Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.
Vi presenterar två minimalt invasiva mikrokirurgisk teknik i gnagare för specifik läkemedelstillförsel i mellanörat så att den kan nå innerörat. Det första förfarandet består av perforering av trum bulla, benämnd bullostomy; den andra en är en transtympanic injektion. Båda efterlikna humana kliniska intratympanic förfaranden.
Kitosan-glycerofosfat (CGP) och Ringers Laktat buffert (RL) användes som biokompatibla fordon för lokal läkemedelstillförsel. CGP är en icke-toxisk biologiskt nedbrytbar polymer används allmänt i farmaceutiska tillämpningar. Det är en viskös vätska vid rt men det stelnar till ett halv fast fas vid kroppstemperatur. RL är en isoton lösning som används för intravenösa administreringar hos människor. En liten volym av detta fordon är exakt placerad på det runda fönstret (RW) nisch medelst en bullostomy. En transtympanic injektion fyller mellanörat och ger mindre kontroll men bredare tillgång till innerörat.
<p class = "jove_content"> Säkerhetsprofilerna för båda teknikerna studerades och jämfördes med användning av funktionella och morfologiska tester. Hörsel utvärderades genom att registrera Auditory hjärnstammen svar (ABR) före och flera gånger efter mikro. Den cytoarchitecture och bevarande nivå cochlea strukturer studerades med konventionella histologiska tekniker i paraformaldehydfixerade och urkalkade cochlea prover. Parallellt var ofixerade cochlea prover och frystes omedelbart att analysera genuttrycksprofilerna av inflammatoriska markörer genom kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR).Båda förfarandena är lämpliga som läkemedelsleveransmetoder i musen mellanörat, även om transtympanic injektion visade sig vara mindre invasiva jämfört med bullostomy.
Hörselnedsättning är den vanligaste mänskliga sensorisk underskott och drabbar 5,3% av befolkningen i världen, och 30% av personer över 65 års ålder ( http://www.who.int/topics/deafness/en , uppdaterad 2016). Hörselnedsättning påverkar språkinlärning hos barn och accelererar kognitiv försämring hos äldre människor. Därför är det en betydande hälsovårdsproblem med en enorm socioekonomiska effekterna. Det kan orsakas av genetiska defekter, miljöfaktorer eller en kombination av båda 1, vilket i slutändan inducera skador och död av hårceller och neuroner i snäckan. Dessa celler inte regenerera i däggdjur, därför inte kan vändas cellförlust och samtidig hörselnedsättning. Kliniska alternativ baseras på proteser, inklusive hörapparater och cochlea, mellanörat och benledning implantat 2. Tyvärr finns det ingen specifik medicinsk reparativ treatments för hörselskada och därmed flera forskningslinjer är inriktade på utveckling av förebyggande och reparativa terapier. Nya behandlingsalternativ inkluderar gen- och cellterapi samt utveckling av små molekyler för farmakologisk behandling 2.
En av de viktigaste utmaningarna i cochlea farmakologisk terapi är drug delivery. Systemiska behandlingar har begränsad effekt i snäckan på grund av blod-labyrint barriär 3, kontinuerlig endotel i kontakt med cochlea blodkärl, som fungerar som en fysisk och biokemisk barriär för att bibehålla innerörat fluid homeostasis, därför begränsar läkemedelspassage till innerörat. Det är genomträngligt endast för små fettlösliga molekyler, även om permeabiliteten kan höjas under cochlear inflammation, och även med användning av diuretika eller osmotiska medel. Ut mängden läkemedel som så småningom når snäckan efter systemisk administrering reduceras;Därför är höga doser som kan orsaka ekologisk toxicitet krävs. Dessutom kan levermetabolism av läkemedlet ge upphov till toxiska eller inaktiva metaboliter 4, 5, 6, 7. I kontrast, lokala interventioner tillåta placering av en känd begränsad mängd av läkemedlet i mitten eller innerörat utan oönskade biverkningar 4, 7, 8, 9. I nuvarande klinisk praxis, är intratympanic förvaltningar begränsade till vissa hörsel patologier, såsom gentamicin i Ménières sjukdom 10, kortikosteroider i plötslig dövhet, Ménières sjukdom, immunmedierad och buller hörselnedsättning, 11, 12, 13, en4, 15 och insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF1) i plötslig dövhet 4, 16, 17.
Formuleringar för lokal administrering bör bevara den känsliga homeostas (pH och osmolaritet) av cochlea vätskor. Dessutom är det mycket viktigt för att upprätthålla sterilitet under hela processen för att undvika bakteriell kontaminering av cerebrospinalvätskan. Hjälpämnet som används för läkemedelsadministrering bör vara biokompatibla, icke-ototoxisk och lämplig konsistens. Flytande lösningar rekommenderas för intracochlear injektioner, men är inte lämpliga för den intratympanic vägen på grund av spelrummet genom örontrumpeten. I detta fall, är droger vanligen bärs av halvfasta geler för att öka deras beständighet i mellanörat 4, 18, 19. Alternativ leverans systems som används som bärare för att öka passagen av läkemedlet till innerörat är nanopartiklar 20 och adenovirus 21 Här jämförde vi två fordon: CGP och en RL-lösning. CGP är en hydrogel som bildas av chitosan, en linjär polysackarid som består av D-glukosamin och N-acetyl-D-glukosamin som erhålls från kräftdjursskal, och β-glycerofosfat, en polyol som bildar en sköld vattnet runt kitosan kedjorna och bibehåller den i flytande form. CGP är termokänslig och kan brytas ned av lysozymer, som tillåter en fördröjd frisättning av läkemedel i mellanörat 22, 23, 24, 25. Chitosan-bas hydrogeler är lämpliga vehiklar för kliniska tillämpningar såsom tillförsel av läkemedel på grund av deras brist på immunogenicitet och brist på aktivering av lokala inflammatoriska reaktioner 23, 24. På othER sidan är RL-buffert en icke-pyrogent isoton lösning (273 mOsm / L och pH 6,5) avsedd för intravenös användning i människor som en källa av vatten och elektrolyter, speciellt i blodförlust, trauma eller brännskador på grund av att biprodukter av laktat metabolism i levern motverka acidos.
Här beskriver vi och jämföra två kirurgiska metoder som har förfinats för lokal läkemedelstillförsel till musen innerörat. Säkerhetsprofilen för båda teknikerna utvärderades med hjälp av funktionella, morfologiska och molekylära tester. Höra utvärderades med hjälp av Auditory hjärnstammen svar (ABR) 26, 27 utförs före och efter mikro vid olika tidpunkter. Slutpunkts procedurer användes för att dissekera snäckan och jämföra anatomiska, cell- och molekylär effekten av dessa två mikro förfaranden.
Lokal läkemedelstillförsel till innerörat kan göras direkt genom intracochlear injektion eller indirekt genom intratympanic administrering, placera läkemedlet i mellanörat 4, 19, 39. Intracochlear administration ger kontrollerad och exakt läkemedelstillförsel till snäckan, undvika diffusion genom fönstermembran, basal till apikala koncentrationsgradienter och klarering genom örontrumpeten. Men det är oftast en mycket invasiv procedur som kräver en komplicerad och känslig mikro 7, 39. I detta sammanhang är industrin att utveckla nya, överdragna, implanterbara anordningar för fördröjd frisättning av läkemedel 40, 41. Å andra sidan, är intratympanic administrering en minimalt invasiv och lätt att utföra förfarandet som möjliggör injektion av större volymer av den dmatta in i mellanörat, även om farmakokinetiken är inte lätt att kontrollera. Majoriteten av läkemedlet försvinner genom örontrumpeten och den återstående fraktionen måste diffundera genom RW membranet för att nå snäckan 18. RW är platsen för maximal absorption av ämnen från mellanörat i perilymfa fyllda trumkanal cochlea 7. Det är ett semipermeabelt treskiktsstruktur, även om dess permeabilitet beror på läkemedelsegenskaper (storlek, koncentration, löslighet och elektrisk laddning) och trans transportsystem (diffusion, aktiv transport eller fagocytos) 42. Ovala fönstret och öron kapslar är alternativa men mindre effektiva ingångar till cochlea 43, 44.
