendo do tamanho do campo de visão (FOV).
6. Conferir tomografia computadorizada de dados anterior ao teste mecânico para assegurar que as imagens de interesse são capturados e guardados. Refreeze o osso a -20 ° C até ao dia da experiência.

Representative Results

Os fémures de cadáveres foram enviados congelada e mantida a -20 ° C até à preparação começou. Digitalização DMO foi realizada utilizando um scanner DXA para medir total do quadril e pescoço DMO, bem como T-score para cada amostra (Figura 1). A T-score é o número de desvios padrão da DMO medidos comparados com os valores médios para indivíduos jovens e saudáveis. Ela pode variar de -2,5 ou inferior para ossos osteoporóticos, entre -1 e -2,5 para ossos osteopénicas e maior do que 1 para ossos normais. Uma vez terminado, os ossos foram limpas de tecido em excesso, e cortado para remover a extremidade distal utilizando um acessório de corte em casa concebido e fabricado (Figura 2). Os espécimes foram então vaso distalmente usando um acessório projetado para manter os ossos no sentido da rotação interna desejada; após a colocação da extremidade distai para dentro do recipiente de envasamento, o PMMA em forma líquida foi vertida para encher o recipiente (Figura 3 (Figura 4). Na presença de tais anormalidades, a condição do osso deve ser documentada quando considerados para análises futuras. Finalmente, os fémures foram CT-digitalizada, de modo a obter imagens de CT, usando um acrílico fixação varrimento CT destinado a segurar o osso em orientações predeterminadas adequadas (adução e ângulos de rotação interna) (Figura 5). As imagens de CT são usados ​​para se obter a geometria do osso 3-dimensional e distribuição mineral óssea volumétrica para ser usado na análise de elementos finitos baseado em TC quantitativa. Antes do teste de fratura subseqüente, todos os dados pertinentes que caracterizam cada um dos fémures, tais como os valores de DMO, imagens de raios-X e tomografias foram verificadas para garantir que os dados de interesse foram registrados e salvos.

Figura 1: BMD Medição Usando DXA Scanning. (A) sacos de arroz e papéis de plástico forrada; (B) Duas peças ósseas nas orientações desejadas no scanner; (C) fémur proximal termina coberta com 2 sacos de arroz durante a verificação; (D) Neck e quadril medições totais de DMO com T-scores associados. varrimento DXA é realizada utilizando um scanner clínico para medir a densidade mineral óssea e estimativa índice T. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Limpeza e corte Bones. (A) Limpeza e mesa de corte; (B) ferramentas de amostra de osso para limpaing; (C) a limpeza do eixo de um fémur; (D) garantir uma amostra no suporte de corte; (E) cortador de elenco; (F) concluída amostra após o corte. Um dispositivo elétrico e de limpeza dos ossos e ferramentas de corte especiais são usados ​​para preparar o comprimento 255 milímetros mais proximal para testar; (G) cureta usado para a limpeza de canal intramedular do fémur; (H) para a ferramenta de limpeza de tecido superficial em amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Limpeza Femur e Processo envasamento. (A) de fixação envasamento; (B) envasamento um fêmur no suporte; (C) ajustar o ângulo de rotação interna para o valor desejado; (E) osso vaso envolto em uma solução salina saturada toalhas. Um acessório especial é utilizado para definir o ângulo de rotação interna de um valor especificado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Processo de raios-X do osso. Máquina de (A) de raio-X; (B) de uma amostra de osso de uma cassete com película fotográfica não exposta, uma segunda parte da cassete é coberto por chumbo para evitar a exposição de todo o filme; (C) colocando o filme não exposto na bandeja de carregamento do desenvolvedor no quarto escuro; (D) desenvolveu filme; (E) a imagem do raio X de um fémur saudável resultante. equipamento de raios-X é usado para digitalizar os ossos em duas posições para descartar fractur préviaes, implantes, metástase óssea, ou quaisquer anormalidades estruturais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: CT Digitalizar com um acrílico Fixação to Hold Ossos em um orientação desejada. (A) do scanner CT; (B) de fibra de vidro fêmur montado em um dispositivo elétrico acrílico projetado para manter os ossos em uma orientação desejada; (C) a montagem de um fémur de cadáver no suporte; (D) alinhamento vertical do dispositivo a laser usando o eixo longo CT; (E) O alinhamento do fêmur. Uma casa de fixação concebido é utilizado para segurar o osso numa posição idêntica à posição de teste subsequente; alinhamento ósseo é obtida com o auxílio de lasers embutidos CT; (F) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Foi apresentado um protocolo de preparação óssea robusta para assegurar testes e QCT / FEA modelagem mecânica de força femoral em uma queda para o lado da configuração do quadril. Este método tornou-se o nosso protocolo padrão in-house. Ao longo de 6 anos, com diferentes pessoal, cerca de 200 fémures foram preparadas com sucesso seguindo este protocolo. Os resultados do protocolo inclui classificar condições ósseas usando DXA, descartando doenças metastáticas, fraturas anteriores, ou implantes usando raios-X, e obter a distribuição mineral e geometria 3D usando CT para posterior modelagem / FEA QCT. Corte, envasamento, e digitalização acessórios foram projetados para acomodar fémures esquerda e direita, bem como para diferentes orientações osso necessários para testes futuros, modelagem e análise. As luminárias in-house assegurou repetibilidade e reprodutibilidade de amostras para análise.

Devido à complexidade das experiências de osso e a necessidade para a combinação da densidade mineral óssea, raios-X, e Cdigitalização T antes do teste mecânico, fémures deve passar por múltiplos ciclos de congelação / descongelação. Com um protocolo adequado que minimize a exposição à temperatura ambiente, congelando as amostras ósseas preserva o tecido para ensaio mecânico, mesmo a longo prazo ^{3, 4.} Estudos anteriores mostraram que o congelamento ossos a -20 ° C não altera as suas propriedades mecânicas e que alguns ciclos de congelamento / descongelamento antes do ensaio é considerado um processo seguro e praticável ^{5, 6.} Em nosso estudo, todos os fémures experimentou três sequências de congelamento / descongelamento em ° C e a temperatura ambiente -20, respectivamente, para a digitalização DXA, tomografia computadorizada e ensaios mecânicos.

De acordo com vários estudos anteriores, sacos de arroz padronizadas foram utilizadas durante a medição de valores de DMO de amostras utilizando DXA para imitar tecidos moles in vivo ao redor do osso ^7. Foram comparados os valores de DMO do nosso cadáver cohort com valores de DMO de diferentes populações de pacientes e encontraram suas distribuições de ser muito semelhante, sugerindo a robustez do nosso protocolo para medições de DMO ^8.

amostras femorais carecem de superfícies planas para ser facilmente e correctamente alinhado com uma orientação desejada para o teste. Se não for feito corretamente, isso pode afetar a repetibilidade do processo e limitar a precisão dos resultados experimentais ^9. Para resolver este problema, vários equipamentos foram projetados e fabricados e procedimentos operacionais padrão foram implementadas para tornar o tecido manipulação independente da habilidade dos usuários em todo o processo de preparação da amostra. Enquanto os fémures foram adquiridos e testados ao longo de vários anos, o protocolo eo hardware permaneceu o mesmo reduzindo os erros de preparação potenciais.

Um passo importante do nosso processo de preparação do osso foi realizar tomografia computadorizada para modelagem 3D de fratura óssea porQCT / FEA. Assim, o registo entre tomografia computadorizada e teste de fratura futuro era um passo necessário em nossa amostra femoral protocolo de preparação ^10.

O método atual para a preparação óssea tem algumas limitações. Embora um planejamento cuidadoso foi implementado durante a aquisição do cadáveres, dissecção, envasamento e tomografia computadorizada, programando as diversas fases de preparação do fémur pode ser um desafio devido ao pessoal e disponibilidade do equipamento. O nosso processo requer que os espécimes sejam congeladas e descongeladas a vários pontos de tempo. No entanto, o tempo de congelamento nunca excedeu mais do que duas semanas, e os ossos foram submetidos a um total de três ciclos de congelamento / descongelamento. Além disso, o processo de preparação do osso foi projetado para minimizar os erros do operador. Observamos apenas um erro no envasamento da extremidade distal do fêmur proximal. Um fêmur da perna direita foi vasos no ângulo de rotação interna errado que, foi descoberto somente após tomografia computadorizada. Subsequentemente, this fêmur foi descartada da análise posterior dos dados. Portanto, um segundo operador podem ser necessários para esta etapa para verificar a orientação do fêmur antes de derramar a PMMA para envasamento. Sem outros erros foram observadas em qualquer dos outros passos. Assim, é importante notar que o nosso processo era muito robusta permitindo apenas um erro, com vários operadores, durante a preparação de cerca de 200 fémures proximais no decurso de vários anos.

Para proporcionar um sistema de controle de qualidade que irá minimizar o risco de erros do operador, determinadas partes do protocolo ter de ser repetido ou re-verificada por um segundo operador. Por exemplo, deve ser tomado cuidado durante o envasamento para garantir que o eixo femoral é perfurado para permitir que o cimento ósseo para entrar na cavidade do fémur, garantindo que a fémur é rigidamente fixo e não vai soltar durante o teste. Além disso, envasamento do fémur no ângulo de rotação interna de interesse é geralmente realizada por um operador. antes the PMMA é derramado para envasamento da extremidade distal, um segundo operador pode ser necessária para verificar se o ângulo de rotação interna foi fixada no valor requerido. Finalmente, durante a digitalização CT do fêmur, o alinhamento do dispositivo de fixação do osso na base do scanner CT é fundamental. Um operador deve alinhar precisamente o equipamento com as vigas CT-laser e um segundo operador deve confirmar que o equipamento está devidamente alinhada.

Enquanto o protocolo atual foi projetado especificamente para testes de fratura e modelagem de espécimes de fêmur em uma queda para o lado da configuração do quadril, ele pode ser facilmente estendido para outros cenários de carga, incluindo testes não destrutivos, ou adotado para testar outros tipos de osso com redesenho de fixação adequada .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CT potting container and scanning fixture	Internally manufactured	N/A	Custom designed and manufactured
CT scanner	Siemens	Somatom Definition scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT scanning equipment
Quantitative CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT calibration Phantom	Used for obtaining BMD values from Hounsfield units in the CT image
Dual Energy X-ray Absorptiometry scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA scanner for bone health or any similar BMD scanners
Hygenic Orhodontic Resin (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Controlled substance and can be purchased with proper approval
Freezer	Kenmore	N/A	This is a -20 °C storage for bones
X-ray scanner	General Electric	46-270615P1	X-ray imaging equipment.
X-ray films	Kodak	N/A	Used to display x-ray images
X-ray developer	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Used for developing X-ray images
X-ray Cassette	Kodak X-Omatic	N/A	Used for holding x-ray films
5-pound Rice Bags	Great Value	N/A	Used for mimicking soft tissue during the DXA scanning process
Physiologic Saline (0.9% Sodium Chloride)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Used for keeping samples hydrated
Scalpels and scrapers	Bard-Parker	N/A	Used to clean the bone from soft tissue
Cast cutter	Stryker	810-BD001	Used to cut femoral shaft
Drilling machine	Bosch	N/A	Used to drill the femoral shaft
Fume Hood	Hamilton	70532	Used for ventilation when using making PMMA