Protocol
1. सामग्री और संस्कृति के माध्यम की तैयारी
- विच्छेदन और SCZ की हदबंदी के लिए, मस्तिष्क मैट्रिक्स, दोधारी धार, और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ संदंश लपेट, और फिर autoclaving द्वारा उन्हें बाँझ।
- पूरे माउस मस्तिष्क धोने के लिए ठंड पीबीएस बफर के 50 मिलीलीटर की तैयारी।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप सेट अप और मस्तिष्क (autoclaved कैंची और संदंश) के विच्छेदन के लिए आवश्यक सर्जिकल उपकरण और SCZ (1 मिलीलीटर सिरिंज, 30 ग्राम सुई, मस्तिष्क मैट्रिक्स, और ठीक संदंश) के अलगाव तैयार करते हैं।
- एन 2 मध्यम की तैयारी:
- F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + सोडियम बाइकार्बोनेट) 2% B27, 1% एन 2 की आपूर्ति करता है, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मध्यम तैयार।
नोट: मध्यम विकास एन 2 मध्यम और वृद्धि कारकों के होते हैं (20 एनजी / एमएल शुद्ध epidermal वृद्धि कारक (EGF) और 20 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF2))।
- F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + सोडियम बाइकार्बोनेट) 2% B27, 1% एन 2 की आपूर्ति करता है, और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मध्यम तैयार।
- एक पाचन बफर तैयार (40 यूनिट / मिलीलीटर papain, 2.4 यूनिट / मिलीलीटर dispasई द्वितीय, और 2% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन पीबीएस में) ऊतक पाचन के लिए।
- कोटिंग प्लेट और coverslip की तैयारी:
- (; 0.01% पीएलओ) और laminin (डीएच में 2 हे भंग कर 10 माइक्रोग्राम / एमएल) पाली एल ओर्निथिन तैयार करें। एक monolayer या 18 मिमी immunostaining के लिए coverslips के रूप में SCZ-aNSCs के रखरखाव के लिए कोट 6 अच्छी तरह प्लेटें, करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पीएलओ के साथ उन्हें सेते हैं। तब डीएच 2 के साथ उन्हें 3 बार धोने ओ प्लेटें और coverslips पिछले धोने के बाद सूखे की अनुमति दें।
- अगले, 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर laminin साथ प्लेटों सेते हैं। फिर, उन्हें डीएच 2 ओ के साथ 3 बार धोने
सावधानी:, laminin सूखी नहीं है, जो सेल लगाव को प्रभावित करेगा।
नोट: कोटिंग के समाधान के लिए 3 बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
2. अलगाव और प्रौढ़ SCZ की हदबंदी
- संस्कृति तैयारी करने से पहले, मस्तिष्क मैट्रिक्स और बर्फ पर दोधारी उस्तरा जगह है।
नोट: मस्तिष्क मैट्रिक्स फ्रीज मत करो, क्योंकि बीआरऐन इसे संलग्न कर सकता है। - सीओ 2 asphyxiation या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से एक माउस (8 सप्ताह पुराने) बलिदान।
- तेज कैंची के साथ सिर काट 70% इथेनॉल के छिड़काव के बाद। सिर स्थिर करने के लिए, सिर के दोनों ओर कसकर पकड़। एक दुम-व्याख्यान चबूतरे दिशा में midline पर कैंची के साथ त्वचा कट। यह खोपड़ी से त्वचा का पूरी तरह हटाने को बढ़ावा देता है।
- खोपड़ी (लैम्ब्डा के पीछे) पहले की दुम हिस्सा निकालें, और फिर पृष्ठीय midline के स्थान पर खोपड़ी और मस्तिष्क के बीच संदंश डालें। छोड़ दिया है (या सही) पार्श्विका हड्डी ले लो और ध्यान से इसे दूर छील। अन्य पार्श्विका हड्डी को हटाने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
नोट: ऑप्टिक तंत्रिका और मस्तिष्क से तानिका के हटाने के वियोग यह आसान खोपड़ी से मस्तिष्क अलग करने के लिए बनाते हैं। - ठंड पीबीएस बफर (25 एमएल) के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण और यह दो बार कुल्ला अतिरिक्त रक्त हटा दें।
- मस्तिष्क बर्फ और एमए पर मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखेंKe राज्याभिषेक कटौती 1 मिमी मोटी स्लाइस प्राप्त करने के लिए। मस्तिष्क के स्लाइस (1 मिमी) SCZ क्षेत्रों है कि एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में एक ठंड पीबीएस के लिए मस्तिष्क के पीछे भाग में स्थित हैं युक्त स्थानांतरण।
सावधानी: आदेश राज्याभिषेक वर्गों का एक समानांतर विमान प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क विदर मस्तिष्क मैट्रिक्स के midline में रखा जाता है; यह वर्गों में अनावश्यक रूपों से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
नोट: 2-3 मिमी शीर्षस्थान के पीछे मस्तिष्क के स्लाइस प्राप्त; इस SVZ से SCZ की जुदाई की अनुमति देता है। - एक कम बढ़ाई साथ विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, छाल से एक तुला 30G सुई 6.9 के साथ हिप्पोकैम्पस के सफेद पदार्थ क्षेत्र से SCZ सूक्ष्म काटना। फिर, SCZ ऊपर कोर्टेक्स क्षेत्रों को हटा दें। स्लाइस से विच्छेदित SCZ क्षेत्र ठंड पीबीएस के बिना बर्फ पर एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में रखें।
नोट: परिपक्व न्यूरॉन्स युक्त अतिरिक्त क्षेत्रों के संदूषण aNSCs और neurosphere गठन ख की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकताecause वे aNSC संस्कृति की स्थिति में कोशिका मृत्यु से गुजरना। - एक तुला 30 जी सुई का प्रयोग, तुरंत छोटे टुकड़ों में विच्छेदित ऊतकों काट लें।
नोट: एक लंबे समय के SCZ ऊतक विदारक के लिए आवश्यक है, तो काट से पहले ठंड पीबीएस में विच्छेदित ऊतकों को विसर्जित कर दिया। - पुनः निलंबित पाचन बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कटा हुआ ऊतक, पाचन बफर के 2 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए ऊतक हस्तांतरण, और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए यह सेते हैं।
नोट: अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ट्यूब हिला हर 10 मिनट।
3. Subcallosal जोन व्युत्पन्न वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति
- पचा ऊतक अलग कर देना हल्का ट्यूब नल, और फिर 5 मिनट के लिए 145 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। पाचन बफर बाहर धोने के लिए पूर्व गर्म एन 2 के माध्यम से 1 एमएल के साथ सतह पर तैरनेवाला, पचा ऊतक फिर से निलंबित त्यागें, और धीरे नमूना समाधान एक P1000 पिपेट का उपयोग कर 5 गुना की एक अधिकतम pipet।
नोट: अधिक triturating एक संकीर्ण साथpipet टिप सेल व्यवहार्यता और बाद में विकास कम कर सकते हैं। - 5 मिनट के लिए 145 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला discarding के बाद, एन 2 के माध्यम से 1 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित।
- एक गैर-लेपित 6 अच्छी तरह से थाली में एन 2 के माध्यम से 1 मिलीलीटर की तैयारी और 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए निलंबित कर दिया कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- EGF (20 एनजी / एमएल) और bFGF (20 एनजी / एमएल) के प्रत्येक कुएं में जोड़ें। धीरे चढ़ाया कोशिकाओं के साथ जोड़ा वृद्धि कारकों के मिश्रण करने के लिए हाथ से 6 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान हिला। एक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली रखें।
