Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.
Vi præsenterer to minimalt invasive mikrokirurgiske teknikker i gnavere til specifik lægemiddeltilførsel ind i mellemøret, således at den kan nå det indre øre. Den første procedure består af perforation af trommehinden bulla, betegnet bullostomy; den anden er en transtympanic injektion. Begge emulere humane kliniske intratympanic procedurer.
Chitosan-glycerophosphat (CGP) og Ringers laktat puffer (RL) blev anvendt som biokompatible vehikler til lokal lægemiddeladministration. CGP er en ikke-toksisk bionedbrydelig polymer i vid udstrækning anvendes i farmaceutiske anvendelser. Det er en viskos væske ved stuetemperatur, men det størkner til en semi fast fase ved legemstemperatur. RL er en isotonisk opløsning, der anvendes til intravenøse administrationer i mennesker. En lille volumen af dette køretøj er præcist placeret på det runde vindues (RW) niche ved hjælp af en bullostomy. En transtympanic injektion fylder mellemøret og tillader mindre kontrol, men bredere adgang til det indre øre.
<p class = "jove_content"> Sikkerhedsprofilerne for begge teknikker blev undersøgt og sammenlignet ved hjælp af funktionelle og morfologiske tests. Hearing blev evalueret ved at registrere de auditive hjernestammen Response (ABR) før og flere gange efter mikrokirurgi. Den cytoarchitecture og bevarelse niveau af cochleære strukturer blev undersøgt ved traditionelle histologiske teknikker i paraformaldehyd-fikserede og afkalkede cochleære prøver. Sideløbende hermed blev ufikserede cochleære prøver udtaget og straks frosset til analyse genekspressionsprofiler af inflammatoriske markører ved kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR).Begge procedurer er egnede som lægemiddelafgivelsessystemer metoder i musen mellemøret, selvom transtympanic injektion viste sig at være mindre invasiv end bullostomy.
Nedsat hørelse er den hyppigste menneskelige sensoriske underskud og påvirker 5,3% af den samlede befolkning i verden, og 30% af personer over 65 år ( http://www.who.int/topics/deafness/en , opdateret 2016). Høretab påvirker sprogtilegnelse hos børn og accelererer kognitiv tilbagegang hos ældre mennesker. Derfor er det en betydelig sundhedspleje problem med en enorm samfundsøkonomiske konsekvenser. Det kan være forårsaget af genetiske defekter, miljømæssige faktorer eller en kombination af begge 1, som i sidste ende inducere skade og død hårceller og neuroner i cochlea. Disse celler ikke regenerere i pattedyr, derfor cellulære tab og samtidig høretab kan ikke vendes. Kliniske muligheder er baseret på proteser, herunder høreapparater og cochlear, mellemøret og knogle ledningsforstyrrelser implantater 2. Desværre er der ingen specifik medicinsk genoprettende skatments til nedsat hørelse og dermed flere forskningsprojekter linjer er fokuseret på udviklingen af forebyggende og reparative behandlinger. Nye terapeutiske muligheder omfatter gen- og celleterapi samt udvikling af små molekyler for farmakologisk terapi 2.
En af de vigtigste udfordringer i cochlear farmakologisk terapi er drug delivery. Systemiske behandlinger har begrænset virkningsfuldhed i cochlea grund af blod-labyrint barriere 3, kontinuerlig endotel i kontakt med cochlear blodkar, der fungerer som en fysisk og biokemisk barriere for at opretholde indre øre fluid homeostase, derfor begrænse drug passage til det indre øre. Det er permeabel kun små fedtopløselige molekyler, selv om der kan forøget permeabilitet under cochlear inflammation, og også med anvendelsen af diuretika eller osmotiske midler. Volumenet af lægemiddel, der når til sidst cochlea efter systemisk administration er reduceret;Derfor er høje doser, der kan forårsage økologiske toksicitet påkrævet. Desuden kan hepatisk metabolisme af lægemidlet toksisk eller inaktive metabolitter 4, 5, 6, 7. I modsætning hertil lokale interventioner tillade placering af en kendt begrænset mængde af lægemidlet i midten eller indre øre uden uønskede bivirkninger 4, 7, 8, 9. I nuværende klinisk praksis, er intratympanic forvaltninger begrænset til bestemte cochlear patologier, såsom gentamicin i Menières sygdom 10, kortikosteroider i pludselig døvhed, Menières sygdom, immun-medieret og støj høretab, 11, 12, 13, 14, 15 og insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF1) i pludselig døvhed 4, 16, 17.
