Summary
פרוטוקול זה מדגים בידוד איים Murine וזרע על פיגום decellularized. איים נתמך פיגומים הושתלו לתוך כרית שומן האפידידימלי של streptozotocin (STZ), המושרה עכברים סוכרתית. איים שרדו באתר ההשתלות והפכו את מצב ההיפרגליקמיה.
Abstract
השתלת Islet הוכח קלינית להיות יעיל בטיפול סוכרת סוג 1. עם זאת, האסטרטגיה הנוכחית השתלת intrahepatic עלול לגרום לתגובות דם שלמים חריפים ולגרום engraftment איון עני. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול איתן להשתלת איים באתר ההשתלות האקסטרפטית - משטח השומן האפידידימלי (EFP) - במודל עכבר סוכרתי. פרוטוקול לבודד ולטהר איים בתפוקה גבוהה של עכברים C57BL / 6J מתואר, כמו גם שיטת השתלת מבוצע על ידי זריעת איים על גבי פיגום decellularized (DCS) ו השתלת אותם באתר EFP בעכברים C57BL / 6J סינתטי שניתנו סוכרת על ידי streptozotocin. השתל DCS המכיל 500 איים הפך את מצב היפרגליקמיה בתוך 10 ימים, בעוד איים חופשי ללא DCS נדרש לפחות 30 ימים. הנורמוגליקמיה נשמרה עד 3 חודשים עד שהשתלפה. לסיכום, DCS שיפרה את engraftment של איים לתוך tהוא אתר extrahepatic של EFP, אשר יכול בקלות להיות מאוחזר עשוי לספק פלטפורמה לשחזור ושימושי לחקר חומרים פיגומים, כמו גם פרמטרים השתלה אחרים הנדרשים engraftment איון מוצלח.
Introduction
סוג 1 סוכרת (T1D) היא הפרעה אנדוקרינית אוטואימונית שבה תאי איון הם ablated על ידי המערכת החיסונית, וטיפול בחולים תלוי הזרקת אינסולין אקסוגני לכל חייהם. פרוטוקול אדמונטון מהווה ציון דרך במחקרים קליניים על השתלת איון; איים היו infused דרך הווריד הפורטל והושתלו באתר intrahepatic 1 . עם זאת, שני מכשולים עיקריים - מקורות לא מספיקים של איים התורם ואת engletment איון המסכן, למנוע את ההצלחה הגדולה של השתלת איון 2 . בדרך כלל, איים צריכים להיות שנאספו משלושה תורמים cadaveric כדי להפוך את מצב hyperglycemic של חולה אחד; זאת בשל התשואה הנמוכה של הליכי בידוד איון ואת איון הפסד לאחר ההשתלה. בפרט, למרות שאיים שלאחר ההשתלה היו שטופים דם עשיר בחמצן, המגע הישיר עם הדם עורר לעיתים קרובות את הדלקת המייצרת דם מיידיתתגובה של טורי (IBMIR), אשר עלולה לגרום לאובדן חריף של האיים. בטווח הארוך, נראה כי ההפסד ההדרגתי של איים בחולים היווה ירידה של שיעורי היפוך הסוכרת בקבוצות הקליניות, אשר יכול להגיע ל 90% בשנה הראשונה ו ירד ל 30% ו 10% על ידי 2 ו 5 שנים לאחר ההשתלה, בהתאמה 3 .
השתלת Islet באתרים extrahepatic כבר אסטרטגיה אטרקטיבית כדי להפחית את הקשר הישיר של איים עם דם תוך הגבלת השתלות למיקומים מוגדרים יותר לעומת עירוי intrahepatic. מחקרים בוצעו בקפסולת הכליה, העין, השרירים, רפידות השומן וחללים תת-עוריים במהלך השנים האחרונות, מה שמראה כי איים באתרים אלה מסוגלים לשרוד ולתפקד כדי לשחזר את הנורמוגליזציה 4 . בנוסף, איים באתרים אלה הם לשחזור, מה שמאפשר ביופסיה או אפילו להליכי החלפת נוספים. אקסטרהפטיתזה ולכן להפגין פוטנציאל גדול להשתלה קלינית 5 .
Biomaterials מבוססי פיגומים נבדקו באופן אינטנסיבי עבור השתלת תאים והנדסת רקמות. תלת מימדי (3D) פיגומים בדרך כלל מכילים מבנים נקבובי יכול לשמש תבניות הסלולר כדי ליצור מבנה מרחבי / ארגון של תאים או מאגרים לספק שחרור מבוקר של רמזים ביו. פיגומים יש גם מפוברק מחומרים פולימריים, כגון פולי (glycolide-L- לקטט) 6 , פולי (dimethylsiloxane) 7 , ו תרמופלסטיים פולי (urethane) 8 , כדי להשתלות איים EFP. בהשוואה להשתלה ישירה של איים, השימוש פיגומים נמצא להפחית את איים הפסד על ידי מניעת דליפה של איים לתוך חלל intraperitoneal 9 , 10 , מתן הגנה מכנית moduמניעת תגובה דלקתית מקומית. פיגומים ובכך ניתן יהיה לפתח לקדם engraftment איון באתרים להשתלה 7.
במחקר זה, אנו מתכוונים להפגין פרדיגמה של השתלת איון ב EFP, מתבצעת מודלים עכברים באמצעות DCS. פיגומים נגזר מטריצות תאיים משכו עניין רב בשנים האחרונות בשל biocompatibility מעולה מבנים נקבוביים טבעיים יותר לעומת מוצרים סינתטיים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול בידוד חזק כדי להשיג איים הלבלב בתשואות גבוהות של עכברים C57BL / 6J. DCSs מעובד מן קרום הלב קרום זרעו אז עם איים, ואת השתלות הושתלו EFP במודלים סוכרתית סינרגנית. נורמוגליקמיה בעכברים הושגה בתוך 10 ימים ונשמרה עד 100 ימים, עד להסרת השתלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת פקין טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC, IACUC לא COE-LuoY-1).
1. בידוד Islet
- הכנה של ריאגנטים וציוד.
- אבקת collagenase מחדש (2 U / mg) ב HBSS לעשות פתרון 5 מ"ג / מ"ל לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את החיידקים. הכן 0.6 מ"ל aliquot פתרונות של קולגן P ב 15 צינורות מ"ל חרוטי לחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
הערה: במהלך השימוש, כל aliquot הוא מדולל עם HBSS לתת 6 מ"ל פתרונות עבודה עם ריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל, או 1 U / מ"ל (מספיק לטיפול 3 עכברים). הפתרון עובד נשמר על קרח לשימוש מיידי תוך 1 שעות. פתרון העבודה לא צריך להיות משוחזר או להקפיא מחדש לשימוש נוסף. - הכן פתרון ניטרול על ידי הוספת FBS (2.5%) ו P / S (1%) לתוך HBSS; לשמור על הפתרון על הקרח. הכן 60 מ"ל של פתרון נטרול כדי טהT 6 עכברים.
- עבור בינוני תרבות איון, להוסיף D גלוקוז (7 מ"מ), FBS (10%), ו P / S (1%) כדי RPMI 1640 בינוני.
- החיטוי כלי הניתוח על 115 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו 15 psi של לחץ.
- אבקת collagenase מחדש (2 U / mg) ב HBSS לעשות פתרון 5 מ"ג / מ"ל לסנן אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר את החיידקים. הכן 0.6 מ"ל aliquot פתרונות של קולגן P ב 15 צינורות מ"ל חרוטי לחנות ב -20 מעלות צלזיוס.
- האינפלציה של הלבלב.
- הכן 12 מ"ל של פתרון העבודה collagenase, כמפורט בשלב 1.1.1, עבור 6 עכברים (12 שבועות). ממלאים את מזרק 10 מ"ל עם 9 מ"ל של פתרון עובד לחבר את המזרק למחט 27 G תוך ורידי. לאחסן את המזרק על הקרח ולהשתמש פתרון תוך 1 שעות.
- להרדים את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. מניחים את העכבר במצב שכיבה על מגבת נייר, עם הזנב הצביע לעבר המפעיל. לרסס את כל הגוף עם אתנול 70%, מה שהופך אותו רטוב לגמרי.
- בצע V- חתך, החל מאזור איברי המין והרחבת הסרעפת, באמצעות מספריים לנתיחה ומלקחיים. מקפלים את העור על החזה כדי לחשוף לחלוטין את חלל הבטן.
- מהלך לזוז לעבוראת המעיים בצד ימין של העכבר לחשוף את הלבלב ואת צינור המרה המשותף. תפוס את התריסריון בזהירות עם מלקחיים ולמשוך אותו עד צינור המרה הוא מתוח ( איור 1A -1 ו- A-2 ).
- מצא את הווריד הפורטל ואת צינור המרה מוביל לכבד. מהדק את הווריד הפורטל ואת צינור המרה עם מהדק עוצר דופק מיקרוסקופי.
הערה: הידוק מונע דימום מוגזם והכניסה של קולגנאז לתוך הכבד. - בעוד עדיין מחזיק את המעי עם מלקחיים, למצוא את המיקום של ampulla שמחבר את צינור המרה ואת התריסריון. הכנס את המחט תוך ורידי 27G לתוך צינור המרה המשותף דרך ampulla ( איור 1B -1 ו- B-2 ).
- לוותר על 200 μL של פתרון עבודה collagenase לבדוק אם cannulation הוא כל הדרך דרך צינור המרה. אם הפתרון collagenase מתחיל למלא את צינור ( 1 ו- C2 ), המחט נמצאת בלום של הצינור; מהדק את קטע צינור המכיל את המחט באמצעות מהדק עורק המוסטטי ו לוותר על שאר 2 מ"ל של פתרון בקצב איטי קבוע בתוך דקות 1 ( איור 2 א -1 , A-2 , ו- B-1 ).
הערה: אם הרקמה המקיפה את הצינור מתחיל לנפח ( איור 2 ב -2 ), המחט יש poked דרך הקיר של צינור המרה, מה שהופך אותו הכרחי כדי למקם מחדש את המחט ולנסות cannulating את צינור המרה שוב. באופן דומה, אם תריסריון מתחיל לנפח ( איור 2C -1 ו- C-2 ), עורק ההמוסטטי עורק צריך להיות מותאם הצינור המרה מחדש cannulated. כמו הפתרון collagenase ממלא את הלבלב, הרקמה ליד התריסריון מתנפח הראשון, ואחריו regioליד זנב הלבלב. זלוף של זנב הלבלב (האונה הטחול) חשוב כדי למקסם את התשואה איון. - לאחר האינפלציה המלא של הלבלב ( איור 2C -1 ), לדחוף את המעיים בצד שמאל של העכבר ולהסיר את הלבלב על ידי הפעלת המעי הגס יורד. השתמש במלקחיים כדי להרים את המעיים ולהפריד אותו מהלבלב עם עוד זוג מלקחיים. ממשיכים להסיר את הלבלב עד שהוא אינו מחובר מהחלק העליון של הבטן. לבסוף, להרים את הלבלב מתוך הבטן לחתוך אותו ללא טחול הנותרים.
הערה: ההפרדה כולה צריכה להתבצע במהירות, כמו העיכול נמשך במהלך תהליך ההסרה. - מניחים את הלבלב בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ריק ולהשאיר אותו על הקרח. חזור על ההליך לעיל עבור העכברים הנותרים. כל הלבלב צריך להיות מעובד עוד תוך 1 שעות על ידי מיד לאחר שלב 1.3 כדי למנוע עיכול יתר על ידי קולגן P < / Li>
איור 1: תמונות המציגות את cannulation של צינור המרה ואת זלוף הלבלב עם פתרונות collagenase. ( A1 ) משיכת התריסריון עד צינור המרה הוא מתוח. (Ampulla: אזור משולש חלבי על פני התריסריון, צינור המרה: מבנה החלב דמוי חוט כמו על פני השטח). ( B1 ) הכנסת המחט לצינור המרה מן האמפולה. ( C1 ) ניפוח הלבלב עם הזרקה של אנזים. ( A2, B2 ו- C2 ) תמונות מצוירות של הפרוצדורות המוצגות ב- A1, B1 ו- C1, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
O: keep-together.within-page = "1"> 
איור 2: פתרון בעיות עבור הקנולה. ( A1 ) קצה המחט מוכנס לומן של צינור המרה. ( A2 ) צינור מלא פתרונות אנזים. ( B1 ) המחט מוכנס לומן של צינור המרה, ואת צינור מלא צבע כחול. ( B2 ) בשל cannulation לא הולם, המחט היא מתחת צינור המרה, ורק קפסולה מנופח הוא ציין לאחר מחלק את הצבע הכחול. ( C1 ) cannulation מוצלח ניכרת על ידי distension של הלבלב. ( C2 ) בשל clamping לא הולם, צבע כחול נכנס התריסריון גורם להתפוצצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- <חזקה> עיכול וטיהור של איים.
- דגירה צינורות חרוטי המכיל את הלבלב perfused ב 37 מעלות צלזיוס במשך 17 דקות.
הערה: זמן הדגירה עשוי להשתנות עם הגיל והמין של החיה. - סיים את העיכול על ידי הוספת 7 מ"ל של פתרון נטרול לשים את הצינורות על הקרח.
- לנתק את הרקמה על ידי טלטול צינורות בצורה נמרצת ( למשל, 20 פעמים ב 10 שניות) עד חלקיקי רקמה דקה מתקבלים.
