Abstract
في كثير من الأحيان معقدة دراسات للبروتينات الغشاء لا يتجزأ في المختبر عن طريق وجود مجال الغشاء مسعور. يزيد من تعقيد هذه الدراسات، إعادة إدماجهم في الحياة من البروتينات الغشاء المنظفات بالفاعلات في الجسيمات الشحمية هي عملية العشوائية حيث طوبولوجيا البروتين من المستحيل تطبيقها. تقدم هذه الورقة طريقة بديلة لهذه التقنيات الصعبة التي تستخدم سقالة القائم على الحويصلية. ومما يعزز الذوبان البروتين عن طريق حذف المجال عبر الغشاء، ويتم استبدال هذه الأحماض الأمينية مع شاردة الربط، مثل صاحب العلامة. هذا الحبل يتفاعل مع مجموعة ترسيخ (ني 2+ بتنسيق من حمض nitrilotriacetic (NTA (ني 2+)) لصاحب الموسومة البروتينات)، التي تفرض طوبولوجيا البروتين موحد على سطح الجسيمات الشحمية. ويقدم مثالا حيث التفاعل بين ذات الصلة Dynamin بروتين 1 (Drp1) مع بروتين الغشاء لا يتجزأ، الميتوكوندريا الانشطار عامل (MFF)، وكان إنفيstigated استخدام هذا الأسلوب سقالة الحويصلية. في هذا العمل، لقد أثبتنا قدرة MFF لتجنيد بكفاءة Drp1 القابلة للذوبان على سطح الجسيمات الشحمية، الأمر الذي حفز النشاط GTPase لها. وعلاوة على ذلك، كانت قادرة على tubulate القالب الدهون زينت MFF في وجود الدهون محددة Drp1. يوضح هذا المثال فعالية الجسيمات الشحمية سقالة باستخدام فحوصات الهيكلية والوظيفية ويسلط الضوء على دور MFF في تنظيم النشاط Drp1.
Introduction
دراسة تفاعلات البروتين البروتين غشاء الداني هو مسعى صعبة بسبب صعوبة تلخص البيئة الأصلية للبروتينات الغشاء لا يتجزأ المشاركة 1. ويرجع ذلك إلى ضرورة إذابة المنظفات والتوجه يتعارض البروتينات في proteoliposomes هذا. من أجل تجنب هذه القضايا، ونحن قد استخدمت استراتيجية حيث يتم التعبير عن المجالات القابلة للذوبان من بروتينات الغشاء لا يتجزأ كما بروتينات اندماج صاحب العلامة، وترتكز هذه الشظايا القابلة للذوبان في الجسيمات الشحمية سقالة عبر التفاعل مع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups في الدهون سطح. باستخدام هذه الاطر، وتفاعلات البروتين الدهني الداني يمكن التحقيق على مجموعة من الدهون والبروتين التراكيب.
ولقد طبق فعليا هذا الأسلوب لتحقيق تفاعلات البروتين البروتين الحرجة التي تحكم التجمع من مجمع الانشطار الميتوكوندريا ودراسة التفاعلات الدهون التي تعدل هذه العلاقات العامةocess 2. أثناء الانشطار الميتوكوندريا، وهو محفوظ البروتين غشاء إعادة عرض، ودعا المتعلقة Dynamin بروتين 1 (Drp1) 3، ويتم تجنيدهم للسطح الخارجي الميتوكوندريا غشاء (OMM) استجابة لإشارات الخلوية التي تنظم توازن الطاقة، مما يشير أفكارك، وعدد آخر عمليات الميتوكوندريا لا يتجزأ. يتم تجنيد هذا كبير، GTPase عصاري خلوي إلى السطح من الميتوكوندريا من خلال التفاعل مع بروتينات OMM لا يتجزأ 4-8. وقد كان دور واحد مثل البروتين، الميتوكوندريا الانشطار عامل (MFF)، من الصعب توضيح بسبب ضعف التفاعل الواضح مع Drp1 في المختبر. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الجينية بوضوح أن MFF أمر ضروري لنجاح 7،8 الانشطار الميتوكوندريا. وكان الأسلوب هو موضح في هذه المخطوطة قادرة على التغلب على أوجه القصور السابقة عن طريق إدخال التفاعلات الدهون المتزامنة التي تعزز التفاعلات Drp1-MFF. عموما، هذه الرواية فحص reveaأدت قوة أساسية تجميع المجمع الانشطار الميتوكوندريا توجيه وقدمت مرحلة جديدة للدراسات الهيكلية والوظيفية لهذه الآلة الجزيئية الأساسية.