Här kan vi visa och jämföra två mikro metoder för riktad läkemedelstillförsel i musen mellanörat: bullostomy och transtympainjektion nic förfaranden. Vanliga kritiska steg till dessa förfaranden inkluderar: i) en utvärdering av utfrågning före och efter mikrokirurgi, ii) framställning av en homogen fordon lösning under sterila förhållanden, iii) noggrann övervakning av anestesiproceduren och övervakning av djurkroppstemperatur och konstanter, iv ) långsam placering av lämplig volym av fordon med inriktning på RW, och iv) att ta cochlea prover för att slutföra molekylär och morfologisk analys.
Retroauricular och ventrala metoder för bullostomy har beskrivits 7, 45. Vi använde den ventrala approximation eftersom vår erfarenhet har resulterat i mindre sjuklighet och gav bättre tillgång till RW 46. Transtympanic injektioner genomförs vanligen genom pars Tensa trumhinnans, anteriort eller posteriort malleus manubrium 12. Idetta arbete har vi utfört en modifiering av den teknik, en injektion genom pars flaccida bortom malleus med en tidigare extra punktering av pars Tensa att tillåta luftevakuering under injektion.
Den transtympanic injektion var mindre invasiv än bullostomy, trots att båda microsurgeries var snabb (20 och 5 minuter per öra för bullostomy och transtympanic tillvägagångssätt respektive), med korta postoperativa återhämtning gånger och ingen sjuklighet. Viktigast av allt, upprätthålls både förfaranden förhör och de ABR parametrar var identiska med de bestämmas före mikrokirurgi. Den transtympanic strategi tar mindre tid än bullostomy och kan utföras i båda öronen hos samma djur under samma ingrepp. Fördelar med transtympanic injektion är således att den kan utföras bilateralt och upprepas, om så erfordras. Å andra sidan, erbjuder bullostomy direkt visuell tillgång till RW membranet och tillåter Filling av RW nisch. Däremot inte transtympanic injektion inte tillåter kontroll av fordonets placering i RW nisch.
De förfaranden som redovisas i detta arbete beskriver hur man utför en lokal läkemedels fordon leverans till mellanörat för pre-kliniska tillämpningar såsom utvärdering av ototoxicitet och utvärdering av effekten i hörselnedsättning. Två mikrokirurgi förfaranden beskrivs som ger alternativa metoder med specifika fördelar och nackdelar. Både bevara hörsel och inte orsakar morfologiska förändringar. Lokal inflammation beskrivs som en potentiell komplikation av bullostomy. En uppsättning av kompletterande metoder beskrivs också för postkirurgiska förfaranden, inklusive hörsel, morfologiska och inflammatoriska markör uttryck utvärderingar. Framtida tillämpningar för dessa tekniker är den prekliniska utvärderingen av nya terapier för hörselnedsättning, inklusive genetiska, cellulära och farmakologiska metoder, i djurmodeller. Intratympanic administratjoner säkerställa leverans av behandling i mellanörat, i kontakt med den runda fönstermembranet, vilket underlättar passage in i perilymfa utan uppenbar cochlea skada.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka genomik och Noninvasiv Neurofunctional Utvärderingsmekanismer (IIBM, CSIC-UAM) för deras tekniska support. Detta arbete har finansierats med bidrag från den spanska "Ministerio de Economía y Competitividad" (ERUF-SAF2014-53979-R) och Europeiska unionen (FP7-AFHELO och FP7-PEOPLE-TARGEAR) till IVN.
Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
Water pump | Gaymar | # TP472 | |
Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
Statistics software (SPSS) | IBM | ||
Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer |
Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour. |
Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
Pividone iodine based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
Microlance 27G | Becton Dickinson | # 302200 | |
Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
Catheter (Microfil 34G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |