Protocol
Malzemeler ve kültür besiyeri hazırlanması 1.
- SCz diseksiyonu ve ayrışma için, alüminyum folyo ile beyin matrisi, iki ucu keskin jilet ve forseps sarın ve daha sonra otoklav ile sterilize.
- Bütün fare beyin yıkamak için soğuk PBS tamponu 50 ml hazırlayın.
- Bir diseksiyon mikroskobu kurmak ve beyin (otoklav makas ve forseps) diseksiyonu için gerekli cerrahi aletler ve SCZ (1 ml şırınga, 30 G iğne, beyin matris ve ince forseps) izolasyonuna hazırlar.
- N2 ortamında hazırlanması:
- F-12 / DMEM (+ L-glutamin + sodyum bikarbonat)% 2 B27,% 1, N2 takviyeleri ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile orta hazırlayın.
Not: büyüme ortamı N2 ortamı ve büyüme faktörleri oluşur (20 ng / ml saflaştırılmış epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF2)).
- F-12 / DMEM (+ L-glutamin + sodyum bikarbonat)% 2 B27,% 1, N2 takviyeleri ve% 1 Penisilin-Streptomisin ile orta hazırlayın.
- Bir sindirim tampon hazırlayın (40 ünite / ml papain, 2.4 ünite / ml dispase II ve% 2 penisilin-streptomisin, PBS içinde), Doku sindirimi için.
- Kaplama Plakası ve lamel hazırlanması:
- (0.01,% PLO) ve laminin (DH 2 O içinde çözülmüş 10 mg / ml), poli-L-ornitin hazırlayın. bir tek tabaka ya da immün 18 mm lamelleri olarak SCZ-aNSCs bakımı için kaplama 6 oyuklu plakalar, 4 ° C'de gece boyunca PLO ile inkübe edin. Sonra O. tabak ve lamelleri son yıkandıktan sonra kurumaya bırakın DH 2 ile onları 3 kez yıkayın.
- Daha sonra, gece boyunca 4 ° C 'de laminin inkübe edin. Sonra, DH 2 O. ile onları 3 kere yıkayın
Dikkat: hücre eki etkileyecek olan, laminin kurutmayın.
Not: kaplama çözeltileri 3 kez tekrar edilebilir.
2. İzolasyon ve Yetişkin SCz ve Ayrılma
- kültür hazırlama öncesinde, buz üzerinde beyin matrisi ve iki ucu keskin jilet yerleştirin.
Not: beyin matris dondurmak br çünkü etmeyinain buna eklemek olabilir. - CO 2 boğulma ya da servikal dislokasyon (8 haftalık) bir fare Kurban.
- % 70 etanol püskürtme sonra keskin bir makas ile kafasını kesti. kafasını hareketsiz kılmak, sıkıca başın her iki tarafını tutun. Bir kuyruk-rostral yönde orta hatta makas ile cilt kesin. Bu kafatası derinin tamamen kaldırılması teşvik etmektedir.
- dorsal orta hat konumunda kafatası ve beyin arasındaki forseps yerleştirin daha sonra ilk kafatasına (lambda posterior) kaudal parçası kaldırmak ve. sol (veya sağ) parietal kemik kapmak ve dikkatlice sökün. Diğer parietal kemiğin çıkarılması için bu yordamı yineleyin.
Not: Optik sinir ve beyin menenjlerin çıkarılması Ayırma daha kolay kafatası beyin ayırmak için yapmak. - Soğuk PBS tampon (25 ml) beyin aktarın ve aşırı kan çıkarmak için iki kez yıkayın.
- buz ve ma beyin matris içine beyin yerleştirinke koronal kesimler 1 mm kalınlığında dilimler elde etmek. 35 mm plastik Petri tabağı içine soğuk PBS beynin arka kısmında yer almaktadır SCZ bölgeler içeren Beyin dilimleri (1 mm) aktarın.
Dikkat: beyin fissür beyin matris orta hatta yerleştirilir emin olun, koronal kesitlerin paralel düzlemi elde etmek için; bölümlerde gereksiz değişimleri önlemek için önemlidir.