حتى الآن، دراسة التفاعلات بين Drp1 وMFF وتعقدت من المرونة المتأصلة في MFF 9، عدم تجانس Drp1 البوليمرات 2،10، وصعوبة في تنقية وإعادة تشكيل كامل طول MFF مع مجال الغشاء سليمة 11. تناولنا هذه التحديات باستخدام الجسيمات الشحمية NTA (ني 2+) سقالة لإعادة صاحب الموسومة-MFF تفتقر نطاق الغشاء لها (MffΔTM-صاحب 6). وكانت هذه الاستراتيجية مفيدة لMffΔTM كان ذوبان للغاية عند الإفراط في المعبر عنها في البريد. القولونية، وهذا البروتين المعزول أعيد بسهولة على الجسيمات الشحمية سقالة. عندما المربوطة إلى هذه القوالب الدهون، يفترض MFF ومتطابقة، في مواجهة الخارج التوجه على سطح الغشاء.وبالإضافة إلى هذه المزايا، والدهون الميتوكوندريا، مثل كارديوليين، أضيفت إلى استقرار MFF قابلة للطي وبالتعاون مع غشاء 11. يتفاعل كارديوليين أيضا مع المجال متغير من Drp1 2،12 والتي قد استقرار هذه المنطقة المضطربة وتسهيل تجميع الآلات الانشطار.
هذه طريقة قوية غير قابلة للتطبيق على نطاق واسع للدراسات المستقبلية التي تسعى إلى تقييم تفاعلات البروتين غشاء الداني. من خلال استخدام التفاعلات إضافية الربط / تقارب، وتطور هذه الدراسات غشاء إعادة يمكن تعزيز لتقليد تعقيد إضافي وجدت على سطح الأغشية داخل الخلايا. في نفس الوقت، والتراكيب الدهون يمكن تعديلها لتحاكي بدقة أكثر البيئات المحلية من هذه المجمعات الجزيئات. وخلاصة القول، وهذه الطريقة توفر وسيلة لدراسة المساهمات النسبية للبروتينات والدهون في تشكيل الأشكال التضاريسية غشاء إليها أثناء بروك الخلوي حرجةesses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الحويصلية سقالة
ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي أن التجارب الأولية استخدام سقالة بسيطة نسبيا وملامح و(تتألف من DOPC (1،2-dioleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine أو PC) وDGS-NTA (ني 2+) (1،2-dioleoyl - SN -glycero 3 - [(N - (5-أمينو-1-carboxypentyl) حمض iminodiacetic) succinyl]. (النيكل الملح)) بناء الخروج من هذه التجارب، تهمة الدهون، والمرونة، وانحناء كما يمكن ادخال العوامل الفردية مع القدرة على تغيير التفاعلات غشاء الداني. وهذه التغيرات يمكن أن يتحقق عن طريق إضافة كميات محددة من مكونات الدهون محددة، بما في ذلك فسفاتيديل أو كارديوليين (CL)، فسفاتيديل إيثانولامين (مخدر أو PE)، أو galactosyl (β) سيراميد.
- الجمع بين الدهون الذائبة في الكلوروفورم في أنبوب اختبار زجاجي نظيف. تتبخر المذيب مع غاز النيتروجين الجاف في حين تناوب أنبوب لتشكيل لفيلم الدهون رقيقة. إزالة المذيبات المتبقية مع centrifugaل المبخر لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: تستخدم مركبات الحويصلية مختلفة في البروتوكولات المذكورة أدناه: الجسيمات الشحمية سقالة (3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+) / 96.7 مول٪ DOPC)، الجسيمات الشحمية سقالة مع كارديوليين (3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+) / 10 مول٪ كارديوليين / 86.7 مول٪ DOPC)، الجسيمات الشحمية سقالة مرنة مع كارديوليين (3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+) / 10 مول٪ كارديوليين / 35 مول٪ مخدر / 51.7 مول٪ DOPC)، وسقالة المخصب الجسيمات الشحمية (10٪ مول DGS-NTA (ني 2+) / 15 مول٪ كارديوليين / 35 مول٪ مخدر / 40 مول٪ DOPC). - إضافة العازلة ألف (25 ملي HEPES (4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، 150 ملي بوكل، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 مع KOH) مسخن الى 37 درجة مئوية بحيث تركيز الدهون النهائي 1-2 ملم. احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع vortexing لعرضية ل resuspend تماما خليط الدهن (الشكل 1A).
- نقل إلى أنبوب اختبار البلاستيك، ووضع أنبوب في النيتروجين السائل حتى المجمدة تماما (ROUGHLY 30 ثانية)، ومكان في 37 ° C حمام الماء حتى إذابة تماما (حوالي 1-2 دقائق). تكرار لما مجموعه 4 دورات تجميد ذوبان الجليد (الشكل 1B).
- إعداد الطارد الدهون عن طريق نقع 4 يدعم مرشح ومرشح البولي في المخزن وتجميع الطارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قذف الحل الدهون من خلال تصفية 21 مرة. استخدام لطيف، وضغط مستمر لضمان توزيع حجم متجانسة (الشكل 1C).
ملاحظة: للحصول على جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول، تم استخدام فلتر 1.0 ميكرون البولي للقذف. التفاعل مع Drp1 الدهون أنيوني يمكن ملاحظة مع مجموعة متنوعة من أقطار الحويصلية تتراوح بين 50 نانومتر إلى 400 نانومتر 12 أو أكبر 13. وبالتالي، تم اختيار حجم مرشح من 1 ميكرون لتكون مثالية لكلا النشاط GTPase والمجهر الإلكتروني. وإذا رغبت أقطار الحويصلية الأخرى، وإعداد الحويصلات unilamellar العملاقة 14،15 (GUVs) أو unilamell صغيرةع الحويصلات 16 (سيارات الدفع الرباعي) يمكن استخدامها. تشتت الضوء الحيوي يمكن استخدامها لتقييم الحويصلية حجم التباين 13. - تخزين الجسيمات الشحمية مقذوف في 4 درجات مئوية، وتجاهل بعد 3-5 د.
2. استخدام سقالة الليبوزومات للبروتين تحليل ملزم
- إعداد عينة
- احتضان صاحب الموسومة MffΔTM (5 ميكرومتر النهائي) مع الجسيمات الشحمية سقالة (40٪ مول PC / 35 مول٪ PE / 15 مول٪ CL / 10 مول٪ DGS-NTA (ني 2+)، و 50 ميكرومتر النهائي) لمدة 15 دقيقة على الأقل في RT في الواق A + BME (25 ملي HEPES، 150 ملي بوكل، 10 ملي β-المركابتويثانول (BME)، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 مع KOH). لعنصر تحكم MFF خالية، واحتضان شحمية مع صاحب الموسومة بروتين السيطرة (مثل GFP) لربط ودرعا تتعرض الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+).
وأعرب عن MffΔTM وتنقيته كما هو موضح في دراسة سابقة 2: ملاحظة. تمت تنقية GFP بطريقة مماثلة، ولكن تم حذف الخطوة التبادل الأيوني. كان مطلوبا BME لهذه التجربهنهاية الخبر لأن Drp1 حساسة للأكسدة، والتي يمكن تغيير خصائص النشاط والتجميع. - إضافة Drp1 (2 ميكرومتر النهائي)، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
وأعرب عن Drp1 وتنقيته كما هو موضح في دراسة سابقة 2: ملاحظة. بعد الحضانة مع Drp1، وتأثير النوكليوتيدات ملزمة للتشوه غشاء يمكن التحقيق التي يحتضنها ساعة إضافية واحدة مع 2 مم MgCl 2 وإما 1 ملي GTP، 1 ملم GMP-PCP، أو الواق A + أساسيات إدارة الأعمال.
- احتضان صاحب الموسومة MffΔTM (5 ميكرومتر النهائي) مع الجسيمات الشحمية سقالة (40٪ مول PC / 35 مول٪ PE / 15 مول٪ CL / 10 مول٪ DGS-NTA (ني 2+)، و 50 ميكرومتر النهائي) لمدة 15 دقيقة على الأقل في RT في الواق A + BME (25 ملي HEPES، 150 ملي بوكل، 10 ملي β-المركابتويثانول (BME)، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.5 مع KOH). لعنصر تحكم MFF خالية، واحتضان شحمية مع صاحب الموسومة بروتين السيطرة (مثل GFP) لربط ودرعا تتعرض الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+).
