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Biology

Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy doi: 10.3791/54951 Published: March 8, 2017
* These authors contributed equally

Abstract

Wir präsentieren zwei minimalinvasive mikrochirurgische Techniken in Nagetieren für bestimmte Arzneimittelabgabe in das Mittelohr, so dass sie das Innenohr erreichen kann. Das erste Verfahren besteht aus Perforation des Trommelfells Bulla, bullostomy bezeichnet; die zweite ist eine transtympanale Injektion. Beide emulieren menschliche klinische intratympanic Verfahren.

Chitosan-Glycerophosphat (CGP) und Ringers Lactat-Puffer (RL) als biokompatible Vehikel für lokale Arzneimittelabgabe verwendet. CGP ist ein nicht-toxisches bioabbaubaren Polymer weitgehend in pharmazeutischen Anwendungen eingesetzt. Es ist eine viskose Flüssigkeit bei RT aber es erstarrt zu einer halbfesten Phase bei Körpertemperatur. RL ist eine isotonische Lösung zur intravenösen Verabreichungen beim Menschen eingesetzt. Ein kleines Volumen dieses Fahrzeug auf das runde Fenster (RW) Nische mittels eines bullostomy genau platziert. Eine transtympanale Injektion füllt das Mittelohr und ermöglicht es weniger Kontrolle, aber einen breiteren Zugang zum Innenohr.

Beide Verfahren eignen sich als Drug-Delivery-Methoden in die Maus Mittelohr, obwohl transtympanale Injektion erwies sich als weniger invasive im Vergleich zu bullostomy.

Introduction

Schwerhörigkeit ist die häufigste menschliche sensorische Defizit und wirkt sich 5,3% der Weltbevölkerung und 30% der Personen im Alter von über 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en , aktualisiert 2016). Hörverlust wirkt sich Spracherwerb bei Kindern und beschleunigt kognitiven Verfall bei älteren Menschen. Daher ist es ein bedeutendes Gesundheitsproblem mit einer enormen sozioökonomischen Auswirkungen. Es kann durch genetische Defekte, Umweltfaktoren oder einer Kombination von beiden 1, die in dem Ende induzieren Schäden und Tod von Haarzellen und Neuronen in der Cochlea verursacht werden. Diese Zellen nicht regenerieren bei Säugetieren, also Zellverlust und damit einhergehende Verlust der Hörfähigkeit kann nicht rückgängig gemacht werden. Klinische Optionen basieren auf Prothesen, einschließlich Hörgeräte und Cochlea, Mittelohr und Knochenleitungsimplantate 2. Leider gibt es keine spezifische medizinische Restaurations treatments für Hörschäden und damit mehrere Forschungslinien werden auf der Entwicklung von präventiven und reparative Therapien konzentriert. Neue Therapieoptionen umfassen Gen- und Zelltherapien sowie die Entwicklung von kleinen Molekülen für die pharmakologische Therapie 2.

Eine der wichtigsten Herausforderungen im Bereich der Cochlea pharmakologische Therapie Arzneimittelabgabe. Systemische Behandlungen haben Wirksamkeit in der Cochlea durch die Blut-Labyrinthsperre 3, kontinuierliches Endothel in Kontakt mit Cochlea Blutgefäße beschränkt, die als eine physikalische und biochemische Barriere wirkt Innenohrflüssigkeit Homöostase aufrechtzuerhalten, daher Arzneimitteldurchgang zum Innenohr zu begrenzen. Es ist durchlässig nur für kleine Moleküle liposoluble, obwohl Durchlässigkeit kann mit der Verwendung von Diuretika oder osmotische Mittel während Cochlea Entzündung und auch erhöht werden. Das Volumen der Droge, die schließlich die Cochlea erreicht, nachdem die systemische Verabreichung reduziert wird;daher hohe Dosen, die organische Toxizität verursachen könnten, sind erforderlich. Zusätzlich kann hepatischen Metabolisierung des Arzneimittels produzieren toxische oder inaktiven Metaboliten 4, 5, 6, 7. Im Gegensatz dazu erlauben lokalen Eingriffen die Anordnung einer bekannten beschränkten Menge des Arzneimittels in das Mittel- oder Innenohr ohne unerwünschte Nebenwirkungen , 4, 7, 8, 9. In der gegenwärtigen klinischen Praxis werden intratympanic Verwaltungen auf bestimmte Cochlea Krankheiten beschränkt, wie Gentamicin in 10 Morbus Menière, Kortikosteroiden bei Hörsturz, Morbus Menière, immunvermittelte und Lärm verursachte Schwerhörigkeit, 11, 12, 13, 14, 15 und insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF1) in Hörsturz 4, 16, 17.