- 8 दिनों के लिए हर दिन एक अच्छी तरह से EGF (20 एनजी / एमएल) और bFGF (20 एनजी / एमएल) जोड़ें। हर तीसरे दिन, मध्यम की अनुमानित 2 मिलीलीटर की मात्रा बनाए रखने के लिए एन 2 मीडिया के 200 μl जोड़ें।
Neurospheres के रूप में और monolayer संस्कृतियों के लिए एनएससी के 4. Passaging
- neurospheres को इकट्ठा करने और उन्हें एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण।
नोट: neurospheres की संख्या (> 50 माइक्रोन व्यास) पीईअच्छी तरह से एक माउस मस्तिष्क के SCZ से R 64.3 ± 7.31, जो SVZ की तुलना में कम था (190.5 ± 6.33) 9। - एकल कक्षों में neurospheres अलग कर देना एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 5 मिनट के लिए हदबंदी बफर के 0.5 मिलीलीटर के साथ neurospheres सेते हैं। प्राथमिक neurospheres एकल कक्षों में अलग और neurosphere या monolayer संस्कृतियों के रूप में कई मार्ग पर बनाए रखा जा सकता है।
नोट: SCZ-aNSCs एक monolayer के रूप में विस्तार neurospheres के लिए बेहतर है क्योंकि SCZ-aNSCs एक neurosphere संस्कृति प्रारूप में passaged जा सकती है एक monolayer संस्कृति प्रारूप में> 10 बार, लेकिन <5 बार।
सावधानी: SCZ-aNSCs मजबूत एकत्रीकरण दिखा रहे हैं, और यह उन्हें एकल कक्षों में अलग कर देना मुश्किल है। इस प्रकार, neurosphere संस्कृति प्रारूप दिनचर्या सेल के विस्तार के लिए अनुशंसित नहीं है। - धीरे 5 मिनट के लिए 145 XG पर ऊपर और एक P1000 विंदुक के साथ नीचे नमूना समाधान pipet कम से कम 5 बार और अपकेंद्रित्र ट्यूब। सतह पर तैरनेवाला और फिर से सु त्यागेंएन 2 के माध्यम से 1 मिलीलीटर के साथ neurospheres खर्च करते हैं।
नोट: एक संकीर्ण विंदुक टिप के साथ triturating सेल व्यवहार्यता और बाद में विकास कम हो सकता है पर। - सेल निलंबन (10 μl) और 0.4% trypan नीले समाधान के 1 मिश्रण है, और फिर एक hematocytometer पर जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनती: कोशिकाओं की गिनती करने के लिए, एक 1 बनाते हैं। पीएलओ / laminin के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली कोटिंग के बाद, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एन 2 मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं थाली।
नोट: सेल घनत्व में परिवर्तन उनकी हालत और भेदभाव की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। - 5 दिनों के लिए विकास के कारकों में से एक दैनिक उपचार के साथ-SCZ aNSCs (2 मिलीलीटर, 20 एनजी / एमएल) को बनाए रखने, और उन्हें पारित होने के लिए उन्हें।
5. Subcallosal जोन व्युत्पन्न वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव
- एक पीएलओ / laminin लेपित 18 मिमी SCZ-aNSCs के भेदभाव के लिए विकास के कारकों के साथ 1 मिलीलीटर एन 2 (20 एनजी / एमएल) में 1 एक्स 10 5 कोशिकाओं / एमएल के साथ coverslip पर थाली aNSCs।
- अगले दिन,जब कोशिकाओं को मजबूती coverslip से जुड़े होते हैं, एन 2 के साथ मध्यम विकास का आदान-प्रदान में वृद्धि कारकों को दूर करने की।
- 6 दिन बाद, सेल मलबे को हटाने और immunostaining के लिए उन्हें ठीक करने के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ विभेदित कोशिकाओं धो लें।
नोट: BrdU proliferating कोशिकाओं के नव-संश्लेषित डीएनए में शामिल किया जा सकता है। इसलिए, अगर वांछित, BrdU (10 माइक्रोग्राम / एमएल) कोशिकाओं के निर्धारण से पहले कोशिकाओं से जीने के लिए जोड़ा जा सकता है।