Not: Bregma 2-3 mm posterior beyin dilimleri alın; Bu SVZ'unda gelen SCZ ayrılmasını sağlar. - Düşük büyütme ile mikroskop altında, bir bükülmüş 30G iğne 6,9 ile korteks ve hipokampus beyaz cevher alanından SCZ mikro-teşrih. Ardından, SCZ yukarıdaki korteks bölgeleri kaldırın. soğuk PBS olmadan buz üzerinde bir 35 mm plastik petri içine dilim disseke SCZ bölgesini yerleştirin.
Not: olgun nöron içeren ekstra bölgelerin Kirlilik aNSCs ve neurosphere oluşum b canlılığını etkileyebilirçünkü ara bunlar ANSC kültür koşullarında hücre ölümüne uğrarlar. - bükülmüş 30 G iğne kullanılarak, hemen küçük parçalar halinde disseke dokuların doğrayın.
Not: daha uzun bir zaman SCZ doku kesme için gerekli ise, kesme işleminden önce soğuk PBS içinde parçalara dokuların bırakın. - Yeniden askıya sindirim tamponu 1 ml doğranmış doku, sindirim tamponu 2 mi ihtiva eden bir 15 ml tüp doku aktarın ve 37 ° C su banyosu içinde 30 dakika için inkübe edilir.
Not: iyice karıştırın etmek için tüpü her 10 dakikada sallayın.
3. Subcallosal Bölge türetilmiş Yetişkin Sinir Kök Hücre Kültürü
- sindirilmiş doku ayırmak hafif tüp dokunun ve ardından 5 dakika boyunca 145 xg'de tüp santrifüj. sindirim tamponu yıkamak için önceden ısıtılmış N2 ortamı 1 mL süpernatan, yeniden süspansiyon haline Sindirilmiş doku atın ve yavaşça örnek çözelti P1000 pipet kullanarak 5 kez fazla pipetleyin.
Not: Aşırı triturating dar olanpipetlemeyin ucu hücre canlılığı ve sonraki büyüme azaltabilir. - 5 dakika boyunca 145 x g'de tüp santrifüjleyin. Süpernatant atıldıktan sonra, N2 ortamı, 1 ml hücre pelletini yeniden askıya.
- olmayan bir kaplanmış 6-çukurlu plaka içindeki N2 ortamı içinde 1 ml hazırlayın ve 2 ml nihai bir hacimde süspanse hücrelerin 1 ml.
- Her kuyuya EGF (20 ng / ml) ve bFGF (20 ng / ml) eklenir. Yavaşça, tabakalanmış hücrelere ilave büyüme faktörleri karıştırmak için elle 6 oyuklu kültür çanak sallayın. 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatöründe 6 oyuklu plaka tutun.
- 8 gün boyunca her gün, her bir kuyucuğa EGF (20 ng / ml) ve bFGF (20 ng / ml) eklenir. Her üç gün ortam, yaklaşık 2 mi hacmını muhafaza etmek için N2 ortamı 200 ul ekle.
Neurospheres olarak ve Tek tabakalı Kültürler için NSC'lerde 4. Pasajlanması
- neurospheres toplayın ve yeni bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz.
Not: neurospheres sayısını (> 50 mikron çapında) pede tek bir fare beyin SCz gelen R SVZ'unda daha azdı 64.3 ± 7.31 idi (190.5 ± 6.33) 9. - Tek hücrelere Neurospheres ayırmak için bir 37 ° C su banyosu içinde 5 dakika için ayrılma tamponu, 0.5 ml Neurospheres inkübe edin. Birincil Neurospheres tek hücre halinde ayrılmış ve neurosphere ya tek tabakalı kültürler halinde birçok pasaj boyunca muhafaza edilebilir.
Not: SCZ-aNSCs bir neurosphere kültürü biçiminde bir tek tabakalı kültürü biçimde> 10 kat, fakat <5 kere daha pasaj yapıldı, çünkü tek-katman olarak SCZ-aNSCs Genişleyen neurospheres üstündür.
Dikkat: SCZ-aNSCs kuvvetli toplanmayı göstermektedir ve tek bir hücre içine, çözünmelerini zordur. Bu nedenle, neurosphere kültürü biçimi, rutin hücre genişlemesi için uygun değildir. - Yavaşça 5 dakika boyunca 145 xg'de yukarı ve aşağı P1000 pipet ile en az 5 kez ve santrifüj tüpü örnek çözümü pipetlemeyin. Süpernatantı ve yeniden-su atınN2 ortamı içinde 1 ml Neurospheres geçirirler.
Not: hücre canlılığı ve sonraki büyüme azaltabilir dar pipet ile öğütülerek üzerinde. - Hücre süspansiyonu (10 ul) ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 1 karışımı, ve daha sonra bir hematositometre ile canlı hücre sayısını: hücre sayımı için, 1 olun. PLO / laminin ile 6 çukurlu bir levha kaplandıktan sonra, her bir N2 ortamında, 2 ml 2.5 x 10 5 hücre / ml'de hücreleri plaka.
Not: hücre yoğunluğu değişiklikler durumlarını ve farklılaşma potansiyelinin etkileyebilir. - 5 gün boyunca büyüme faktörleri günlük tedaviden SCZ-aNSCs (2 mi, 20 ng / ml) korumak ve bunları kanalı bunları.
Subcallosal Bölgesi kaynaklı Yetişkin Sinir Kök Hücre 5. Farklılaşma
- SCZ-aNSCs farklılaşması için büyüme faktörleri ile 1 mi N2 (20 ng / ml), 1 x 10 5 hücre / ml bir PLO / laminin ile kaplanmış 18 mm örtücü kısım üzerine Levha aNSCs.
- Sonraki gün,Hücreler sıkıca lamel bağlandıkları zaman, büyüme faktörleri kaldırmak için N2 ile büyüme ortam değişikliği.
- 6 gün sonra, hücre artıklarının çıkarılması ve immün giderilmesi için 1 ml PBS ile farklılaşmış hücreleri yıkayın.
Not: BrdU çoğalan hücrelerin yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilebilir. arzu edildiği takdirde, bu nedenle, BrdU (10 ug / ml), hücrelerin tespit öncesi hücrelerin yaşama eklenebilir.
6. İmmünoboyama Erişkin Nöral Kök Hücreler ve Farklılaşmış Progenitörler
- immün için, hücrelerin PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA sabitleyin.
Dikkat: PFA son derece zehirli olduğu; Göz ve cilt ile temasından kaçının. - % 4 PFA kaldır 3 defa PBS ile sabit hücreleri durulanır ve daha sonra 4 ° Cuntil da immün için gerekli saklayın.
- (% 3 sığır serum albumin ve% 0.1 Triton X-100 1x P çözüm engelleme ile lamel hücreleri inkübeOda sıcaklığında, en az 30 dakika boyunca bs).
- Taze bloke çözeltisi içinde primer antikorların hazırlanması ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe örnekleri.
- aNSCs immün
- Anti-Nestin ve anti-BrdU antikoru ile aNSCs Leke. tespit önce aNSCs için BrdU 20 ug ilave edin ve 2 saat boyunca inkübe. bloke etme adımı gerçekleştirmek 37 ° Cbefore 20 dakika süreyle 2 N HCI kullanılarak denatüre aşamasını gerçekleştirir.
- farklılaşmış atalarıdır immün:
- farklı progenitörlerin etiketlemek için, anti-O4, anti-BIII-tubulin, ve anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) antikorları kullanın.
- aNSCs immün
- PBS ile 3 kez örnekleri yıkayıp floresan boyalar (1: 500) ile konjuge sekonder antikor ile inkübe oda sıcaklığında 30 dakika süre ile çözelti bloke. Sonra, PBS ile numuneleri 3 kere yıkayın.
Not: birincil ana maç Kullanım sekonder antikorlarantikorlardır. Hoechest33343 (1: 2,000) nükleer boyama için kullanılmaktadır. - bir slayt cam monte çözüm ekleyin ve montaj ile devam edin. Birden fazla dalga boylarında bir konfokal mikroskop örnek gözlemlemek ve görüntü: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) ve Hoechest33343 (405 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bilinmeyen nörojenik bölgeden aNSCs için kültür sistemi tanımlayan bu hücrelerin anlamak için beyin tamir 12 potansiyel kullanımını geliştirmek için gereklidir. Farklı gelişim evrelerindeki ya da farklı bölgelerde NSC'lerde farklı 3,4 davranır bilinmektedir. Son zamanlarda, bu SCZ türetilmiş hücreler SVZ türetilmiş hücreler 7-9 ile karşılaştırıldığında in vivo ve in vitro nöronal farklılaşma için farklı potansiyelleri sergilediği bildirilmiştir. Bu nedenle, tam olarak, her nörojenik bölgesini izole etmek için, SCz dahil beyin kesitleri, 1 mm'lik bir beyin matrisi (Şekil 1A) kullanılarak kesilmiştir. Büyüme faktörleri ile kültür 8 gün sonra, SCz türetilen aNSCs hücreler daha sonra (Şekil 1B) muhafaza edilebildiği Neurospheres oluşturabilir.
neurospheres içinde NSC'lerde bir alt kümesi spo olabileceğindenntaneously tek-tabakalı bir kültür sistemi, aynı zamanda SCZ-aNSCs nispeten homojendirler ve bakım için yararlı olan, 13 farklı. Büyüme faktörleri ve tripsin gibi ayrışma enzimleri kolayca neurosphere 14,15 derin içini nüfuz yok. Tek tabakalı kültürler NSC'lerde genişletilmesi için daha düzgün koşulları sağlar. Birincil neurospheres kaynaktan, SCZ-aNSCs bir sindirme tamponu işlem görmek suretiyle tek hücre halinde ayrıştırılmış. Bir günlük hücre ekim sonrasında, aNSCs kaplı plaka ve sergilenen hücre proliferasyonu (Şekil 2A) bağlanmıştır. çoğalma kendi gücünü teyit etmek için, BrdU ortamı içine ilave edildi. 2 saat boyunca BrdU ile inkübasyondan sonra, hücreler kolaylıkla SCZ-aNSCs etkin bir şekilde çoğalan ve önemli özelliklerini muhafaza belirten, bir anti-BrdU (proliferasyonu için bir belirteç) ve anti-Nestin antikorları (nöral kök hücreler için bir marker) ile boyanmıştır kök hücre (Şekil 2B). Bu duruma göre, bu Sergileme değildiGVÖK farklılaşmış (geçici yalıtım hücrelerinde tanımlanan) Dizi EGFR gibi hücreleri ve (neuroblasts olarak ifade edilmiştir) DCX (Şekil 2C) markerleri.
SCZ-aNSCs birden çok farklılaşma potansiyelini teyit etmek için, büyüme faktörleri kültür ortamından çıkarıldı. 6 gün sonra, hücreler, farklılaşmış hücreler, çeşitli vericiler ile boyama yapıldı. istihdam edildi farklı aNSCs ve yavrularıyla, belirteçleri nöronlar için (Tuj1), astrositler (GFAP) ve oligodendrositleri (O4) sergilemek; Bu hücre türleri SCZ-aNSCs gelen (Şekil 3) elde edildi.
Şekil 1: neurosphere SCZ bölgesi ve oluşumu izolasyonu. Yetişkin fare beyin SCZ bölgenin diseksiyon için (A) Prosedür. kültür SCZ-aN içinSC'ler, 8 haftalık fare beyin, beyin matrisi (1 mm aralıklarla) üzerine yerleştirilir. (Kırmızı kesikli çizgi ile gösterilen) kesilerek çıkarıldı SCZ bölgesi (bregma 2-3 mm) dahil, 1mM beyin dilimleri kesit sonra. (B) Neurosphere oluşumu. In vitro kültür, birincil neurospheres (geçit 0) sonra sekiz gün oluşan ve geçirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: tek tabakalı kültürü olarak SCZ-aNSCs bakımı. (A) kesitlere tohum hücreleri bir gün sonra, SCZ-aNSCs bağlı ve bir tek-tabakalı bir şekilde (sol) ve kaplama kabı üzerine yayılmıştır. Üç gün bakımdan sonra, SCZ-aNSCs sayısı (sağ) artmıştır. (B) BrdU (kırmızı, hücrelerin hızla çoğalan bir işaretleyici), Nestin (yeşil, nöral kök hücreler için bir belirteç) ve Hoechest33343 (mavi, çekirdekleri için bir belirteç) ile immüno. Nöral kök ile immün (C) / progenitör hücre belirteçleri Nestin (kırmızı, B tipi nöral kök hücreler için bir belirteç), EGFR (yeşil, C geçici yalıtım hücreler için bir belirteç), ve DCX (mavi, A tipi için bir belirteç Nöroblastlar). Çekirdekler Hoechest33343 (beyaz) ile zıt. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: SCZ-aNSCs gelen farklılaşmış hücrelerin immün. farklılaşma belirteçler Tuj1 (yeşil, olgunlaşmamış nöronlar için bir belirteç), O4 (kırmızı, oligodendrositlere için bir belirteç) ve GFAP ile immün (bağırmaow, astrositler için bir belirteç). Büyütülmüş görüntüleri insets olarak gösterilir. Hoechest33343 (mavi) karşı lekeleme çekirdekleri için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda erişkin fare SCZ gelen NSCs oluşturmak ve çeşitli uygulamalar için onları korumak için ayrıntılı bir protokol açıklar. SCZ-NSCs arındırmak ve genişletmek için gerekli in vitro kültür sistemi kurulması için üç kritik adımlar vardır. İlk olarak, SCZ bölgesi hassas diğer potansiyel nörojenik bölgeler (Şekil 1B) dışarı parçalara sağlamak için önemlidir. SCZ bölgeler içeren kalın ve hassas Bölümler 1 mm'lik aralıklı beyin matriksi ile elde edilmiştir, ve daha sonra ince bir iğne kortikal alan (Şekil 1A) arasında SCz mikro diseksiyon için kullanılmıştır. Olmayan NSC'lerde serebral korteks bitişik dokulardan, SCZ-aNSCs ile kültürlendiğinde, felaket ölümü olumsuz canlılığı ve SCZ-NSC'lerde 16-18,22 küresi oluşumunu olumsuz etkiler ortaya çıkar. kaudal SCZ (bregma 2-3 mm posterior) farklı SCZ-aNSCs üretmek için en iyi bölge olarak teyit edilmiştir. İkinci olarak, approphasat ve pasajlama adımda yaklaşımlarına yön enzimatik işlem hücrelerin yüksek verim elde etmek için kritiktir. Dispase II ve papain tripsin daha aNSCs izole etmek için daha etkili olmuştur. Ayrışma tamponu yerine tripsin ile geçiş için hücre ayrıştırma uygulanabilirliğini 19 arttırdı. Bir pipet ile mekanik ayrıştırma ve toz haline getirme en az düzeyde olmalıdır. Üçüncü olarak, bir hücre süzgecinden genel doku sindirilmesinden sonra selüler artığın ayrılması için primer kültür sistemlerinde kullanılır. Bununla birlikte, SCZ-aNSCs lokalizasyonu nedeniyle, bu hücreler enzim sindirimi ve mekanik toz haline getirilerek beyaz bir maddenin kırılması sonra elde edilir. bir hücre süzgeç ile süzme sırasında, hücreler önemli miktarda kayıp olur. Bu nedenle, bir hücre süzgeç kullanmadan SCZ-aNSCs kültürleme hücrelerin yüksek verim almak için daha iyi bir yoldur.
neurosphere kültürleri ve tek tabaka kültürleri hem NSC'lerde bakım, nöro bir sınırlama tatbik edilebilirkenküre kültür bölme rastgele toplanmış olabilir sonra tek NSC'lerde ayrışmış olmasıdır. neurospheres farklı boyutlarda agregasyon sonuçlanır. Bir neurosphere boyutu, belirli bir kritik değeri ulaştığında, neurosphere nedeniyle çekirdek 20 bir besin eksikliği, büyüme faktörleri, ve oksijen, heterojen bir yapı olarak büyür. Ayrıca, büyük boyutları ile Neurospheres kolayca ayrışma tamponu ile ayrışmış değildir ve daha düşük hücre canlılığı yol geniş mekanik toz haline getirildikten daha uzun enzimatik tedavi süreleri gerektirmektedir. Bu nedenle, tek tabakalı kültür sistemi birden geçitler SCZ-aNSCs korumak için tavsiye edilir. Bir tek tabakalı bir kültür sisteminde, aNSCs stabil bir şekilde bu ataları (tip C ve A) (Şekil 3A) olarak belirtilen hücre içine spontan farklılaşma olmadan NSC'lerde (B tipi) halinde korunur. SCZ-aNSCs uzun süre, bir tek tabaka olarak <a neurosphere formatında 5 pasajlar ve> 10 pasajlar için geçirildi. Bu eksilerinitek tabakalı kültür sistemi uzun vadeli kültürlerde 21 in vitro NSCs koruduğunu göstermektedir önceki sonuçları ile ısrarlı. Ancak, çoğalan hızı azalmış ve ölmekte olan hücrelerin bir kısmı 5 pasajlar üzerinde arttı. Genişletilmiş pasajlama multipotency ve artan kromozom sapması 22 nöron farklılaşmasını etkiler. Bu nedenle, uzun pasajlama etkilerini önlemek için, çoğalması ve farklılaşması analizi için erken geçiş (<geçit 5) hücreler kullanılması tavsiye edilir. SCZ-aNSCs kendini yenileme potansiyeli SVZ-aNSCs benzer olmasına rağmen, daha az nöronal farklılaşma SCZ-aNSCs 9'da gösterilmiştir.
SVZ'unda ve dentat girus (DG) de dahil olmak üzere, yetişkin beyin nörojenik bölgelerinden aNSCs izole edilmesi için yöntemler, 22 tespit edilmiştir. Bu protokoller izolasyonu ve in vitro aNSCs ekimi teşvik olmasına rağmen, bir çok sayıda elde etmek için çeşitli sınırlamalar vardırHücreler. Birçok protokolleri doğrama işlemi sırasında beyin dokusunun kaybına neden olabilir beyin dokusu helikopteri kullanmaktadır. nörojenik bölgelerden aNSCs izole edilmesi için diğer bir yaklaşım, bir neşter kullanarak beynine koronal kesim kullanır. Bu SVZ'unda mikro diseksiyon veya boyuna fissür 23 boyunca DG takip edilir. Diğer beyin bölgelerinin varlığı, diğer hücre tipleri, in vitro hücre canlılığı etkileyebilir ANSC kültür kirletmesine neden olabilir. Geçerli protokol ile, birçok farklı örnekler deney gruplarında çeşitli karşı kontrolleri de dahil olmak üzere, tek bir deneyde yönetilebilir. yüksek bir hücre verimi ile çeşitli beyin bölgelerinden NSC'lerde ulaşılması için izin verdiği de, bir beyin matrisi kullanarak dilimleme, bir beyin kesme aracı üstündür. Aynı zamanda, aynı beynin farklı bölgelerinde aNSCs karşılaştırılmasını sağlar.
endojen NSC'lerde Transplantasyon ve mühendislik considere olmuşturKök hücre tedavisi için olası stratejiler olarak, d. Bunun için, aNSCs özellikleri hakkında in vitro çalışmalar da kapsamlı araştırılmalıdır. Bu nedenle, bir in vitro kültür sistemi içinde iyi karakterize kurulması NSC'lerde uygulama ilerletmek için yararlı olacaktır. uygun koşullar altında kendini yenileme ve çoklu-soy farklılaşma ile kanıtlandığı gibi bu kültür sisteminde SCZ-aNSCs kök-hücre özellikleri, bakımlı bulundu. Bu nedenle, bu kültür sistemi, biyolojik çalışmalar ve terapötik uygulamalar için SCZ-aNSCs genişlemesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