Formulierungen für die lokale Verabreichung sollte die empfindliche Homöostase (pH-Wert und Osmolarität) von Cochlea-Flüssigkeiten erhalten. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, die Sterilität während des gesamten Prozesses aufrechterhalten bakterielle Kontamination der Cerebrospinalflüssigkeit zu vermeiden. Der Träger für Arzneimittelabgabe verwendet wird, sollte biokompatibel, nonototoxic und der geeigneten Konsistenz sein. Flüssige Lösungen sind für intracochleärer Injektionen empfohlen, sind aber nicht geeignet für die intratympanic Strecke aufgrund der Freigabe durch die Eustachische Röhre. In diesem Fall werden die Medikamente in der Regel durch halbfeste Gele trugen ihre Dauerhaftigkeit im Mittelohr zu erhöhen 4, 18, 19. Alternative Liefer Systems als Träger verwendet , um den Durchgang des Medikaments an das Innenohr zu erhöhen , sind Nanopartikel 20 und Adenoviren 21 Hier verglichen wir zwei Fahrzeuge: CGP und eine RL - Lösung. CGP ein Hydrogel von Chitosan gebildet werden, ein lineares Polysaccharid, bestehend aus D-Glucosamin und N-Acetyl-D-Glucosamin aus Krustentierschalen erhalten werden, und β-Glycerophosphat, einem Polyol, das eine Abschirmung von Wasser um die Chitosanketten bildet und unterhält sie in flüssiger Form. CGP ist thermosensitiv und kann durch Lysozym abgebaut werden, um eine verzögerte Wirkstofffreisetzung im Mittelohr ermöglicht 22, 23, 24, 25. Chitosan-Basis Hydrogele sind geeignete Vehikel für klinische Anwendungen wie Arzneimittelabgabe aufgrund ihrer fehlenden Immunogenität und mangelnde Aktivierung der lokalen Entzündungsreaktionen 23, 24. Auf der other Seits ist RL-Puffer ein nicht-pyrogenes isotonischen Lösung (273 mOsm / l und pH 6,5), die zur intravenösen Verabreichung an Menschen als eine Quelle von Wasser und Elektrolyten, insbesondere in Blutverlust, Trauma oder Brandverletzungen, da die Nebenprodukte der Lactat-Stoffwechsel in der Leber entgegenzuwirken Azidose.

Hier beschreiben wir, und zwei Operationsmethoden zu vergleichen, die für die lokale Arzneimittelabgabe an die Maus Innenohr verfeinert wurden. Das Sicherheitsprofil beider Techniken wurde unter Verwendung von funktionellen, morphologischen und molekularen Tests ausgewertet. Mit Hirnstammaudiometrie (ABR) wurde Hearing 26 ausgewertet, 27 vor und nach Mikrochirurgie zu unterschiedlichen Zeiten. End-Punkt-Verfahren wurden verwendet, um die Cochlea und vergleichen Sie die anatomischen, zellulären und molekularen Auswirkungen dieser beiden mikrochirurgische Eingriffe zu sezieren.

Protocol

Stellen Sie sicher, dass die Behandlung der Tiere Verfahren in Übereinstimmung mit den internationalen und nationalen Vorschriften. Das Protokoll folgt der Europäischen Gemeinschaft 2010/63 / EU und der spanischen RD 53/2013 Leitlinien sind.

1. Allgemeine Tierbehandlung

  1. Feed - Mäuse ad libitum mit einer Standarddiät und Trinkwasser. Kontrolle der Gesundheit und Wohlbefinden durch folgende Föderation für Labortierkunde Verbände (FELASA) Empfehlungen.

2. Anhörung Bewertung

HINWEIS: Track funktionelle Auswirkungen der mikrochirurgische Eingriffe durch Testen Anhörung vor und oft nach der Operation (in dieser Arbeit 2, 7, 14 und 28 d postmicrosurgery) mit nicht-invasive Verfahren wie ABR 9.

  1. Für den Test ABR, betäuben Mäuse mit kurzer Dauer Wirkung Protokolle dh intraperitoneale Injektion von Ketamin (100 mg / kg Körpergewicht (KG) und Xylazin (10mg / kg, BW). Alternativ führen Tests unter Inhalationsanästhesie zu hören.
    HINWEIS: Da ABR - Parameter durch den Anästhetikum Protokoll 28 beeinflusst werden kann, das gleiche während des gesamten Experiments verwendet werden .
  2. Schauen Sie sich die Tiefe der Anästhesie durch den Zehen Prise Reflex zu testen.
    HINWEIS: Wenn der Rückzug Reflex verschwindet, hat das Tier eine angemessene Narkosetiefe erreicht Gehörtests durchzuführen.
  3. Schützen die Augen von Desikkation und sekundären Keratoconjunctivitis sicca durch topische Verabreichung von Tränenergänzungsmittel, wie Hydroxypropylmethylcellulose basierenden Gelen.
  4. Halten Sie die Maus bei physiologischer Temperatur (37,5-38 ° C) während des gesamten Verfahrens. Zur Vermeidung von elektrischen Störungen, verwenden Sie eine warme Wasserpumpe und Wärmflaschen. Überwachen Sie die Körpertemperatur mit rektalen Sonden. Immer darauf achten, dass das Tier zu überhitzen.
    HINWEIS: Wir empfehlen, das Heizkissen mit einem Flächendesinfektionsmittel zwischen Mäusen zu reinigen.0; Zur Anästhesie Ein- und Ausleitung, elektrische Heizkissen, Glühlampen oder Infrarot-Licht verwendet werden.
  5. ABR Verfahren
    HINWEIS: Für ABR Registrierung verwenden, um eine Computer-Workstation mit einer nach innen gerichteten Soundkarte Wellenformen zu erzeugen (Digital-Analog-DA-Ausgang, Umwandlung) und elektrische Antwortwellenformen digitalisieren (analog zu digital, AD-Eingang), ein Dämpfungsglied, ein Oszilloskop und ein niederohmigen Verstärker. Moderne auditorischen Workstations (dh Tucker Davis Techonologies) umfassen alle diese Komponenten in einem einzigen kompakten System.
    1. Legen Sie die narkotisierten Maus in Bauchlage auf den Heizkissen in einem schalldämpfenden Kammer zu vermeiden , Umgebungsgeräusche Störungen und Nachhall (Abbildung 1).
    2. Liefern akustische Reize in den äußeren Gehörgang. Verwenden Sie voreingestellte Stimuli oder neue Signale mit der entsprechenden Software entwickelt. Schließen Sie den DA-Workstation auf den ausgewählten Lautsprecher.
      HINWEIS: FreE-Feld oder geschlossenen Bereich in den äußeren Gehörgang eingeführt Lautsprecher verwendet werden könnten. Die ersteren sind bevorzugt, wenn sie mit Mäusen arbeiten wegen der Schwierigkeit in der Sonde Einsetzen und Schallkalibrierungs in geschlossenen Systemen. Freifeld-Lautsprecher beide Ohren zu stimulieren und eine binaurale Antwort hervorrufen. Zur Erzielung überwiegend Mono - Antworten mit Freifeld - Lautsprecher, hat kontralateralen Aktivität durch Okklusion beseitigt werden (dh mit Ohrstöpsel) oder durch den Lärm maskieren.
      1. Platzieren Freifeldlautsprecher in einem festen Abstand (in der Regel 5 bis 20 cm) mit Blick auf den Kopf oder ausgewählte Ohr mit der Mitte des Lautsprechers mit dem äußeren Gehörgang ausgerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass keine Hindernisse zwischen dem Lautsprecher und dem Ohr, und dass die Ohrmuschel vollständig geöffnet wird.
    3. Platzieren Edelstahl subdermal Nadelelektroden wie folgt: i) die aktive (positive) Elektrode in die Kopfhaut zwischen den Ohren (über dem Scheitel des Schädels), ii) die Referenz (negative) Elektrode, in der GlandulaBereich unterhalb der Ohrmuschel und iii) die Erdungselektrode in der Rückseite, Schwanz oder Hinterbeinbereich (Abbildung 1).
      1. Überprüfen Sie die elektrische Impedanz in den positiven und negativen Elektroden. Stellen Sie sicher, dass die Impedanz weniger als 3 kOhm (idealerweise 1 kOhm). Wenn sie höher ist, neu zu positionieren, mit Alkohol reinigen oder die Elektroden ersetzen.
    4. Für ABR - Aufzeichnung, erzeugen Breitband Klicks und reine Tonfrequenzen und Gegenwart bei Intensitäten 90 bis 10 dB in Bezug auf den Schalldruckpegel (SPL) in 5-10 dB SPL abnehm Schritte 27, 29, 30.
      1. Anwesend kurzen Klick oder Ton - Burst Stimuli (1-5 ms) mit hohem Pegel beginnen (dh 80 oder 90 dB SPL) und die Verringerung der Intensität in 5-10 dB SPL Schritten. Registrieren Sie die elektrische Reaktion in den ersten 10 ms nach der Stimulation (evozierte ABR Antworten erscheinen bei 6-8 ms).
        HINWEIS: Aus diesem Grund Stimulationsratensollte nicht höher als 50 Impulse / s (normal 20-50).
    5. Amplify, aufzeichnen und im Durchschnitt die hervorgerufene elektrische Antwort auf jeden Reiz und Intensität. Verwenden Sie einen Verstärker mit geringem Rauschen und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, und verbinden Sie es mit dem D-Eingang.
      HINWEIS: ABRs haben sehr niedrige Amplituden, die typischerweise unter 1 & mgr; V (peak-to-peak) und muss einen Verstärker mit sehr geringem Rauschen aufgezeichnet werden. In normalem Gehör Mäuse entstehen klare ABR Wellen nach durchschnittlich 100 bis 200 Antworten, aber qualitativ hochwertige Aufnahmen, oder in dem Fall zu erhalten , Schwerhörigkeit, werden mehr Wiederholungen empfohlen (750-1.000) 27.
    6. bestimmen visuell ABR Schwelle während des Tests.
      HINWEIS: Die ABR Schwelle ist die niedrigste Intensität Schallreize , die eine zuverlässige ABR mit Wellen Aufzeichnungs entlockt I bis IV deutlich sichtbar und mittlere Spitze-zu-Spitze - Spannung 2 SD über dem mittleren Hintergrundaktivität 31. Diese Daten werden bestätigt duRinganalyse off-line, zusammen mit anderen Parametern einschließlich Spitze und Interpeak-Latenz und Amplituden Welle.
    7. Führen Analysedaten entweder manuell oder automatisch.
      1. Für die manuelle Analyse, identifizieren die 4-5 ABR Wellen (I, II, III ... usw.) Und die Spitzen markieren (P1, P2, P3 ...) und Täler (N1, N2, N3 ...) für jede Welle. Sobald die Analyse, Daten in eine Tabelle oder eine Textdatei abgeschlossen.
        HINWEIS: Spezielle Software für die elektrische Antwort Aufzeichnung der Regel führt die Analyse automatisch. Weitere Messungen können in dem ABR - Aufzeichnung in Reaktion auf eine feste Intensität (dh 70 oder 80 dB SPL) oder bei Intensitäten relativ zu einzelnen Klick Schwellen (dh 15 dB SPL über dem Grenzwert) ermittelt werden.
  6. Führen Sie eine statistische Analyse von ABR-Daten die entsprechende Software. In Abhängigkeit von der experimentellen Design, die Verwendung Standard-T-Test oder Varianzanalyse (ANOVA) gepaart Haupt ABR Parame vergleichenters in den verschiedenen Gruppen 26, 30.
    HINWEIS: In Langzeitstudien werden viele funktionelle Daten von demselben Tier zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt (dh vor und nach der Mikro). In diesem Fall wird ein allgemeines lineares Modell wiederholt Maßnahme Test liefert eine detaillierte Abweichungsanalyse.

3. Fahrzeugvorbereitung

  1. Bereiten Sie und Fahrzeug Lösungen unter sterilen Bedingungen.
    HINWEIS: Flüssige Lösungen sind in der Regel schnell durch die Eustachische Röhre gelöscht. Verschiedene injizierbare Verabreichungssysteme könnte die Verweilzeit des Arzneimittels zu erhöhen , im Mittelohr, einschließlich Hydrogele und Nanoteilchen 32 verwendet werden.
    1. CGP-Hydrogel, lösen sich 75% deacetyliertes Chitosan in 0,2 M Essigsäure ergab eine 1,5-2% (wt / wt) Chitosan-Lösung herzustellen. In 9% Glycerophosphat (wt / wt) zu dieser Lösung 7. Bereiten Sie die Lösungunmittelbar vor der Verabreichung und zu speichern, das Hydrogel bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Die CGP-Hydrogel ist mäßig viskoses, aber noch injizierbare bei dieser Temperatur. Unter 4 ° C ändert er an eine feste Phase, ihre Anwendung zu blockieren. Nach der Anwendung erfährt CGP einen Phasenübergang zu einem halbfesten Gel in etwa 15 min bei 37 ° C.
    2. Aliquot (0,5 ml) Handels RL-Puffer und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.

4. mikrochirurgische Eingriffe

  1. Induzieren allgemeiner Anästhesie mit Ketamin basierend Kombinationen von Sedativa und Analgetika (dh Ketamin 100 mg / kg, Medetomidin 0,05 mg / kg und phentanile 0,025 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion, gefolgt von Inhalationsmitteln (dh Isofluran).
    1. Die O 2 -Versorgung zu Isofluran Dampf Nach injizierbare Mittel verabreicht, stellen Sie die Betäubung facemask an die Maus Schnauze und zu verbinden. Pflegen Sie die Inhalationsanästhesie während derMikrochirurgie und Überwachung der Narkose Ebene mit der Zehen Prise Reflex und Atemmuster. Beginnen chirurgische Vorbereitung, wenn der Reflex vollständig aufgehoben und die Maus präsentiert regelmäßige Atmung.
    2. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur mit Heizkissen während des gesamten Verfahrens und zum Schutz der Augen vor der Hornhaut Keratitis mit einem Hydroxypropylmethylcellulose-Gel auf.
  2. Bereiten Sie einen sauberen chirurgischen Bereich von sterilen Tüchern verwendet wird. Sterilisieren die mikrochirurgische Instrumente mit einem Glasperlen Sterilisator vor der Operation. Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während des gesamten chirurgischen Eingriffs (sterile Handschuhe, Abdecktücher, chirurgische Instrumente, etc.).
  3. Mikrochirurgie
    1. Bullostomy
      HINWEIS: Bullostomy ist eine einseitige Verfahren. Betreiben Sie ein Ohr der Maus und verwenden Sie das Gegenohr als Kontrolle.
      1. Platzieren Sie die Maus in einem Dekubitus Rückenlage. Bereiten Sie den OP-Bereich an der ventralen Oberfläche des Halses mit KlipperEntfernen Sie das Fell. Reinigen Sie die Haut mit Povidonjodid Basis antiseptische Lösung und decken Sie es mit sterilen Tüchern.
      2. Mit einem Skalpell, machen Sie eine 2 cm Längsschnitt aus dem Unterkiefer des Schlüsselbeins.
      3. In der Vergrößerung mit einem Operationsmikroskop, identifizieren die Submandibulardrüse und trennen beide mit einer Pinzette. Fahren Sie die Submandibulardrüse und lokalisieren den Ursprung des M. digastricus und der Gesichtsnerv.
      4. Einen Einschnitt in den Ursprung des M. digastricus mit einer Schere und einfahren es ventral, Freilegung der darunterliegenden minderwertig medialen Aspekt der Bulla tympanica.
      5. Machen Sie eine Öffnung in der Bulla hinein durch das Bohren mit einer 27 G - Nadel (2A). Localize die Steigbügel Arterie und die RW - Membran kaudal es (2B). Reinigen Sie das Blut aus dem gebohrten Bereich mit einem resorbierbaren Gelatineschwamm.
      6. Unter Verwendung einer 34 G-Katheter und eine Glasmikro Spritze injizieren langsam 3-5 μL der Fahrzeuglösung (CGP-Hydrogels oder RL) durch die bullostomy direkt auf die RW Nische, it (2C) zu füllen. Seal die bullostomy mit 1-2 Tropfen Gewebekleber.
      7. Bringen Sie die Submandibulardrüse in ihre Ausgangsposition und schließen Sie die Hautschnitte mit 5-0 Seide chirurgisches Naht. Tragen Sie eine Chlorhexidin-basierte Antiseptikum um den Einschnitt Wundinfektion zu vermeiden. HINWEIS: Die resorbierbaren und nicht resorbierbaren Nahtmaterialien verwendet werden könnten. Nicht-resorbierbaren Fäden müssen in 2 Wochen entfernt werden. Seide ist nicht für den Hautverschluss empfohlen, da seine Verwendung mit Schnitt Infektion und lokale Gewebereaktionen assoziiert ist.
    2. Bilaterale transtympanale Injektion
      1. Platzieren Sie die Maus in der Seitenlage und bereiten einen aseptischen OP - Bereich unterhalb des äußeren Gehörgangs , wie in 4.3.1.1 beschrieben.
      2. Bilden eine 0,5 cm Längsschnitt im vertikalen Teil des äußeren Gehörgang nahe dem Tragus und sEIL die innere Hautfalte der Ohrmuschel (optional).
      3. Suchen Sie das Trommelfell am Ende des äußeren Gehörgang mit einem Operationsmikroskop (2E) und identifizieren die oberen pars flaccida und die inferior pars tensa, die in vorderen und hinteren Abschnitten durch den Griff des Hammers unterteilt ist (Figur 2F) .
      4. Machen Sie eine kleine myringostomy im kaudalen Teil der Pars flaccida. Machen Sie einen zusätzlichen Einschnitt in der Pars tensa des Trommelfells, Luftevakuierung während der Injektion 33 zu ermöglichen. Sanft injizieren 10-15 ul Vehikel (CGP-Hydrogel oder RL) Lösung mit einer Glasmikrospritze mit einem Katheter 34 G verbunden durch die Pars flaccida, in der Nähe der RW Nische , bis das Mittelohr deutlich voll ist.
      5. Schließen Sie die Hautschnitte mit 5-0 Seide chirurgisches Naht und sauber wie in 4.3.1.7 beschrieben.
      6. Platzieren Sie die Maus auf der anderen Seite und operdas Gegenohr aß (Schritte 4.3.2.1-to 4.3.2.5).
  4. Halten Sie die Maus auf einem Heizkissen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
  5. Überwachen Sie den Körperzustand, Aktivität und das Vorhandensein von Anzeichen von Schmerzen oder Stress. Analgetika bereitzustellen , wenn erforderlich (dh Buprenorphin 0,05 mg / kg, Carprofen 5-10 mg / kg). Überprüfen Sie die OP-Wunde täglich und Haut entfernen Verschlüsse 7-14 Tage nach der Operation, nachdem geprüft wurde, dass die Wunde verheilt ist.