Formuleringer til lokal administration bør bevare den fine homeostase (pH og osmolaritet) af cochlear væsker. Desuden er det meget vigtigt at opretholde sterilitet under hele processen for at undgå bakteriel forurening af cerebrospinalvæsken. Excipiensen anvendes til lægemiddelafgivelse skal være biokompatible, nonototoxic og af den passende konsistens. Flydende opløsninger anbefales til intracochlear injektioner, men er ikke egnede til den intratympanic rute på grund af clearance gennem det eustakiske rør. I dette tilfælde er lægemidler sædvanligvis båret af halvfaste geler til at øge deres bestandighed i mellemøret 4, 18, 19. Alternativ levering systems anvendt som bærere til at forøge passagen af lægemidlet til det indre øre er nanopartikler 20 og adenovira 21 Her vi sammenlignet to køretøjer: CGP og en RL-opløsning. CGP er en hydrogel dannet ved chitosan, et lineært polysaccharid sammensat af D-glucosamin og N-acetyl-D-glucosamin opnået fra skaldyrsskaller og β-glycerophosphat, en polyol, der danner et skjold af vand omkring chitosankæder og fastholder det i flydende form. CGP er varmefølsomt og kan nedbrydes af lysozymer, tillader en langvarig lægemiddelfrigivelse i mellemøret 22, 23, 24, 25. Chitosan-base hydrogeler er egnede vehikler til kliniske anvendelser, såsom lægemiddelafgivelse på grund af deres manglende immunogenicitet og manglende aktivering af lokale inflammatoriske reaktioner 23, 24. På othER hånd, RL-buffer er en ikke-pyrogen isotonisk opløsning (273 mOsm / l og pH 6,5) beregnet til intravenøs indgivelse til mennesker som en kilde til vand og elektrolytter, især i blodtab, traumer eller brandskader fordi biprodukter af lactat metabolisme i leveren modvirke acidose.
Her beskriver vi og sammenligne to kirurgiske metoder, der er blevet raffineret til lokal lægemiddeltilførsel til musen indre øre. Sikkerhedsprofilen for begge teknikker blev vurderet ved anvendelse af funktionelle, morfologiske og molekylære test. Hearing blev evalueret under anvendelse Auditory hjernestammen Response (ABR) 26, 27 udført før og efter mikrokirurgi på forskellige tidspunkter. End-point procedurer blev anvendt til at dissekere cochlea og sammenligne de anatomiske, cellulære og molekylære virkninger af disse to mikrokirurgiske procedurer.
Lokal lægemiddeltilførsel til det indre øre kan udføres direkte ved intracochlear injektion eller indirekte af intratympanic administration, anbringelse lægemidlet i mellemøret 4, 19, 39. Intracochlear administration giver kontrolleret og præcis lægemiddeladministration til cochlea, undgå diffusion gennem vinduet membraner, basal-til-apikale koncentrationsgradienter og afregnes gennem det eustakiske rør. Det er imidlertid sædvanligvis som en meget invasiv procedure, der kræver en kompliceret og vanskelig mikrokirurgi 7, 39. I denne forbindelse er industrien at udvikle nye, overtrukne, implanterbare indretninger til vedvarende lægemiddelfrigivelse 40, 41. På den anden side, intratympanic administration er en minimalt invasiv og let at udføre procedure, som giver injektionen af større volumener af dtæppe ind i mellemøret, selvom farmakokinetikken er ikke let at kontrollere. Størstedelen af lægemidlet clearet gennem eustakiske rør og den resterende fraktion har at diffundere gennem RW membranen for at nå cochlea 18. RW er stedet for maksimal absorption af stoffer fra mellemøret til perilymfe fyldt tympaniske kanal af cochlea 7. Det er en semipermeabel tre lag struktur, selv om dens permeabilitet afhænger af narkotika egenskaber (størrelse, koncentration, opløselighed og elektrisk gebyr) og på transmembrane transportsystemer (diffusion, aktiv transport eller fagocytose) 42. Den ovale vindue og otiske kapsler er alternative, men mindre effektive indgange til cochlea 43, 44.
Her demonstrerer og sammenligne to mikrokirurgiske metoder til målrettet medicinafgivelse i musen mellemøret vi: bullostomy og transtympanic injektion procedurer. Fælles kritiske trin til disse procedurer omfatter: i) en evaluering af retsmøde før og efter mikrokirurgi, ii) udarbejdelse af en homogen køretøj løsning under sterile forhold, iii) nøje overvågning af anæstesiproceduren og overvågning af dyr kropstemperaturen og konstanter, iv ) langsom placering af det passende volumen af vehikel målretning RW, og iv) at tage cochleære prøver at fuldføre molekylære og morfologisk analyse.
Retroauricular og ventrale tilgange til bullostomy er blevet beskrevet 7, 45. Vi brugte den ventrale tilnærmelse fordi vores erfaring det har resulteret i mindre sygelighed og forudsat bedre adgang til RW 46. Transtympanic injektioner er normalt udføres gennem pars Tensa af trommehinden, forreste eller bagerste til malleus manubrium 12. Idette arbejde udførte vi en modifikation af teknikken, en injektion gennem pars flaccida ud over malleus med en tidligere supplerende punktur af pars Tensa at tillade luft evakuering under indsprøjtning.
Den transtympanic injektion var mindre invasiv end bullostomy, selv om begge microsurgeries var hurtig (20 og 5 min pr øre for bullostomy og transtympanic tilgang henholdsvis), med korte postoperative rekreation gange og ingen sygelighed. Vigtigst fastholdt begge procedurer hørelse og ABR parametre var identiske med dem, fastlægges inden mikrokirurgi. Den transtympanic tilgang tager mindre tid end bullostomy og kan udføres i begge ører af det samme dyr i samme intervention. Fordele ved transtympanic injektion er således at den kan udføres bilateralt og gentages, hvis det kræves. På den anden side, bullostomy giver direkte visuel adgang til RW membranen og tillader Filling af RW niche. Derimod finder transtympanic injektion ikke mulighed for styring af køretøjets placering i RW niche.
Procedurerne er rapporteret i dette arbejde beskriver, hvordan du udfører en lokal stof køretøj levering til mellemøret for prækliniske programmer såsom vurdering af ototoksicitet og evaluering af effekt i høretab. To mikrokirurgi procedurer beskrevet, at give alternative metoder med særlige fordele og ulemper. Både bevare hørelse og ikke forårsager morfologiske ændringer. Lokal inflammation er beskrevet som en potentiel komplikation ved bullostomy. Et sæt af komplementære teknikker er også beskrevet for postkirurgiske procedurer, herunder hørelse, morfologiske og inflammatoriske markør udtryk evalueringer. Fremtidige anvendelser for disse teknikker omfatter den prækliniske evaluering af nye terapier for høretab, herunder genetiske, cellulære og farmakologiske tilgange, i dyremodeller. Intratympanic administrationer sikre leveringen af behandlingen i mellemøret, i kontakt med det runde vindues membran, lette passage ind i perilymfe uden indlysende cochlear skade.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke Genomics og Noninvasiv neurofunktionelle Evalueringsfaciliteter (IIBM CSIC-UAM) for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den spanske "Ministerio de Economia y Competitividad" (EFRU-SAF2014-53979-R) og Den Europæiske Union (FP7-AFHELO og FP7-PEOPLE-TARGEAR) til IVN.
Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
Water pump | Gaymar | # TP472 | |
Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
Statistics software (SPSS) | IBM | ||
Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer |
Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour. |
Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
Pividone iodine based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
Microlance 27G | Becton Dickinson | # 302200 | |
Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
Catheter (Microfil 34G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |