Protocol
1. Préparation des matériaux et de la culture moyenne
- Pour la dissection et la dissociation du SCZ, envelopper la matrice du cerveau, à double tranchant lame de rasoir, et une pince avec une feuille d'aluminium, puis les stériliser par autoclavage.
- Préparer 50 ml de tampon PBS froid pour laver l'ensemble du cerveau de souris.
- Mettre en place un microscope de dissection et préparer les outils chirurgicaux nécessaires à la dissection du cerveau (ciseaux et des pinces autoclavés) et l'isolement de la SCZ (seringue de 1 ml, 30 aiguille G, matrice de cerveau, et une pince fine).
- Préparation de N2 moyen:
- Préparer F-12 / DMEM (+ L-glutamine + bicarbonate de sodium) milieu avec 2% de B27, 1% de suppléments N2, et 1% de pénicilline- streptomycine.
Remarque: Le milieu de culture se compose de milieu de croissance et les facteurs N2 (20 ng / ml épidermique purifiée du facteur de croissance (EGF) et 20 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF2)).
- Préparer F-12 / DMEM (+ L-glutamine + bicarbonate de sodium) milieu avec 2% de B27, 1% de suppléments N2, et 1% de pénicilline- streptomycine.
- Préparer un tampon de digestion (40 unités / ml papaïne, 2,4 unité / ml DISPASe II, et 2% de pénicilline-streptomycine dans du PBS) pour la digestion des tissus.
- Préparation de la plaque de revêtement et Coverslip:
- Préparer la poly-L-ornithine (OLP; 0,01%) et de laminine (10 pg / ml dissous dans DH 2 O). Pour enrober des plaques 6 puits pour le maintien de la SCZ-aNSCs en monocouche ou 18 lamelles mm pour immunocoloration, les incuber avec l'OLP nuit à 4 ° C. Ensuite , lavez - les 3 fois avec DH 2 O. Laisser les plaques et lamelles sécher après le dernier lavage.
- Ensuite, incuber les plaques avec la laminine nuit à 4 ° C. Ensuite, lavez - les 3 fois avec DH 2 O.
Attention: Ne pas sécher la laminine, qui aura une incidence sur la fixation des cellules.
Remarque: Les solutions de revêtement peuvent être réutilisés 3 fois.
2. Isolement et Dissociation du SCZ Adult
- Avant la préparation de la culture, placer la matrice du cerveau et le rasoir à double tranchant sur la glace.
Note: Ne pas congeler la matrice du cerveau, parce que le brain pourrait attacher. - Sacrifiez une souris (8 semaines) par le CO 2 asphyxie ou la dislocation cervicale.
- Coupez la tête avec des ciseaux pointus après la pulvérisation de 70% d'éthanol. Pour immobiliser la tête, tenez les deux côtés de la tête fermement. Couper la peau avec des ciseaux à la ligne médiane dans une direction caudale-rostrale. Ceci favorise l'élimination complète de la peau du crâne.
- Retirer la partie caudale du crâne (postérieur lambda) d'abord, puis insérez la pince entre le crâne et le cerveau à la position dorsale médiane. Prenez la gauche (ou à droite) os pariétal et éplucher soigneusement hors tension. Répétez cette procédure pour le retrait de l'autre os pariétal.
Note: Disconnection du nerf optique et le retrait des méninges du cerveau rendre plus facile à détacher le cerveau du crâne. - Transférer le cerveau à un tampon PBS froid (25 ml) et le rincer deux fois pour éliminer l'excès de sang.
- Placer le cerveau dans la matrice de cerveau sur de la glace et de macoupes coronales ke pour obtenir 1 mm tranches épaisses. Transférer les tranches de cerveau (1 mm) contenant les régions SCZ qui sont situées dans la partie postérieure du cerveau à un PBS froid dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm.
Attention: Afin d'obtenir un plan parallèle de coupes coronales, veiller à ce que la fissure du cerveau est placé dans la ligne médiane de la matrice du cerveau; il est essentiel d'éviter des variations inutiles dans les sections.
Remarque: Obtenir des tranches de cerveau à 2-3 mm en arrière bregma; ce qui permet la séparation de la SCZ de la SVZ. - Sous le microscope de dissection avec un faible grossissement, les micro-disséquer la SCZ de la zone de la matière blanche du cortex et de l' hippocampe avec une aiguille de 6,9 30G pliée. Ensuite, retirez les régions du cortex au-dessus du SCZ. Placez la région SCZ disséqués à partir des tranches dans un plat en plastique de Pétri de 35 mm sur la glace sans PBS froid.