5. Morphologische Auswertung von Cochlear Cytoarchitektur

  1. Euthanize die Maus am Ende des Experiments (in dieser Arbeit 28 Tage postmicrosurgery), mit einer intraperitonealen Pentobarbitalüberdosis (100 mg / kg), um die langfristigen Auswirkungen der Operation zu studieren.
  2. Führen Sie eine transkardialer Perfusion mit kalter 0,1 M phosphatgepufferterKochsalzlösung (PBS), pH 7,5, gefolgt von 4% (wt / v) Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M PBS, pH 7,5 mit 26 beschrieben.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist sehr giftig; Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäute. Vermeiden Sie das Pulver während der Messung und die Vorbereitung zu atmen.
  3. Verwenden Sie ein Stereomikroskop das Innenohr aus dem Schläfenbein zu sezieren, wie 34 beschrieben, 35 , ohne die vestibulären und Cochlea - Komponenten des Innenohrs zu trennen.
  4. Fixieren den isolierten Innenohr mit 4% (wt / v) PFA in 0,1 M PBS, pH 7,5 bei 4 ° C für 12 h unter leichtem Schütteln. Waschen 3x 5 min mit 0,1 M PBS, pH-Wert 7,5.
  5. Entkalken die Proben mit 10% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), hergestellt in 0,1 M PBS, pH 6,5 bei 4 ° C für 10 d unter konstantem Schütteln, die EDTA-Lösung alle 3 d ändert.
  6. Wenn Cochlea eine weiche Konsistenz erwerben, entfernen EDTA und waschen 3x 5 min mit 0,1 M PBS, pH 7,5, with bei RT schütteln.
  7. Einbetten der Proben in Paraffinwachs als 34 beschrieben und machen 7 um dicke Cochlea - Abschnitte mit dem modiolus parallel.
  8. Zur Beurteilung der Cochlea Cytoarchitektur, Fleckenabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) 30 und einem Lichtmikroskop mit einer Digitalkamera verbunden verwenden , um Bilder mit 4X und 20X - Linsen.

6. Cochlear Genexpression

  1. Reinigen Sie die Arbeitsfläche und chirurgische Instrumente mit RNAse Dekontaminationslösung.
  2. Euthanize die Maus wie unter 5.1 beschrieben und schnell sezieren aus dem Innenohr aus dem Schläfenbein mit einem Mikroskop. Tauchen Sie das Innenohr in einer Glasschale mit Ribonukleinsäure (RNA) Schutz und Stabilisator-Reagenz.
  3. Entfernen Sie die restlichen Felsenbein mit Juwelier Zange und trennen Sie vorsichtig die Cochlea von der Vorhalle 35 Vanna Auge Schere.
  4. unmittelbar transfer die Cochlea in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 80 ul RNA Schutz und Stabilisatorlösung und das Gewebe einzufrieren, indem das Röhrchen in Trockeneis platzieren. Erhalten Cochlea Proben bei -70 ° C bis zur Verwendung.
  5. Isolieren Cochlea - RNA als 35 beschrieben und bestimmen seine Qualität und Quantität spektrophotometrisch.
  6. Generieren Cochlea-cDNA aus gleichen Mengen an Gesamt-Maus-RNA eine reverse Transkription kommerziellen Kits.
  7. Führen Sie qRT-PCR komplementäre Desoxyribonukleinsäure (cDNA) in dreifacher Ausfertigung zu verstärken Gen - Transkripte 35, 36 zu messen.
    HINWEIS: In dieser Arbeit pro- und anti-inflammatorische Gen - Transkripte von IL1B, IL6, Tgfb1, TNFa, Il10 und DUSP1 wurden gemessen.
  8. Berechnen relativen Expressionsverhältnissen durch Normierung Zieltranskripts cycle threshold (Ct) Ebenen dem arithmetischen Mittel des Referenzgens Ebene und der relativen Quantifizierung durch die NormalisierungProblemgruppe Transkriptniveaus dem arithmetischen Mittel der Kalibrator Gruppe 37.

Representative Results

Gehör wurde , bevor sie von ABR getestet und zu mehreren Zeitpunkten nach der Mikro die Auswirkungen auf auditory function (1A) zu bewerten. ABR Register wurden unter Narkose durchgeführt Tier Bewegung und Spannung Artefakte zu vermeiden und damit die Verbesserung ihrer Reproduzierbarkeit 27. Intraperitoneal Ketamin basierte Kombinationen oder inhalativen Isofluran wurden in der Regel eingesetzt verabreicht Tiere während der ABR-Tests zu betäuben. Die Ketamin / Xylazin Kombination bietet eine kurzwirkenden (2-3 min) Induktion und eine stabile, sichere Wartungsphase während ABR Register durchführen. Es ist zu beachten , daß Isofluran 38 ABR Messempfindlichkeit beeinflussen können. Für ABR - Register werden subdermal Elektroden in bestimmten Orten (1B) und der elektrischen Impedanz gemessen wird platziert. Wenn die Impedanz 3 kOhm oder höher ist, weist Elektrodenpositionierung überprüft werden alt zu vermeidenrationen in ABR Wellenamplitude.

