פרוטוקול זה מדגים בידוד איים Murine וזרע על פיגום decellularized. איים נתמך פיגומים הושתלו לתוך כרית שומן האפידידימלי של streptozotocin (STZ), המושרה עכברים סוכרתית. איים שרדו באתר ההשתלות והפכו את מצב ההיפרגליקמיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיגום נתמך השתלת איים בשומן השומן האפידידימלי של עכברים סוכרתית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
השתלת Islet הוכח קלינית להיות יעיל בטיפול סוכרת סוג 1. עם זאת, האסטרטגיה הנוכחית השתלת intrahepatic עלול לגרום לתגובות דם שלמים חריפים ולגרום engraftment איון עני. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול איתן להשתלת איים באתר ההשתלות האקסטרפטית - משטח השומן האפידידימלי (EFP) - במודל עכבר סוכרתי. פרוטוקול לבודד ולטהר איים בתפוקה גבוהה של עכברים C57BL / 6J מתואר, כמו גם שיטת השתלת מבוצע על ידי זריעת איים על גבי פיגום decellularized (DCS) ו השתלת אותם באתר EFP בעכברים C57BL / 6J סינתטי שניתנו סוכרת על ידי streptozotocin. השתל DCS המכיל 500 איים הפך את מצב היפרגליקמיה בתוך 10 ימים, בעוד איים חופשי ללא DCS נדרש לפחות 30 ימים. הנורמוגליקמיה נשמרה עד 3 חודשים עד שהשתלפה. לסיכום, DCS שיפרה את engraftment של איים לתוך tהוא אתר extrahepatic של EFP, אשר יכול בקלות להיות מאוחזר עשוי לספק פלטפורמה לשחזור ושימושי לחקר חומרים פיגומים, כמו גם פרמטרים השתלה אחרים הנדרשים engraftment איון מוצלח.
מבוא
סוג 1 סוכרת (T1D) היא הפרעה אנדוקרינית אוטואימונית שבה תאי איון הם ablated על ידי המערכת החיסונית, וטיפול בחולים תלוי הזרקת אינסולין אקסוגני לכל חייהם. פרוטוקול אדמונטון מהווה ציון דרך במחקרים קליניים על השתלת איון; איים היו infused דרך הווריד הפורטל והושתלו באתר intrahepatic 1 . עם זאת, שני מכשולים עיקריים - מקורות לא מספיקים של איים התורם ואת engletment איון המסכן, למנוע את ההצלחה הגדולה של השתלת איון 2 . בדרך כלל, איים צריכים להיות שנאספו משלושה תורמים cadaveric כדי להפוך את מצב hyperglycemic של חולה אחד; זאת בשל התשואה הנמוכה של הליכי בידוד איון ואת איון הפסד לאחר ההשתלה. בפרט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת פקין טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC, IACUC לא COE-LuoY-1).
1. בידוד Islet
- הכנה של ריאגנטים וציוד.
- אבקת collagenase מחדש (2 U / mg) ב HBSS לעשות פתרון 5 מ"ג / מ"ל לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את החיידקים. הכן 0.6 מ"ל aliquot פתרונות של קולגן P ב 15 צינורות מ"ל חרוטי לחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: במ....
- אבקת collagenase מחדש (2 U / mg) ב HBSS לעשות פתרון 5 מ"ג / מ"ל לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את החיידקים. הכן 0.6 מ"ל aliquot פתרונות של קולגן P ב 15 צינורות מ"ל חרוטי לחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השיטה שלנו clamping, המבוצעת באמצעות מהדק הרדמה מיקרוסקופיים, הוא פשוט וחוסך זמן לעומת טכניקה קשירת תפר. זה לקח בערך 4 שעות כדי לבודד ולטהר כ 1,200 איים מ 6 עכברים. איים מבודדים טרי בדרך כלל היה פריפריה מחוספס תחת מיקרוסקופ אופטי ( איור 3 א ). לאחר שהאיילים התאוששו מתהליך הבידוד, הם נראו בהירים ודוקים ורכשו משטח חלק. עם זאת, הבידוד מלחיץ עדיין יכול לגרום למוות התא, וכתוצאה מכך השתילה של תאים ממשטחי איון, איים בריא לעתי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לבלב הלבלב זמן העיכול הם שני פרמטרים מרכזיים המשפיעים על התשואה איון ואיכות. Moskalewski הראשון דיווח על שימוש בתערובת collagenase גולמי לעכל טחון הלבלב גינס 11 . Lacy et al. דיווחו על הזרקה של אנזימים למערכת צינורית כדי לבלבל את הלבלב, אשר הגדילו מאוד את התשואה איון 12 . זלוף צינורית של אנזים מאפשר חשיפה מקסימלית של שטח פני הלבלב לאנזים, וכתוצאה מכך עיכול הומוגני יותר שחרור גדול יותר של איים שלם לעומת לעיכול לבלב טחון
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות ויי ג 'אנג מ Guanhao ביוטק למתן את הפיגומים decellularized. אנו מודים ל- Xiao-hong Peng על השיחות המועילות. מחקר זה נתמך מבחינה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (פרויקט מס '3212021).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חיתוך מספריים | Ningbo מלקחיים רפואיים | ||
| Ningbo רפואי | |||
| קוטר 0.5 מ"מ רשת תיל | Ningbo Medical | ||
| 70 μ מסננת תאים | m Falcon | 352350 | |
| מהדק המוסטטי עורק | Ningbo רפואי | ||
| מיקרוסקופי מהדק המוסטטי | Ningbo רפואי | ||
| מלקחיים המוסטטיים | Ningbo רפואי | ||
| נספג 6-0 תפרי PGLA | JINHUAN | עם | |
| קליפ פצע | Ningbo צמר | ||
| Ningbo | |||
| וילונות סטריליים רפואיים | |||
| 10 מ"ל מזרק | JINGHUAN | ||
| 1 מ"ל | JINGHUAN | ||
| מחט תוך ורידית 27G | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 מ"ל צינור אפנדורף | Axygen | ||
| 15 מ"ל צינור חרוטי | קורנינג | 430791 | |
| 50 מ"ל צינור חרוטי | קורנינג | 430829 | |
| 35 מ"מ לא מטופל צלחות פרי-צלחות | קורנינג | 430588 | |
| טרנסוול | קורנינג | 3422 | |
| 0.22 μ m filter | Pall | PN4612 | |
| 10 מ"ל פיפט סרולוגי | קורנינג | 4488 | |
| מילוי פיפט S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| פיפטה (2-20μ L) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| מיקרוסקופ חיתוך | אולימפוס | SZ61 | |
| צנטריפוגה | Eppendorf | 5810R | |
| Hank' תמיסת מלח מאוזנת | Gibco | C14175500CP | |
| קולגנאז P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| מד סוכר | Roche | ACCU-CHEK | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | |
| סטרפטוזוטוצין | סיגמא | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J& K | C0073 | |
| נתרן ציטראט | סיגמא | 71497 | |
| חומצת לימון | סיגמא | C2404 | |
| יודופורס | נינגבו רפואי | ||
| C57BL / 6J, בן 10-12 שבועות | VitalRiver | בייג'ינג, סין | |
| פיגום נטול תאים | Guanhao Biotec | 131102 | גואנגג'ואו, סין |
מקורות
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