6. Immunostaining वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और विभेदित प्रोजेनिटर्स
- immunostaining के लिए, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पीएफए के साथ उन्हें ठीक।
सावधानी: पीएफए बेहद जहरीला है; त्वचा और आंखों के साथ संपर्क से बचें। - 4% पीएफए हटाये, 3 बार पीबीएस के साथ तय की कोशिकाओं कुल्ला, और फिर उन्हें 4 डिग्री Cuntil वे immunostaining के लिए आवश्यक हैं पर स्टोर।
- अवरुद्ध समाधान (3% गोजातीय सीरम albumin और 0.1% ट्राइटन X-100 1x पी के साथ coverslip पर कोशिकाओं को सेतेबी एस) कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए।
- ताजा अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने सेते हैं।
- aNSCs immunostaining
- विरोधी Nestin और विरोधी BrdU एंटीबॉडी का उपयोग aNSCs दाग। निर्धारण से पहले, aNSCs को BrdU के 20 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ सकते हैं और 2 घंटे के लिए उन्हें सेते हैं। 37 डिग्री Cbefore पर 20 मिनट के लिए 2 एन एचसीएल का उपयोग कर अवरुद्ध चरण का पालन करने denaturing कदम प्रदर्शन।
- Immunostaining भेदभाव पूर्वज:
- विभेदित पूर्वज लेबल करने के लिए विरोधी O4, विरोधी bIII ट्यूबिलिन, और विरोधी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) एंटीबॉडी का प्रयोग करें।
- aNSCs immunostaining
- पीबीएस 3 बार के साथ नमूनों को धो लें और उन्हें फ्लोरोसेंट रंगों (1: 500) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान को रोकने में। फिर, पीबीएस के साथ नमूने 3 बार धोएं।
नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कि प्राथमिक के मेजबान से मेलएंटीबॉडी। Hoechest33343 (1: 2,000) परमाणु धुंधला के लिए प्रयोग किया जाता है। - एक स्लाइड कांच के बढ़ते समाधान जोड़ें और बढ़ते के साथ आगे बढ़ें। कई तरंग दैर्ध्य पर निरीक्षण करें और छवि एक confocal खुर्दबीन पर नमूना: FITC (488 एनएम), Cy3 (543 एनएम), Cy5 (647 एनएम), और Hoechest33343 (405 एनएम)।
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Representative Results
अज्ञात तंत्रिकाजन्य क्षेत्र से aNSCs के लिए संस्कृति प्रणाली को परिभाषित करने के लिए इन कोशिकाओं को समझने के लिए और मस्तिष्क की मरम्मत 12 में अपनी क्षमता का उपयोग विकास के लिए आवश्यक है। यह ज्ञात है कि विकास के विभिन्न चरणों में या अलग-अलग क्षेत्रों में अलग ढंग से एनएससी 3,4 व्यवहार करते हैं। हाल ही में, यह बताया गया कि SCZ व्युत्पन्न कोशिकाओं SVZ व्युत्पन्न कोशिकाओं 7-9 की तुलना में vivo में इन विट्रो में neuronal भेदभाव के लिए अंतर क्षमता दिखा रहे हैं। इसलिए, ठीक प्रत्येक तंत्रिकाजन्य क्षेत्र को अलग करने, मस्तिष्क स्लाइस कि SCZ शामिल एक 1 मिमी मस्तिष्क मैट्रिक्स (चित्रा 1 ए) का उपयोग विच्छेदित कर रहे थे। विकास के कारकों के साथ संस्कृति के 8 दिनों के बाद, SCZ से निकाली गई aNSCs neurospheres, जो कोशिकाओं बाद में बनाए रखा जा सकता है (चित्रा 1 बी) के रूप में कर सकते हैं।