Remarque: La contamination des régions supplémentaires contenant des neurones matures pourrait affecter la viabilité des aNSCs et Neurosphère formation barce qu'ils subissent la mort cellulaire dans des conditions de culture ANSC. - En utilisant une aiguille 30 G plié, hacher immédiatement les tissus disséqués en petits morceaux.
Remarque: Si un temps plus long est nécessaire pour disséquer le tissu SCZ, plonger les tissus disséqués dans du PBS froid avant de les hacher. - Remettre en suspension du tissu haché avec 1 ml de tampon de digestion, le transfert du tissu dans un tube de 15 ml contenant 2 ml de tampon de digestion, et on incube pendant 30 min dans un bain d'eau à 37 ° C.
Remarque: Agiter le tube toutes les 10 minutes pour bien mélanger.
3. Subcallosal Zone dérivée Culture Adulte Neural Stem Cell
- Appuyez sur le tube légèrement à dissocier le tissu digéré, puis centrifuger le tube à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant, remis en suspension le tissu digéré avec 1 ml de milieu N2 préchauffé pour laver le tampon de digestion, et pipeter doucement la solution d'échantillon d'un maximum de 5 fois à l'aide d'une pipette P1000.
Note: Over-triturant avec une étroiteembout pipette peut diminuer la viabilité cellulaire et la croissance ultérieure. - Centrifuger le tube à 145 g pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu N2.
- Préparer 1 ml de milieu N2 dans une plaque non revêtue de 6 puits et ajouter 1 ml de cellules en suspension pour obtenir un volume final de 2 ml.
- Ajouter de l'EGF (20 ng / ml), et bFGF (20 ng / ml) dans chaque puits. Secouer doucement la boîte de culture de 6 puits à la main pour mélanger les facteurs de croissance ajoutés avec les cellules étalées. Gardez la plaque de 6 puits dans un incubateur à CO2 à 37 ° C et 5%.
- Ajouter de l'EGF (20 ng / ml), et bFGF (20 ng / ml) à chaque puits tous les jours pendant 8 jours. Le troisième jour, ajouter 200 ul de milieu N2 pour maintenir le volume de 2 ml environ du milieu.
4. Le repiquage de NNC comme neurosphères et aux cultures monocouches
- Rassemblez les neurosphères et les transférer dans un nouveau tube conique de 15 ml.
Note: Le nombre de neurosphères (> 50 um de diamètre) per et de la SCZ d'un cerveau de souris seul était de 64,3 ± 7,31, ce qui était inférieur à celui de la SVZ (190,5 ± 6,33) 9. - Incuber les neurosphères avec 0,5 ml de tampon de dissociation pendant 5 min dans un bain-marie à 37 ° par rapport à dissocier les neurosphères dans des cellules individuelles. neurosphères primaires peuvent être dissociées en cellules individuelles et maintenues sur plusieurs passages comme neurosphères ou monocouche cultures.
Remarque: Le développement SCZ-aNSCs en monocouche est supérieure à celle neurosphères parce SCZ-aNSCs peuvent être repiquées> 10 fois dans un format de culture en monocouche, mais <5 fois dans un format de culture de neurosphères.
Attention: SCZ-aNSCs présentent une forte agrégation, et il est difficile de les dissocier en cellules individuelles. Ainsi, le format de la culture de neurosphères est pas recommandé pour l'expansion cellulaire de routine. - pipeter doucement la solution d'échantillon de haut en bas avec une pipette P1000 moins de 5 fois et centrifuger le tube à 145 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et re-supasser les neurosphères avec 1 ml de milieu N2.
Note: Plus triturant avec une pointe de pipette étroite peut diminuer la viabilité cellulaire et la croissance ultérieure. - Pour compter les cellules, faire un mélange 1: 1 de la suspension cellulaire (10 pi) et la solution de bleu de trypan 0,4%, puis compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre. Après le revêtement d' une plaque à 6 puits avec l' OLP / laminine, plaque les cellules à 2,5 x 10 5 cellules / ml avec 2 ml de milieu N2 pour chaque puits.
Remarque: Les modifications de la densité cellulaire peuvent influer sur leur état et le potentiel de différenciation. - Maintenir les SCZ-aNSCs avec un traitement quotidien des facteurs de croissance (2 ml, 20 ng / ml) pendant 5 jours, et leur passage entre eux.
5. Différenciation des Subcallosal Zone dérivées des cellules souches adultes de neurones
- Plaque aNSCs sur une PLO / laminine revêtu 18 mm lamelle couvre -objet avec 1 x 10 5 cellules / ml dans 1 ml de N2 avec des facteurs de croissance (20 ng / ml) pour la différenciation des SCZ-aNSCs.
- Le jour suivant,lorsque les cellules sont fermement attachés à la lamelle, échanger le milieu de croissance avec N2 pour éliminer les facteurs de croissance.
- Après 6 jours, laver les cellules différenciées avec 1 ml de PBS pour éliminer les débris cellulaires et les fixer pour immunocoloration.
Remarque: BrdU peut être incorporé dans l'ADN nouvellement synthétisé de cellules proliférantes. Par conséquent, si on le souhaite, la BrdU (10 ug / ml) peut être ajouté aux cellules vivantes avant la fixation des cellules.
6. immunocoloration adulte cellules souches neurales et Differentiated progéniteurs
- Pour immunocoloration, laver les cellules avec du PBS et les fixer avec 4% de PFA pendant 20 min à température ambiante.
Attention: PFA est très toxique; éviter tout contact avec la peau et les yeux. - Retirer les 4% PFA, rincer les cellules fixées avec du PBS 3 fois, puis les stocker à 4 ° Cuntil ils sont nécessaires pour immunocoloration.
- Incuber les cellules sur la lamelle couvre-objet avec une solution de blocage (3% de sérum albumine bovine et 0,1% de Triton X-100 dans 1 x PBS) pendant au moins 30 min à température ambiante.
- Préparer les anticorps primaires dans une solution de blocage frais et incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C.
- Immunocoloration les aNSCs
- Colorer les aNSCs utilisant anti-nestine et des anticorps anti-BrdU. Avant la fixation, ajouter 20 pg de BrdU aux aNSCs et incuber pendant 2 h. Effectuer l'étape de dénaturation à l'aide du HCl 2 N pendant 20 min à 37 ° CAvant effectuer l'étape de blocage.
- Immunocoloration les progéniteurs différenciés:
- Utiliser l'anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), les anticorps anti-O4, anti-bIII-tubuline, et d'étiqueter les progéniteurs différenciés.
- Immunocoloration les aNSCs
- Laver les échantillons avec du PBS 3 fois et de les laisser incuber avec des anticorps secondaires conjugués à des colorants fluorescents (1: 500) dans une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, les échantillons de lavage 3 fois avec du PBS.
Remarque: Utilisez des anticorps secondaires qui correspondent aux hôtes du primairedes anticorps. Hoechest33343 (1: 2000) est utilisé pour la coloration nucléaire. - Ajouter une solution de montage à une lame de verre et procéder au montage. Observer et l'image de l'échantillon sur un microscope confocal à de multiples longueurs d'onde: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), et Hoechest33343 (405 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Définition du système de culture pour aNSCs de la région neurogène inconnue est essentielle pour la compréhension de ces cellules et pour le développement de leur utilisation potentielle dans la réparation du cerveau 12. Il est connu que NNC à différents stades de développement ou dans des régions différentes se comportent différemment 3,4. Récemment, il a été rapporté que des cellules dérivées SCZ présentent des potentiels différentiels pour la différenciation neuronale in vivo et in vitro par rapport à des cellules dérivées SVZ 7-9. Par conséquent, pour isoler précisément chaque région neurogène, des tranches de cerveau qui incluent le SCZ ont été disséqués en utilisant une matrice cérébrale 1 mm (figure 1A). Après 8 jours de culture avec des facteurs de croissance, aNSCs dérivés de la SCZ peuvent former des neurosphères, dans lequel les cellules peuvent ensuite être conservés (figure 1B).
Depuis un sous-ensemble de NNC dans les neurosphères peut être spontaneously différenciée 13, un système de culture en monocouche est également utile pour le maintien de la population relativement homogène de SCZ-aNSCs. Les facteurs de croissance et les enzymes de dissociation telles que la trypsine ne pénètrent pas facilement profondément à l' intérieur de l'Neurosphère 14,15. Des cultures monocouches offrent des conditions plus uniformes pour l'expansion de NNC. À partir neurosphères primaires, SCZ-aNSCs ont été dissociées en cellules individuelles par un traitement de tampon de digestion. Un jour après l' ensemencement des cellules, aNSCs ont été fixées à la plaque revêtue et la prolifération des cellules exposées (figure 2A). Pour confirmer leur puissance de la prolifération, BrdU a été ajouté dans les médias. Après incubation avec BrdU pendant 2 heures, les cellules ont été facilement colorées avec un anticorps anti-BrdU (un marqueur pour la prolifération) et anti-nestine (un marqueur des cellules souches nerveuses) des anticorps, ce qui indique que SCZ-aNSCs sont activement proliférer et à maintenir les propriétés essentielles de les cellules souches (figure 2B). En conséquence, ils ne l'ont pas exhibit marqueurs pour des cellules différenciées, telles que l' EGFR dans les cellules (exprimés transitoirement d' amplification) et DCX (exprimée en neuroblastes) (figure 2C).
Pour confirmer le potentiel de différenciation multiple de SCZ-aNSCs, des facteurs de croissance ont été enlevés du milieu de culture. Après 6 jours, les cellules ont été immunocolorées avec divers fabricants pour les cellules différenciées. Pour exposer les différentes descendances de aNSCs, des marqueurs pour les neurones (Tuj1), les astrocytes (GFAP) et oligodendrocytes (O4) ont été employées; tous ces types cellulaires ont été générés à partir de la SCZ-aNSCs (figure 3).
Figure 1: Isolement de la région ZSC et la formation du neurosphères. (A) Procédé pour la dissection de la région SCZ à partir du cerveau de souris adulte. Pour la culture de la SCZ-aNSC, un cerveau de souris âgée de 8 semaines est placée sur une matrice cérébrale (1 mm d'intervalles). Après la coupe, 1 mm tranches de cerveau qui comprenait la région SCZ (2-3 mm du bregma) ont été disséquées (indiquée par la ligne en pointillé rouge). Formation (B) Neurosphère. Huit jours après la culture in vitro, neurosphères primaires (passage 0) ont été formés et repiquées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Maintien des SCZ-aNSCs en culture monocouche. (A) Un jour après l' ensemencement des cellules disséquées, SCZ-aNSCs étaient attachées et étendu sur un plat revêtu d'une manière monocouche ( à gauche). Trois jours après l'entretien, le nombre de SCZ-aNSCs a été augmentée (à droite). (B) Immunocoloration avec du BrdU (rouge, un marqueur pour des cellules en prolifération), la nestine (vert, un marqueur pour les cellules souches neurales) et Hoechest33343 (bleu, un marqueur pour les noyaux). (C) immunocoloration avec souches neurales / marqueurs de cellules progénitrices Nestin (rouge, un marqueur pour les cellules souches de type B neuronal), EGFR (vert, un marqueur pour les cellules transitoires d' amplification de type C), et DCX (bleu, un marqueur de type A neuroblastes). Les noyaux ont été contre-colorées avec Hoechest33343 (blanc). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: immunocoloration des cellules différenciées des SCZ-aNSCs. Immunocoloration avec des marqueurs de différenciation Tuj1 (vert, un marqueur pour les neurones immatures), O4 (rouge, un marqueur pour les oligodendrocytes) et GFAP (crierow, un marqueur pour les astrocytes). images grossies sont présentés comme empiècements. Hoechest33343 (bleu) a été utilisé pour la contre-coloration des noyaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce document décrit un protocole détaillé pour générer NNC de la SCZ de souris adulte et de les maintenir pour diverses applications. Il y a trois étapes essentielles pour établir le système in vitro de culture nécessaire pour purifier et développer SCZ-NNC. Tout d' abord, il est important de veiller à ce que la région SCZ est précisément disséqué à partir d' autres régions neurogènes potentiels (figure 1B). Sections épaisses et précises contenant les régions SCZ ont été obtenus avec une matrice de cerveau intervalle de 1 mm, puis une fine aiguille a été utilisée pour la micro-dissection de la SCZ d'autres régions corticales (Figure 1A). Lorsque non-NSCs des tissus adjacents, tels que le cortex cérébral, sont cultivées avec SCZ-aNSCs, la mort catastrophique se produit, ce qui affecte négativement la viabilité et la sphère formation de SCZ-NSCs 16-18,22. La SCZ caudale (2-3 mm de postérieur à bregma) a été confirmé comme la meilleure région pour générer distinctes SCZ-aNSCs. En second lieu, le appropun traitement enzymatique riée dans les étapes de récolte et de repiquage est essentielle pour obtenir un rendement élevé de cellules. Dispase II et la papaïne étaient plus efficaces pour isoler aNSCs que trypsine. Dissociation de cellules pour repiquage avec un tampon de dissociation au lieu de trypsine amélioré leur viabilité 19. dissociation mécanique et trituration avec une pipette devrait être minime. Troisièmement, un tamis cellulaire est généralement utilisé dans les systèmes de culture primaire pour éliminer les débris cellulaires après digestion des tissus. Cependant, en raison de la localisation de SCZ-aNSCs, ces cellules sont obtenues après la rupture de la substance blanche par digestion enzymatique et trituration mécanique. Lors de la filtration avec un tamis cellulaire, une quantité substantielle de cellules serait perdue. Par conséquent, la culture de SCZ-aNSCs sans l'aide d'un tamis cellulaire est une meilleure façon d'obtenir un rendement élevé de cellules.
Alors que les deux cultures et les neurosphères cultures monocouches peuvent être appliquées au maintien de NNC, une limitation de la neurola culture de la sphère est que NSCs simples dissociées après la séparation peuvent être agrégées au hasard. Les résultats de l'agrégation de différentes tailles de neurosphères. Lorsque la taille d'une neurosphère atteint une certaine valeur critique, la neurosphères pousse comme une structure hétérogène, en raison d'un manque de nutriments, facteurs de croissance et de l' oxygène au cœur 20. En outre, neurosphères avec de grandes tailles ne sont pas facilement dissociées avec un tampon de dissociation et nécessitent des temps de traitement plus enzymatiques ayant une grande trituration mécanique, ce qui conduit à abaisser la viabilité cellulaire. Par conséquent, le système de culture en monocouche est recommandé de maintenir SCZ-aNSCs à travers de multiples passages. Dans un système de culture monocouche, aNSCs sont maintenus de manière stable comme NNC (type B) , sans différenciation spontanée dans les cellules spécifiées, comme progéniteurs (types C et A) (figure 3A). SCZ-aNSCs ont été repiquées pendant des périodes prolongées, <5 passages dans un format Neurosphère et> 10 passages comme une monocouche. Ceci est contreistent avec les résultats précédents, ce qui suggère que le système de culture monocouche maintient NSCs in vitro dans des cultures à long terme 21. Cependant, la vitesse de prolifération diminuée, et la portion de cellules mourantes augmenté par rapport à 5 passages. Repiquage prolongé affecte la multipotence et la différenciation neuronale avec une augmentation d' aberration chromosomique 22. Par conséquent, pour éviter les effets de repiquage prolongés, il est recommandé d'utiliser le passage précoce (<passage 5) cellules pour la prolifération et de l'analyse de la différenciation. Bien que le potentiel d'auto-renouvellement de SCZ-aNSCs est similaire à SVZ-aNSCs, la différenciation neuronale moins a été montré dans SCZ-aNSCs 9.
Les procédés d'isolement aNSCs des régions neurogènes du cerveau adulte, y compris la SVZ et le gyrus dentelé (DG) ont été établies 22. Bien que ces protocoles ont favorisé l'isolement et la culture aNSCs in vitro, il existe plusieurs limites à l'obtention d'un nombre élevé decellules. De nombreux protocoles utilisent un broyeur de tissu cérébral qui peut provoquer la perte du tissu cérébral lors de la procédure de découpage. Une autre approche pour isoler aNSCs des régions neurogènes utilise une coupe coronale à travers le cerveau à l'aide d'un scalpel. Elle est suivie par la micro-dissection de la SVZ ou de la direction générale le long de la fente longitudinale 23. La présence d'autres régions du cerveau peut provoquer d' autres types cellulaires de contaminer la culture ANSC, ce qui pourrait affecter la viabilité des cellules in vitro. Avec le protocole actuel, de nombreux échantillons différents peuvent être gérés dans une seule expérience, y compris les contrôles par rapport à une variété de groupes expérimentaux. En outre, le tranchage en utilisant une matrice de cerveau est supérieure à un outil de coupe du cerveau, car elle permet la réalisation de NNC de diverses régions du cerveau avec un rendement cellulaire élevé. Elle permet également à la comparaison des aNSCs provenant de différentes régions du même cerveau.
Transplantation et de l'ingénierie de NNC endogènes ont été considered comme des stratégies possibles pour la thérapie des cellules souches. Pour cela, des études in vitro sur les caractéristiques de aNSCs devraient également être explorées en détail. Par conséquent, la mise en place d'un bien caractérisé dans le système de culture in vitro sera utile pour favoriser l'application de NNC. Dans ce système de culture, les propriétés de cellules souches de SCZ-aNSCs étaient bien entretenus, comme en témoigne l'auto-renouvellement et de différenciation multiple lignée dans les conditions appropriées. Par conséquent, ce système de culture peut être utilisé pour l'expansion de SCZ-aNSCs pour des études biologiques et des applications thérapeutiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