Intratympanic Lieferung wird durch zwei mikrochirurgisches Verfahren (Figur 2) in Mäusen durchgeführt. Die Exposition der Bulla während bullostomy beinhaltet Einziehen der Submandibulardrüse und M. digastricus. Dieses Verfahren wird mit äußerster Sorgfalt durchgeführt , weil die Arteria carotis und Vagusnerv sind ganz in der Nähe (2A). Als nächstes wird die Bulla die Steigbügel Arterie und die RW - Membran (2B) zu lokalisieren gebohrt. Zur Vermeidung von Knochen rissiger, ein kleiner 0,5 mm Öffnung ist mit einer 27 G-Nadel vor dem Bohren hergestellt. Der 34 G Katheter wird durch die bullostomy Richtung RW Membran gerichtet und einem kleinen Volumen Fahrzeug wird auf die Fensternische (2C) geliefert. Die transtympanale Injektion wird flaccida des Trommelfells mit einer 27 G - Nadel in der Pars durch einen Schnitt durchgeführt wird ; ein größeres kann provozierenOhr in der Membran. Vor der Injektion, empfehlen wir , einen zusätzlichen Einschnitt in der Pars tensa das Ausströmen von Luft während der Injektion des Fahrzeugs (2F) zu ermöglichen. Es ist wichtig, eine Beschädigung der Steigbügel Arterie, einem Zweig der Arteria carotis interna zu vermeiden, die zu lebensbedrohlichen Blutungen führen würde.

Mäuse mit bullostomy oder transtympanale Operationen erhalten Hörfähigkeit während des gesamten Experiments, ähnlich zu nicht-operierten Kontrollen (Abbildung 3). ABR Schwellen als Reaktion auf Klicks und Ton platzt nicht wesentlich ändern, nachdem Mikrochirurgie im Vergleich zu den Ausgangswerten. Wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen bullostomy und transtympanale Ansätze beobachtet. Morphologische Untersuchungen wurden durchgeführt korrekte Fahrzeugauslieferung in das Mittelohr zu bestätigen und die möglichen Veränderungen durch die Verfahren im Bereich der Cochlea Cytoarchitektur verursacht zu beurteilen. Keiner der wichtigsten Cochlea Regionen showed morphologischen Veränderungen und Tiere aus beiden Verfahren stellte eine ähnliche Morphologie aller Cochlea - Strukturen (4A). Darüber hinaus wurden die Cochlea Profile für die Genexpression pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen untersucht. Trotz Mangel an funktionellen Unterschiede in ABR - Daten zwischen den beiden Verfahren, verursacht bullostomy eine stärkere entzündliche Reaktion als die transtympanale Ansatz (4B).

Abbildung 1
Abbildung 1. Experimentelle Gestaltung und Anhörung Abschätzung. (A) Schematische Darstellung des experimentellen Verfahrens. Hearing wurde vor mit ABR ausgewertet und nach Mikrochirurgie. Cochlear-Proben wurden 28 Tage nach Mikrochirurgie erhalten. (B) Narkotisierten Maus in Bauchlage über das Heizkissen in einem schalldämpfenden Kammer, mit subdermaler electrodes in die Kopfhaut zwischen den Ohren über den Scheitel des Schädels angeordnet (aktiv, positiv); im Parotisgegend unterhalb der Ohrmuschel (Referenz, negativ) und hinten (Masse). Die Freifeldlautsprecher ist in einem festen Abstand (5 cm) gegenüber dem rechten Ohr platziert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Mikro für die Fahrzeuganwendung. (A) Ventralansicht des Trommelfells Bulla. Die bullostomy erfolgt kaudal des Gesichtsnerven mit einer 27 G-Nadel. (B) RWN und Steigbügel Arterie kann durch die Perforation beobachtet werden. (C) Der 34 G - Katheter wird durch die bullostomy in Richtung der RW Nische gerichtet. (D) Einen Monat nach der bullostomy, einen kleinen knöchernenNarbe ist in der Öffnung der Unterkunft (Pfeilspitze). (E) Seitenansicht des Ohres, den Schnitt in den äußeren Gehörgang zeigt und das Trommelfell (Platz). (F) Detail des Trommelfells. Ein Einstich wurde am kaudalen oberen Quadranten des Trommelfells unter Verwendung einer 27 G - Nadel (schwarzer Stern, in der Pars flaccida) gemacht; Die Injektion wurde durch diese Perforation mit einem 34 G-Katheter hergestellt. Ein zusätzliches Loch in der Schädel unteren Quadranten der Membran (weißer Stern, in der pars tensa) vor dem Einspritzen zu balancieren die Pauken Druck hergestellt. (G) Mit Blick auf das 34 G Katheter durch die Einstich des Trommelfells. (H) Mit Blick auf das Cochlea - Bereich 24 h nach dem Mikrochirurgie. RWN gefüllt mit Fahrzeug-Lösung (Stern). Lat, lateral; Ro, rostral; Do, dorsale; Ma, Malleus; Co, Cochlea; OW, Oval-Fenster; RWN, runde Fensternische. Maßstabsbalken = 200 & mgr; m in A, D, F; Maßstabsbalken = 100 & mgr; m in B, C, H; Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m in E, G. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Anhörung Bewertung. Evolution der ABR Schwellen (Mittelwert ± SEM, in dB SPL) als Reaktion auf klicken (A) und Tone Burst (B) Reize, vor und 7, 14 und 28 Tage nach der Mikrochirurgie in der männlichen acht Wochen alte C57BL / 6J Mäusen. Bullostomy (orange; n = 11); transtympanale Injektion (blau; n = 6); nicht-operierten (grau; n = 11), klicken Sie bitte hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Cochlear Morphologie und Genexpressionsanalyse. (A) Morphologie der Haupt Cochlea Strukturen auf der Basis der Cochlea. Haematoxilin-Eosin-Färbung von Mitte Modiolus Paraffinschnitte (7 & mgr; m), der Ohren von nicht-operierten Mäuse und Mäuse einen Monat nach Mikrochirurgie Intervention durch bullostomy oder transtympanale Injektion. Das scala Medienfach (a, b, c) stellt alle Hauptkomponenten. Spiralganglion (1), Corti-Organ (2), Spiralband (3) und Stria vascularis (4): Details von jeder dieser Strukturen (nummerierten Felder) sind in den nachfolgenden Bildern gezeigt. Inneren Haarzelle (Stern); äußeren Haarzellen (Pfeilspitze). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m in a, b, c; Maßstabsbalken = 50 & mgr; m in einem 1,2,3,4. (B) Cochlear Expression von Entzündungsmarkern 28 d nach der Mikrochirurgie. Vergleich zwischen bullostomy (orange) und transtympanale Injektion (blau) und nicht-operierten Mäusen (weiß). *: Nicht operierten vs.betrieben Gruppen; ^: Vergleich zwischen Gruppen betrieben. Genexpressionsniveaus als 2 dargestellt - ΔΔCt, oder die n-fache Differenz in Bezug auf nicht-operierten group.Values präsentiert als Mittelwert ± SEM von dreifacher Ausführung von Poolproben von 3 Mäusen pro Bedingung. Die statistische Signifikanz: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Lokale Arzneimittelabgabe an das Innenohr direkt durch intracochleärer Injektion oder indirekt durch intratympanic Verabreichung erfolgen, 4 das Medikament im Mittelohr platziert, 19, 39. Intracochleärer Verwaltung ermöglicht die kontrollierte und präzise Medikamentenabgabe an die Cochlea, die Diffusion durch Membranen Fenster zu vermeiden, basal-to-apikalen Konzentrationsgradienten und Freigabe durch die Eustachische Röhre. Jedoch ist es in der Regel ein sehr invasives Verfahren , die eine komplexe und empfindliche Mikro 7, 39 erfordert. In diesem Zusammenhang ist die Entwicklung der Industrie neue, überzogen, implantierbare Geräte für verzögerte Wirkstofffreisetzung 40, 41. Auf der anderen Seite ist intratympanic Verabreichung eine minimal invasive und einfache Prozedur durchzuführen, die die Injektion von größeren Volumina der d ermöglichtTeppich in das Mittelohr, obwohl die Pharmakokinetik zu steuern, ist nicht einfach. Der Großteil des Arzneimittels wird durch Eustachische Röhre gelöscht , und die verbleibende Fraktion aufweist , durch die Membran zu diffundieren RW 18 der Cochlea zu erreichen. RW ist die Stelle der maximalen Absorption von Substanzen aus dem Mittelohr in die Perilymphe gefüllten Pauken Kanal der Cochlea 7. Es ist eine semipermeable Dreischichtstruktur, obwohl seine Permeabilität für die Arzneimitteleigenschaften abhängt (Größe, Konzentration, Löslichkeit und elektrische Ladung) und Transtransportsysteme (Diffusion, aktiven Transport oder Phagozytose) 42. Das ovale Fenster und otic Kapseln sind alternative , aber weniger effektiv Zugänge zu Cochlea 43, 44.

Hier zeigen wir, und vergleichen Sie zwei mikrochirurgisches Verfahren zur gezielten Verabreichung von Medikamenten in die Maus Mittelohr: bullostomy und transtympanic Injektionsverfahren. Gemeinsame kritischen Schritte zu diesen Verfahren sind: i) eine Bewertung der Anhörung vor und nach dem Mikrochirurgie, ii) Herstellung einer homogenen Fahrzeug Lösung unter sterilen Bedingungen, iii) eine sorgfältige Überwachung der Anästhesieverfahren und Überwachung von Tierkörpertemperatur und Konstanten, iv ) langsam Platzierung des geeigneten Volumen Fahrzeug die RW, und iv) unter Cochlea-Proben gezielt molekulare und morphologische Analyse zu vervollständigen.

Retroaurikulären und ventralen Ansätze für bullostomy haben 7 beschrieben worden ist , 45. Wir nutzten die ventrale Annäherung , weil in unserer Erfahrung in weniger Morbidität und zur Verfügung gestellt besseren Zugang zum 46 RW geführt hat. Transtympanale Injektionen werden in der Regel durch die pars tensa des Trommelfells durchgeführt wird , vor oder hinter dem Malleus manubrium 12. ImDiese Arbeiten führten wir eine Modifikation der Technik, eine Injektion durch die pars flaccida jenseits des Malleus mit einer früheren zusätzlichen Einstich der Pars tensa Luftevakuierung während der Injektion zu ermöglichen.

Die transtympanale Injektion war weniger invasiv als die bullostomy, obwohl beide microsurgeries schnelle waren (20 und 5 min pro Ohr für bullostomy und transtympanale Ansatz beziehungsweise), mit kurzen postoperativen Erholungszeiten und keine Morbidität. Am wichtigsten ist, beibehalten beide Verfahren zu hören und die ABR Parameter waren identisch mit vor dem Mikrochirurgie bestimmt diejenigen. Der transtympanale Ansatz nimmt weniger Zeit als die bullostomy und kann auf beiden Ohren des gleichen Tieres im gleichen Eingriff durchgeführt werden. Vorteile der transtympanale Injektions sind somit, dass sie bilateral durchgeführt werden kann, und wiederholt, falls erforderlich. Auf der anderen Seite stellt bullostomy direkten visuellen Zugang zu den RW-Membran und ermöglicht es dem filling der RW-Nische. Im Gegensatz dazu erlaubt es transtympanale Injektion nicht zur Steuerung von Fahrzeug Platzierung in der RW-Nische.

Die Verfahren in dieser Arbeit berichtet wird beschrieben, wie für die präklinische Anwendungen wie Auswertung von Ototoxizität und Bewertung der Wirksamkeit bei Hörverlust eines lokalen Drogenfahrzeugauslieferung an das Mittelohr auszuführen. Zwei Mikro Verfahren beschrieben, die zur Verfügung stellen alternative Methoden mit spezifischen Vor- und Nachteile. Beide erhalten hören und verursachen keine morphologischen Veränderungen. Lokale Entzündung wird als eine mögliche Komplikation der bullostomy beschrieben. Eine Reihe von komplementären Techniken sind auch für die postoperative Verfahren beschrieben, einschließlich der Anhörung, morphologische und Entzündungsmarker Ausdruckauswertungen. Zukünftige Anwendungen für diese Techniken umfassen die präklinische Bewertung neuer Therapien für Hörverlust, einschließlich der genetischen, zellulären und pharmakologische Ansätze, in Tiermodellen. intratympanic administratIonen, welche die Lieferung der Behandlung im Mittelohr, in Kontakt mit der runden Fenstermembran, erleichtert den Durchgang in die Perilymphe ohne evident cochlear Schaden sicherzustellen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten die Genomik und nicht-invasive neuroBewertungsEinrichtungen (IIBM, CSIC-UAM) für ihre technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der spanischen "Ministerio de Economia y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) und der Europäischen Union (FP7-AFHELO und FP7-PEOPLE-TARGEAR) zu IVN unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (Imalgene) Merial # 2529 CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections
Xylacine (Xilagesic)  Calier # 6200025225
Lubricant eye gel (Artific) Angelini # 784710
Water pump  Gaymar # TP472
Surface disinfectant José Collado SA # CR-36
Subdermal needle electrodes  Spes Medica # MN4013D10SM
Low Impedance Headstage  (RA4LI) Tucker-Davis Technologies
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) Tucker-Davis Technologies
System 3 Evoked Potential Workstation Tucker-Davis Technologies The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier 
SigGenRP software Tucker-Davis Technologies
Warming pads (TP pads) Gaymar # TP3E
Statistics software (SPSS) IBM
Chitosan (deacetylated) Sigma-Aldrich # C3646
Acetic acid (glacial) VWR # 20103.295 CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer
Glycerophosphate Sigma # SLBG3671V
Ringer´s lactate buffer Braun # 1520-ESP
Medetomidine (Domtor) Esteve # 02400190
Phentanile (Fentanest) Kern Pharma # 756650.2 CAUTION:   avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections
Isoflurane (IsoVet) Braun # 469860 CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h.
Surgical microscope (OPMI pico) Zeiss
Sterile drape (Foliodrape) Hartmann # 277546
Sterilizer  Fine Science Tools # 18000-45
Scalpel blade Swann Morton # 0205 CAUTION
Scalpel handle Fine Science Tools # 91003-12
Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) Meda Pharma SAU # M-12207
Adventitia scissors (SAS18-R8) S&T # 12075-12
Curved scissors CM Instrumente # AJ023-18
Forceps CM Instrumente # BB019-18
Gelatine sponge (Spongostan) ProNaMAc # MS0001
Microlance 27 G Becton Dickinson # 302200
Microliter syringe (701 RN SYR) Hamilton # 80330
Catheter (Microfil 34 G) World Precision Instruments  # MF34G-5
Tissue Adhesive (Vetbond) 3M # 1469SB
Needle holder (Round handled needle holder)  Fine Science Tools # 12075-12
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) Arago # 990011
Chlorhexidine (Cristalmina) Salvat # 787341
Pentobarbital  (Dolethal) Ventoquinol # VET00040 CAUTION:   avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections
Stereomicroscope (Leica) Meyer Instruments # MZ75
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action Harvard Apparatus # 28483
Jeweller’s forceps (Dumont) Fine Science Tools # 11252-00
RNase Decontamination Solution  (RNaseZap) Sigma-Aldrich # R2020
RNA Stabilization Solution  (RNAlater) Thermo Fisher Scientific # R0901
Purification RNA kit (RNeasy) Qiagen # 74104
cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific # 4368814
Gene expression assay (TaqMan probes) Thermo Fisher Scientific Il1b: Mm00446190_m1
Il6: Mm00446190_m1
Tgfb1: Mm01178820_m1
Tnfa: Mm99999068_m1
Il10: Mm00439614_m1
Dusp1: Mm00457274_g1
Hprt1: Mm00446968_m1
Real-time PCR System (7900HT) Applied Biosystems # 4329001
Paraformaldehyde (PFA) Merck # 1040051000 TOXIC: PFA is a potential carcinogen
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck # 405491 CAUTION:  harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if
inhaled.
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich # HHS16
Eosin Y Sigma-Aldrich # E4382 Hazards: causes serious eye irritation

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References

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Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Transtympanale Injection
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Murillo-Cuesta, S., Vallecillo, N., Cediel, R., Celaya, A. M., Lassaletta, L., Varela-Nieto, I., Contreras, J. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J. Vis. Exp. (121), e54951, doi:10.3791/54951 (2017).More

Murillo-Cuesta, S., Vallecillo, N., Cediel, R., Celaya, A. M., Lassaletta, L., Varela-Nieto, I., Contreras, J. A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection. J. Vis. Exp. (121), e54951, doi:10.3791/54951 (2017).

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