चूंकि neurospheres में एनएससी के एक सबसेट एसपीओ हो सकता हैntaneously 13 भेदभाव, एक monolayer संस्कृति प्रणाली भी SCZ-aNSCs की अपेक्षाकृत सजातीय आबादी के रखरखाव के लिए उपयोगी है। वृद्धि कारक है और इस तरह के रूप में trypsin हदबंदी एंजाइमों आसानी से neurosphere 14,15 के अंदर गहरे तर नहीं है। Monolayer संस्कृतियों एनएससी के विस्तार के लिए और भी अधिक शर्तों प्रदान करते हैं। प्राथमिक neurospheres से, SCZ-aNSCs एक पाचन बफर उपचार द्वारा एकल कक्षों में अलग किया गया। सेल बोने के बाद एक दिन, aNSCs लेपित प्लेट और प्रदर्शित सेल प्रसार (2A चित्रा) से जुड़े थे। प्रसार की अपनी शक्ति की पुष्टि, BrdU मीडिया में जोड़ा गया है। 2 घंटे के लिए BrdU के साथ ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं को आसानी से विरोधी BrdU (प्रसार के लिए एक मार्कर) और विरोधी Nestin एंटीबॉडी (तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) के साथ दाग रहे थे, यह दर्शाता है कि SCZ-aNSCs सक्रिय रूप से proliferating और के प्रमुख गुण को बनाए रखने रहे स्टेम कोशिकाओं (चित्रा 2 बी)। तदनुसार, वे exh नहीं कियाIBIT ऐसे EGFR के रूप में विभेदित कोशिकाओं, (क्षणिक amplifying कोशिकाओं में व्यक्त) और DCX (neuroblasts में व्यक्त) (चित्रा 2 सी) के लिए मार्करों।
SCZ-aNSCs के कई भेदभाव की क्षमता इस बात की पुष्टि करने के लिए, विकास के कारकों संस्कृति मीडिया से हटा दिया गया। 6 दिन बाद, कोशिकाओं विभेदित कोशिकाओं के लिए विभिन्न निर्माताओं के साथ immunostained गया। अलग aNSCs के न्यूरॉन्स के लिए (Tuj1) (GFAP) (O4) संततियों, मार्कर, astrocytes, और oligodendrocytes कार्यरत थे प्रदर्शन करने के लिए; इन प्रकार की कोशिकाओं के सभी SCZ-aNSCs से (चित्रा 3) उत्पन्न किया गया।
चित्रा 1: SCZ क्षेत्र और neurosphere के गठन के अलगाव। (ए) वयस्क माउस मस्तिष्क से SCZ क्षेत्र के विच्छेदन के लिए प्रक्रिया। संस्कृति SCZ-एक करने के लिएअनुसूचित जाति, एक 8 सप्ताह पुरानी माउस मस्तिष्क एक मस्तिष्क मैट्रिक्स (1 मिमी अंतराल) पर रखा गया है। सेक्शनिंग, 1 मिमी मस्तिष्क स्लाइस कि SCZ क्षेत्र (शीर्षस्थान से 2-3 मिमी) विच्छेदित कर रहे थे (लाल बिंदीदार रेखा द्वारा इंगित) शामिल करने के बाद। (बी) neurosphere गठन। इन विट्रो संस्कृति, प्राथमिक neurospheres (बीतने के 0) के बाद आठ दिन का गठन और passaged थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक monolayer संस्कृति के रूप में SCZ-aNSCs का रखरखाव। (ए) विच्छेदित कोशिकाओं बोने के बाद एक दिन, SCZ-aNSCs जुड़ी है और एक monolayer ढंग (बाएं) में एक लेपित पकवान पर विस्तार किया गया। तीन दिन के बाद रखरखाव, SCZ-aNSCs की संख्या बढ़ गया था (दाएं)। (बी) BrdU (लाल, कोशिकाओं proliferating के लिए एक मार्कर), Nestin (हरे, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के लिए एक मार्कर), और Hoechest33343 (नीले, नाभिक के लिए एक मार्कर) के साथ Immunostaining। (सी) तंत्रिका स्टेम साथ Immunostaining / पूर्वज सेल मार्कर Nestin (लाल, ग्रुप बी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के लिए एक मार्कर), EGFR (हरा, C क्षणिक amplifying कोशिकाओं के लिए एक मार्कर), और DCX (नीले, प्रकार एक के लिए एक मार्कर neuroblasts)। नाभिक Hoechest33343 (सफेद) के साथ counterstained थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: SCZ-aNSCs से विभेदित कोशिकाओं के Immunostaining। साथ भेदभाव मार्करों Tuj1 (हरे, अपरिपक्व न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर), O4 (लाल, oligodendrocytes के लिए एक मार्कर), और GFAP Immunostaining (चिल्लानाओउ, astrocytes के लिए एक मार्कर)। बढ़ाया छवियों insets के रूप में दिखाया जाता है। Hoechest33343 (नीला) काउंटर धुंधला नाभिक के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह पत्र एक विस्तृत प्रोटोकॉल वयस्क माउस SCZ से एनएससी उत्पन्न करने के लिए और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए उन्हें बनाए रखने के लिए वर्णन करता है। वहाँ इन विट्रो संस्कृति को शुद्ध और विस्तार करने के लिए SCZ-एनएससी की जरूरत प्रणाली की स्थापना के लिए तीन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करने के लिए कि SCZ क्षेत्र ठीक अन्य संभावित तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों (चित्रा 1 बी) से बाहर विच्छेदित है महत्वपूर्ण है। SCZ क्षेत्रों युक्त मोटी और सटीक वर्गों एक 1 मिमी अंतराल मस्तिष्क मैट्रिक्स के साथ प्राप्त किया गया, और फिर एक ठीक सुई अन्य cortical क्षेत्रों (चित्रा 1 ए) से SCZ की सूक्ष्म विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया गया था। जब गैर एनएससी ऐसे सेरेब्रल कॉर्टेक्स के रूप में आसन्न ऊतकों, से, SCZ-aNSCs साथ सुसंस्कृत हैं, भयावह मौत होती है, जो नकारात्मक व्यवहार्यता और SCZ-एनएससी 16-18,22 के क्षेत्र के गठन को प्रभावित करता है। दुम SCZ (2-3 मिमी शीर्षस्थान के पीछे) अलग-SCZ aNSCs पैदा करने के लिए सबसे अच्छा क्षेत्र के रूप में पुष्टि की गई। दूसरा, appropकटाई और passaging चरणों में riate enzymatic उपचार कोशिकाओं के एक उच्च उपज प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। Dispase द्वितीय और papain trypsin से aNSCs अलग-थलग करने के लिए और अधिक प्रभावी रहे थे। हदबंदी बफर के बजाय trypsin के साथ passaging के लिए कोशिकाओं की हदबंदी उनकी व्यवहार्यता 19 बढ़ाया। यांत्रिक हदबंदी और एक विंदुक के साथ विचूर्णन कम से कम होना चाहिए। तीसरा, एक सेल झरनी आम तौर पर प्राथमिक संस्कृति प्रणालियों में इस्तेमाल किया जाता है ऊतक पाचन के बाद सेलुलर मलबे को हटाने के लिए। हालांकि, SCZ-aNSCs का स्थानीयकरण के कारण, इन कोशिकाओं एंजाइम पाचन और यांत्रिक विचूर्णन द्वारा सफेद पदार्थ का टूटना के बाद प्राप्त कर रहे हैं। एक सेल झरनी के साथ छानने का काम के दौरान कोशिकाओं का एक पर्याप्त राशि खो जाएगा। इसलिए, एक सेल झरनी का उपयोग किए बिना SCZ-aNSCs संवर्धन कोशिकाओं के एक उच्च उपज प्राप्त करने के लिए एक बेहतर तरीका है।
दोनों neurosphere संस्कृतियों और monolayer संस्कृतियों एनएससी के रखरखाव, न्यूरो की एक सीमा के लिए लागू किया जा सकता हैक्षेत्र संस्कृति है कि एकल एनएससी अलग बंटवारे के बाद बेतरतीब ढंग से एकत्रित किया जा सकता है। neurospheres के विभिन्न आकारों में एकत्रीकरण का परिणाम है। एक neurosphere के आकार के एक निश्चित महत्वपूर्ण मूल्य तक पहुँच जाता है, neurosphere कोर 20 में पोषक तत्वों की कमी, वृद्धि कारक है, और ऑक्सीजन की वजह से, एक विषम संरचना के रूप में बढ़ता है। इसके अलावा, बड़े आकार के साथ neurospheres आसानी से हदबंदी बफर के साथ अलग और कम सेल व्यवहार्यता के लिए अग्रणी, व्यापक यांत्रिक विचूर्णन के साथ लंबे समय तक enzymatic उपचार समय की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं। इसलिए, monolayer संस्कृति प्रणाली कई मार्ग के माध्यम से SCZ-aNSCs बनाए रखने के लिए सिफारिश की है। एक monolayer संस्कृति प्रणाली में, aNSCs स्थिरतापूर्वक एनएससी (ग्रुप बी) के रूप में सहज भेदभाव के बिना इस तरह के रूप में progenitors (टाइप सी और ए) (चित्रा 3 ए) निर्दिष्ट कोशिकाओं में रखा जाता है। SCZ-aNSCs विस्तारित अवधि, एक monolayer के रूप <एक neurosphere प्रारूप में 5 मार्ग और> 10 मार्ग के लिए passaged थे। यह विपक्ष हैपिछले परिणाम है, जो बताते हैं कि monolayer संस्कृति प्रणाली लंबी अवधि संस्कृतियों 21 में इन विट्रो में एनएससी का कहना है के साथ istent। हालांकि, proliferating गति में कमी आई है, और मर कोशिकाओं के भाग 5 मार्ग में वृद्धि हुई। विस्तारित passaging multipotency और बढ़ गुणसूत्र विपथन 22 के साथ neuronal भेदभाव को प्रभावित करता है। इसलिए, विस्तारित passaging प्रभाव से बचने के लिए, यह प्रसार और भेदभाव के विश्लेषण के लिए जल्दी पारित होने (<पारित होने के 5) कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। हालांकि SCZ-aNSCs की आत्म नवीकरण के लिए संभावित SVZ-aNSCs के समान है, कम neuronal भेदभाव SCZ-aNSCs 9 में दिखाया गया था।
वयस्क मस्तिष्क के तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों, SVZ और दांतेदार गाइरस (डीजी) सहित से aNSCs अलग-थलग करने के लिए तरीके, 22 की स्थापना की गई है। हालांकि इस तरह के प्रोटोकॉल का अलगाव और इन विट्रो में aNSCs की खेती को बढ़ावा दिया है, वहाँ के एक उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए कई सीमाएं हैंकोशिकाओं। कई प्रोटोकॉल एक मस्तिष्क ऊतक हेलिकॉप्टर कि काट प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों का नुकसान हो सकता है का उपयोग। एक और दृष्टिकोण तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों से aNSCs अलग करने के लिए एक छुरी का उपयोग कर मस्तिष्क के माध्यम से एक राज्याभिषेक कटौती का उपयोग करता है। इस SVZ की सूक्ष्म विच्छेदन के द्वारा या अनुदैर्ध्य विदर 23 के साथ डीजी का पीछा किया जाता है। मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों की उपस्थिति अन्य प्रकार की कोशिकाओं aNSC संस्कृति है, जो इन विट्रो में कोशिकाओं की व्यवहार्यता प्रभावित हो सकती है दूषित करने के लिए पैदा कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, कई अलग अलग नमूने एक ही प्रयोग में कामयाब हो सकता है, प्रयोगात्मक समूहों की एक किस्म बनाम नियंत्रण भी शामिल है। इसके अलावा, एक मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग टुकड़ा करने की क्रिया, एक मस्तिष्क काट उपकरण के लिए बेहतर है, क्योंकि यह एक उच्च सेल उपज के साथ मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से एनएससी की प्राप्ति के लिए अनुमति देता है। यह भी एक ही मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से aNSCs की तुलना में सक्षम बनाता है।
प्रत्यारोपण और अंतर्जात एनएससी के इंजीनियरिंग considere किया गया हैस्टेम सेल थेरेपी के लिए संभव रणनीतियों के रूप में डी। इस के लिए, aNSCs की विशेषताओं के बारे में इन विट्रो अध्ययनों से यह भी व्यापक पता लगाया जाना चाहिए। इसलिए, इन विट्रो संस्कृति प्रणाली में एक अच्छी तरह से विशेषता की स्थापना एनएससी के आवेदन को आगे बढ़ाने के लिए उपयोगी हो जाएगा। इस संस्कृति प्रणाली में, SCZ-aNSCs के स्टेम सेल गुण अच्छी तरह से बनाए रखा गया है, के रूप में आत्म नवीकरण और उचित शर्तों के तहत कई-वंश भेदभाव इसका सबूत है। इसलिए, इस संस्कृति प्रणाली जैविक अध्ययन और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए SCZ-aNSCs के विस्तार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
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