- السلبي وصمة عار نقل المجهر الإلكتروني (EM) تحليل
- نقل 5 ميكرولتر من العينة إلى ورقة من فيلم المختبر، ووضع نحاس / ره شبكة الكربون المغلفة على العينة. احتضان دقيقة شبكة 1 على العينة، وصمة عار بعيدا السائل الزائد على ورق الترشيح، ونقل إلى انخفاض 2٪ خلات اليورانيل. احتضان 1 دقيقة، وصمة عار وصمة عار الزائدة على ورق الترشيح، ونقل إلى مربع الشبكة. مخزن تحت فراغ O / N لضمان جفاف الكامل.
- عينات صورة باستخدام microsc انتقال الإلكترونمكتب مستشار رئيس الوزراء في 18،500 - 30،000X التكبير لمراقبة التغيرات التركيبية في البروتين والحويصلية الأشكال التضاريسية 17.
ملاحظة: يمكن قياس التغيرات التركيبية باستخدام صورة برامج التحليل، مثل يماغيج 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). ويمكن قياس الديكور البروتين بالمقارنة مع قوالب الدهون المجردة. بالإضافة إلى ذلك، بأقطار من شرائح أنبوبي يمكن قياسها من الجزء الخارجي من التجمعات 13. يمكن إجراء تحليل أكثر تفصيلا باستخدام البرد الإلكترون المجهري 17. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة أصلية المجالس البروتين الدهني في المذيبات دون استخدام البقع المعادن الثقيلة التي معطف العينة. وبهذه الطريقة، سمات هيكلية مفصلة يست واضحة في وصمة عار السلبية، بما في ذلك التغييرات في مورفولوجية الدهون الأساسية، يمكن دراستها وكميا.
3. استخدام سقالة الليبوزومات لالأنزيمية الفحص
ملاحظة: COLORIوقد استخدم المتري GTPase فحص 18 إلى قياس تحرير الفوسفات عن طريق التحلل GTP. 19 يوجد فحوصات GTPase البديلة ويمكن تنفيذها حسب الحاجة.
- احتضان صاحب الموسومة-MffΔTM (MFF)، Fis1ΔTM (Fis1)، أو GFP (5 ميكرومتر النهائي للجميع) مع الجسيمات الشحمية سقالة (150 ميكرومتر النهائي) لمدة 15 دقيقة في RT في الواق A + BME (حجم = 30 ميكرولتر). إضافة Drp1 (500 نيوتن متر نهائي)، واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية في RT (حجم = 80 ميكرولتر).
تمت تنقية Fis1 بطريقة مشابهة لMFF 2، ولكن تم حذف الخطوة اللوني التبادل الأيوني: ملاحظة. والغرض من صاحب الموسومة-GFP هو درع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups ومنع التفاعلات تهمة غير محددة مع بروتينات أخرى. إذا لوحظ أي تأثير في غياب GFP، ثم قد لا تكون هناك حاجة هذه السيطرة. البروتينات بديلة تسد (ذات الحجم المماثل للبروتين من الفائدة) يمكن أن تستخدم أيضا، ولكن GFP يسمح للرؤية مباشرة للتفاعلات مع المجلس العسكريأضعاف الجسيمات الشحمية. - أنابيب نقل إلى thermocycler مجموعة إلى 37 درجة مئوية، والشروع ردود الفعل بإضافة GTP وMgCl 2 (1 ملم و 2 ملم النهائي، على التوالي؛ حجم = 120 ميكرولتر).
- في نقطة الوقت المطلوب (أي T = 5، 10، 20، 40، 60 دقيقة)، ونقل 20 ميكرولتر من رد فعل على الآبار لوحة microtiter تحتوي على 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA لخلابة المغنيسيوم 2+ ووقف رد فعل.
- إعداد مجموعة من المعايير الفوسفات عن طريق تمييع KH 2 PO 4 في الواق A + BME لمعايرة النتائج. مجموعة مفيدة من المعايير هو 100، 80، 60، 40، 20، 10، 5 و 0 ميكرومتر. إضافة 20 ميكرولتر من كل الآبار التي تحتوي على 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA.
- إضافة 150 ميكرولتر من الملكيت الاخضر كاشف (كربينول الأخضر 1 ملم المرمر، 10 ملي كربونات الأمونيوم tetrahydrate، و 1 N حمض الهيدروكلوريك) إلى كل بئر، وقراءة OD 650 5 دقائق بعد إضافة.
ملاحظة: GTP هو حمض عطوب، وسوف يتحلل في وجود كاشف الأخضر المرمر. ضمان أن ركان الوقت بين إضافة كاشف المرمر وقراءة ثابتة لضمان تحقيق نتائج استنساخه. - توليد منحنى القياسية بالتآمر OD 650 من المعايير بوصفها وظيفة من تركيز الفوسفات. استخدام الانحدار الخطي لتحديد العلاقة بين التطوير التنظيمي 650 و تركيز الفوسفات في عينة.
- باستخدام الانحدار الخطي، تحويل OD 650 من العينات رد فعل البروتين لميكرومتر الفوسفات. تحديد معدل توليد الفوسفات لكل خليط التفاعل بالتآمر تركيز الفوسفات بوصفها وظيفة من الزمن، وتحويل إلى k القط بقسمة سعر الفائدة من قبل تركيز Drp1 (0.5 ميكرومتر).
ملاحظة: فقط معدل الخطية الأولي ينبغي أن تستخدم لتحديد معدل توليد الفوسفات، ويجب استخدام ما لا يقل عن 3 نقاط البيانات. إذا كان معدل رد فعل سريع بما فيه الكفاية أن أول ثلاث نقاط البيانات غير الخطية (أي ص 2 من نوبة الخطي هو أقل من 0.9) علامةيجب أن يتم تنفيذ أقصر ificantly دوام لا تقل عن 3 نقاط الوقت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفي الوقت الذي ظهر التفاعل بين Drp1 وMFF إلى أن تكون مهمة للانشطار الميتوكوندريا، وقد تم هذا التفاعل من الصعب أن ألخص في المختبر. وكان لدينا هدف لمحاكاة البيئة بشكل أفضل الخلوية حيث Drp1 وMFF التفاعل. تحقيقا لهذه الغاية، الجسيمات الشحمية التي تحتوي على تركيزات الحد من الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups تم بواسطة المضادة للجفاف فيلم الدهون كما هو موضح أعلاه أعدت. الحل الدهون تتكون في البداية من الحويصلات unilamellar والصفاحات من أقطار متباينة كما يتضح من غموض الحل (الشكل 1A). يتم تقليل هذا التعتيم من قبل تجميد ذوبان الجليد (الشكل 1B)، مما يقلل من انتشار الحويصلات الصفاحات. والمتجانس أقطار الحويصلية مزيد من قذف من خلال مرشح البولي، مما يؤدي إلى حل واضح (الشكل 1C).
"1"> في دراسات سابقة، وجدنا أن Drp1 كانت قادرة على تجميع الجسيمات الشحمية على سقالة زينت MFF، ولوحظ tubulation غشاء عندما كانوا يعملون أغشية مرنة 2. بناء على هذه النتائج، ونحن استخدام قالب جديد يتألف من جهاز الكمبيوتر، PE، ني، وCL (وتسمى المخصب سقالة الليبوزومات أو اللغة الإنجليزية كلغة ثانية) لتعزيز التجمع أمر من البوليمر Drp1-MFF قادرة مجمع يحفز الغشاء تشوه. على وجه التحديد، وزيادة NTA (ني 2+) واستخدمت الدهون كارديوليين (10 مول٪ و 15٪ على التوالي مول) لهذا التطبيق. ثم، كان المربوطة GFP أو MFF إلى قوالب اللغة الإنجليزية كلغة ثانية في وجود وغياب Drp1 (الشكل 2)، وقدرة Drp1 لإعادة الأغشية تم تقييم نوعيا. في غياب Drp1، أسفرت لا MFF ولا GFP في تشوه غشاء (الشكل 3A، ب)، وكذلك في حالة ESL زينت GFP، لوحظت فقط الجسيمات الشحمية ملامح و(الشكل 3C). ومع ذلك، عندما Dتمت إضافة RP1 إلى قوالب ESL زينت MFF، وإعادة تشكيل الجسيمات الشحمية واضحا (الشكل 3D).
بينما يوضح تشكيل معقدة الجزيئات بشكل واضح وجود تفاعل بين Drp1 وMFF، هذا التحليل النوعي هو وحده قادر على تحديد الآثار الفنية من مثل هذا التفاعل. ولذلك، فإننا الاستفادة من المرمر الأخضر الفوسفات الجيل فحص 18 لتقييم التغيرات في النشاط التحفيزي من Drp1 ردا على التفاعل مع MFF. كما هو موضح سابقا 2، واستخدمت في البداية بسيطة سقالة الحويصلية (SL؛ 3.3 مول٪ DGS-NTA (ني 2+)، 96.7٪ مول DOPC) للتحقيق في تأثير MFF وحده على هيكل Drp1 وظيفة. تفاعل غير محدد من Drp1 مع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) وقد سبق وصفها 20، لذلك تم تصميم SL البداية لاحتوائها على نسب منخفضة من الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) لتجنب تحفيز النشاط غير محدد من الدكتورP1. مع كميات أكبر من الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) في اللغة الإنجليزية كلغة ثانية، تم العثور على استخدام GFP صاحب الموسومة-كعنصر تحكم أن تكون حاسمة لحماية ني 2+ ومنع التفاعلات Drp1 غير محددة. بعد زخرفة SL الجسيمات الشحمية التي كتبها MFF أو GFP (كما هو موضح في الشكل 2)، ومدى التجميع الذاتي يمكن تقييم من خلال قياس النشاط GTPase من Drp1. في حالة عدم وجود الجسيمات الشحمية، Drp1 لها نشاط GTPase القاعدية منخفضة نسبيا، التي تتعزز بشكل طفيف إضافة SL. الديكور من هذه الجسيمات الشحمية سقالة مع MFF تعزيز النشاط GTPase (الشكل 4A، 1.8 أضعاف). على العكس من ذلك، عندما يتعرض الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) headgroups سدت مع GFP صاحب الموسومة، وذاب هذا النشاط GTPase زيادتها. اختبرنا أيضا دور Fis1، وهو بروتين OMM الذي اقترح أن يكون لها دور في الانشطار الميتوكوندريا 21،22، رغم أن هذا قد طعنت في الدراسات الحديثة 7،23. الربط من Fis1 تفتقر نطاق الغشاء لهالSL فشلت أيضا للحصول على تحفيز النشاط GTPase Drp1 في (الشكل 4A).
نحن ثم تستخدم سقالة الدهون قليلا أكثر تعقيدا تحتوي على كمية صغيرة من كارديوليين (SL / CL: SL مع 10٪ مول كارديوليين استبدال DOPC) لتحديد دور هذه الدهون الميتوكوندريا في تفاعل Drp1 وMFF. وقد تم اختيار هذا التركيز المعتدل كارديوليبين خصيصا للحد من التحفيز من Drp1 التي كتبها كارديوليين كما هو موضح سابقا (10). على غرار SL، أدت إضافة SL / CL إلى Drp1 في تحفيز طفيف في نشاط GTPase انعكس من خلال الربط صاحب الموسومة-Fis1 أو GFP إلى الجسيمات الشحمية. ولوحظ وجود تآزر بين MFF وكارديوليين مثل النشاط GTPase من Drp1 وقد حفز 2.6 أضعاف عندما حضنت مع زينت MFF-SL / CL (الشكل 4B).
سيولة الغشاء والقدرة سوقد اقترحت طبقات ثنائية الدهون لتعزيز النشاط GTPase لها و Drp1 لإعادة. لذلك، سعينا إلى دراسة تأثير غشاء سيولة / المرونة باستخدام الحويصلية سقالة مرنة. وقد تحقق ذلك من خلال استبدال 35٪ من مول DOPC في م / CL مع مخدر (م / PE / CL)، وهو ما ثبت في السابق للسماح-Drp1 بوساطة غشاء إعادة عرض 10. إضافة مزخرف SL / PE / CL الجسيمات الشحمية سقالة لDrp1 يعزز قليلا النشاط GTPase Drp1، والديكور من هذه الجسيمات الشحمية مع GFP يلغي هذا التأثير. عندما زينت SL قوالب / PE / CL مع MFF، تم تعزيز النشاط Drp1 (الشكل 4C، 2.4 أضعاف). كما بينا سابقا، تم تعزيز قدرة Drp1 لإعادة الجسيمات الشحمية في الأنابيب الدهون بإضافة PE إلى الجسيمات الشحمية سقالة. ومن المثير للاهتمام، أن هذا tubulation تحسنت مما أدى إلى تشكيل Drp1 البوليمر حلزونية لا يؤدي إلى أي تحفيز أكبر بالمقارنة مع الجسيمات الشحمية التي Drp1 لم تتمكن من إعادة تشكيلها باستخدام هذه القوالب الدهون القابلة للتكيف، تم العثور على MFF وDrp1 للتفاعل في بيئة أكثر الأم في المختبر. وقد مكنتنا هذه التقنية للسيطرة على الوفرة النسبية للDrp1، MFF (من خلال الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) التركيز)، والدهون محددة (كارديوليين وPE على وجه التحديد) التي ظهرت لتنظيم تجميع هذه الجزيئات المعقدة. كما أننا أظهرنا، ويمكن استخدام هذه الطريقة لتصور إعادة غشاء Drp1 تجنيد MFF عن طريق المجهر الإلكتروني، وتحديد الآثار التجمع Drp1 على النشاط الحفاز باستخدام فحص النشاط GTPase. 71fig4.jpg "/> 
الشكل 1: الدهن إعداد التخطيطي. (أ) عند إعادة تعليق، الجسيمات الشحمية من أحجام متنوعة تشكل وتتكون من unilamellar وmultilamelالحويصلات لار، مما يؤدي إلى حل مبهمة (الشكل). (ب) تجميد ذوبان نتائج الحل في عدد سكانها أكثر unilamellar من الجسيمات الشحمية، التي لا تزال غير متجانسة في قطر. تجميد لاذابة يوضح الحل (الشكل). (ج) بثق الحل الدهون تجانس قطر الحويصلية (1.0 ميكرومتر في هذا المثال)، والنتائج في حل واضح (الشكل). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2: طرق لتقييم تجميع البروتين. ويرد شريك التي تصور تجميع البروتين التخطيطي على الجسيمات الشحمية سقالة. يتم تحضين البروتينات شريك أو GFP له الموسومة مع الجسيمات الشحمية سقالة، ومن ثم يتم تحضين Drp1 مع يبو مزينة أو غير مزخرف somes. ومن ثم يمكن تحليل هذه الجسيمات الشحمية-مجمعة مسبقا Drp1 بالطرق الهيكلية (المجهر الإلكتروني) والمقايسات الفنية (GTPase فحص). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل (3): التقييم الإنشائي للDrp1 التوظيف. السلبية الميكروسكوب انتقال صمة GFP أو MFF زينت الجسيمات الشحمية وحدها (A، B، على التوالي) أو حضنت مع Drp1 (C، D، على التوالي). شريط مقياس = 100 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: سقالة الحويصلية الأنزيمية الفحص. (A - C) وقد تم قياس جيل من الفوسفات على مر الزمن (الشكل)، وتم تحديد القط ك. تم تطبيق هذا الأسلوب لبروتينات SL المربوطة (A)، SL / البروتينات CL المربوطة (B)، أو م / PE / البروتينات CL المربوطة (C). #: P <0.05، *: ع <0.0001، **: ص <0.000001 على النحو الذي يحدده T-اختبار الطالب أونبايريد ل. تمثل جميع أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من 3 عينات مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول وسيلة لتحقيق البروتين البروتين التفاعلات التي تنطوي على بروتينات الغشاء لا يتجزأ. من خلال الاستفادة من سقالة الحويصلية وحدات، والمحققين قادرون على تقييم نشاط البروتينات واحد أو أكثر في بيئة الدهون القريب. وقد أظهرت دراسات سابقة طريقة مماثلة للأنزيمات مستقبلات غشاء البلازما 24-26. قمنا بتوسيع هذا الأسلوب لدمج العوامل المساعدة الدهون واستكشاف التفاعلات بين البروتينات التي تشكل جوهر mechanoenzymatic الآلية الانشطار الميتوكوندريا.
لنظام النموذج المقدم أعلاه، وجدنا أن زينت MFF-SL تعزيز Drp1 التجميع الذاتي. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا الآن أن القوالب ESL زينت MFF وكان تشكيلها بكفاءة عن طريق النوع البري Drp1 لتشكيل هياكل أنبوبية الموسعة. نحن أيضا بتقييم أدوار مختلفة الدهون الميتوكوندريا، بما في ذلك كارديوليين سالبة الشحنة والدهون PE مخروطي الشكل.كارديوليين تنسجم مع MFF لتعزيز Drp1 التجميع الذاتي، في حين أن مرونة الغشاء وسيولة الكشف عنها من قبل المؤسسة العامة يعزز غشاء tubulation ولكن لا تزيد مزيد من التحفيز MFF التي يسببها.
لتقييم التغيرات التركيبية في الأشكال التضاريسية الغشاء، EM كان مطلوبا التحليلات. تم رفع النشاط GTPase Drp1 من خلال تجميع وتركيب البوليمرات الخيطية التي لم إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية إلى أي حد كبير 2. ومع ذلك، لوحظ غشاء تشوه عندما تم استخدام أكثر الميتوكوندريا مثل SL قالب / PE / CL. ومن المثير للاهتمام، لم تعزز من نشاط انزيم. ولذلك، فإن الدراسات EM الأساسية في تحديد الاختلافات الرئيسية التي لولاها تضيع باستخدام فحص وظيفي.
في حين أن هذا الأسلوب هو قوية لاستكشاف وظيفة والتفاعل من بروتينات قابلة للذوبان والمجالات البروتين القابلة للذوبان، وهذه السقالات الدهون ليست بقادرة على دور نطاق الغشاءالصورة. هذا اعتبار مهم لأن المجال عبر الغشاء يمكن أن تؤثر على العمليات الحيوية البروتين مثل التجميع الذاتي 27 ونشرها الجانبي 28-30 في طبقات ثنائية الدهون. وإذا كانت هذه العوامل هي حاسمة لتقييم تفاعلات البروتين على سطح الغشاء، والتجارب الدهون إعادة ثم التقليدية مع المنظفات سيتم المفضلة. كما يمكن استكشاف الحبال بديلة للسيطرة على تجنيد والتنقل من البروتينات غشاء الراسية.
بالإضافة إلى استخدام البروتينات صاحب الكلمات الدلالية مع الهيئة الوطنية للمواصلات (ني 2+) المراسي الدهون، الحبال الأخرى مثل 31 أو رد الفعل الدهون-مجموعة مترافق البيوتين مترافق يمكن استخدامها. أن أكثر ثابت البروتينات فخ على سطح الدهون، لكن القدرة على التنقل وتبادل هذه العوامل من المرجح أن تقلص هذه التعديلات التساهمية. على هذا النحو، ينبغي النظر في حبل بعناية في سياق مجمعات البروتين التي تجري دراستها. عندما consideدق استخدام هذا الأسلوب، وطريقة الربط البروتينات إلى قوالب الدهون لديها القدرة على التأثير على بعض المقايسات. على سبيل المثال، صاحب العلامة الربط إلى أسلوب الإدارة الوطنية للسياحة (ني 2+) قد يكون أكثر ملاءمة لفي المقايسات الموقع بدلا من تجارب الانفصال، وخاصة في حالة من البروتين البروتين التفاعلات عابرة. ويتجلى هذا بوضوح في الشكل (3) من التباين بين في الموقع السلبي المجهر وصمة عار الإلكترون وفحص الترسيب.
في المستقبل، وهو مزيج من اثنين أو أكثر من هذه الدهون مرساة مع headgroups هدف متميز يمكن تنفيذها للسماح للتجنيد من البروتينات متعددة إلى قالب سقالة دون التنافس على حبل الدهون واحد. وعلاوة على ذلك، فإن وفرة نسبية من كل عنصر يمكن أن تدار عن طريق تغيير تركيبة الدهون. العوامل المساعدة الدهون إضافية، مثل phosphoinositides، كارديوليين، وفسفاتيديل، ويمكن بسهولة أن قدمفي هذه القوالب لتقييم تأثير معزولة من مجموعة متنوعة من العوامل.
عموما، هذه الاطر الدهون تمثل منصة جديدة للتحقيق في التفاعلات البروتينية المعقدة بالقرب الأغشية الدهنية. هذه القوالب هي ولدت بسهولة وبسيطة للتكييف لمجموعة من التطبيقات المتنوعة، بما في ذلك فحوصات الأنزيمية، المجهر الإلكتروني، أو التصوير مضان. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تصاغ تكوين الدهون تشبه عضية أو غشاء microdomain التي تهم ألخص أفضل وظيفة البروتين في هذه المناطق المحددة. باستخدام هذه التقنيات، يمكن أن الكيمياء الحيوية تحقيق في التفاعلات المعقدة للغشاء ملزمة وغشاء البروتينات المرتبطة مع شركائها وبيئتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