הערה: תשואה איון יהיה נמוך אם הלבלב נכשל לנתק לחלוטין. - סינון דגימות הרקמות מתעכל באמצעות 0.5 מ"מ רשת תיל להסיר כל נתחי רקמות לא מתעכל. לאסוף את המתלים איון בצינור חרוטי 50 מ"ל חדש.
- צנטריפוגה צינורות דקות 3 ב 230 xg ו 4 ° C ויוצקים את supernatant בזהירות, מבלי להפריע את כדורי רקמות.
- Resuspend את כדורי מ 3 עכברים ב 4 מ"ל של שיפוע צפיפות polysucrose ידי vortexing בעדינות או pIpetting ההשעיה מעלה ומטה כמה פעמים. לאט פיפטה 4 מ"ל של HBSS בצד של הצינור לחלק העליון של פתרונות polysucrose.
הערה: שני הפתרונות צריכים להיות שכבות מופרדות היטב עם ממשק חד.
הערה: תוספת של HBSS צריכה להתבצע בזהירות, מבלי להפריע לצפיפות הצפיפות של פוליסקרוז בתחתית. - צנטריפוגה ההשעיה במשך 20 דקות ב 900 xg ו 4 ° C על ידי בחירת קצב האצה איטי מאוד. סוף צנטריפוגה בלי בלם.
הערה: זהו צעד כדי לטהר את איים מן התאים אקסוקרינית, עם רוב האיים נודדים לממשק בין שכבות של polysucrose ו- HBSS ואת רוב התאים אקסוקרינית להתיישב בתחתית. - הסר את מלוא הפתרונות של 8 מ"ל supernatant באמצעות פיפטה גדולה 15 מ"ל. לעבור את הפתרונות באמצעות מסננת 70 מיקרומטר הפוך.
הערה: האיים יהיה מטוהרים נוספת נשמר על ידי מסננת, בעוד התאים אקסוקריניתיעבור דרך המסנן.
זהירות: שיפוע צפיפות polysucorse הוא רעיל התא; הסינון יעזור איים להיפטר polysucrose. - פיפטה 2 מ"ל של פתרון נטרול קר לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ. להפוך את מסננת התא בצד ימין למעלה, לטבול את פני השטח שמירה על איים בפתרון, בעדינות ללחוץ כדי לשחרר את האיים.
- יד לבחור את האיונים תחת מיקרוסקופ באמצעות פיפטה 20 μL עם קצה לבן.
הערה: האיים הם צהבהבים, אגרגטים תא קומפקטי ( איור 3 א ), בעוד רקמה אקסוקרינית מזוהמת או תאים יש מבנה שחור ו רופף תחת מיקרוסקופ לנתח. - מקום על 200 איים בצלחת 35 מ"מ עם 2 מ"ל של המדיום תרבות ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס בחממה מסופק עם 5% CO 2 במשך 12 שעות.
הערה: בדרך כלל 150-300 איים ניתן לקצור אחד העכבר בן 12 שבועות C57BL / 6J. איים נוטים להרכיב אגרגטים במהלך התרבות,ואת איים גדולים (> 300 מיקרומטר) רגישים נמק מרכזי ( איור 1B , inset). לנער את ההשעיה היטב כדי להפיץ באופן שווה את איים בצלחת ולהקטין clumping.
- דגירה צינורות חרוטי המכיל את הלבלב perfused ב 37 מעלות צלזיוס במשך 17 דקות.
2. תרבות Islet על הפיגום
הערה: DCS יש נקבוביות של כ 79%, עובי של 0.6 מ"מ, ואת גודל הנקבוביות הנעות בין 12 ל 300 מיקרומטר.
- חותכים את הפיגומים לתוך דיסקים 7 מ"מ, להשרות אותם באתנול 70%, ולשטוף אותם עם HBSS. מניחים את הפיגומים של 24-היטב מוסיף תרבות רקמה.
הערה: כאשר איים טריים הם התאושש לאחר תרבות לילה, האיונים נראים בהירים ודוקים, עם גבולות חלקים ( איור 3 ב ). - מערבולת את המנה ולאסוף את האיונים ממרכז המנה באמצעות פיפטה 20 μL עם קצה לבן. מעבירים את האיונים על פיגומים (250 איים / פיגום) באמצעות פיפטה ולהוסיף 2 מ"ל של המדיום תרבות כדיהבאר. תרבות האיים עבור 12 שעות לפני ההשתלה.
3. איים השתלה באתר EFP
- סוכרת אינדוקציה בעכברים הנמען.
- מקום C57BL / 6J עכברים (יותר מ 10 שבועות הישן) בכלוב טרי עם אספקת מים, אבל לא אוכל. מהר את העכברים במשך 10 שעות לפני אינדוקציה של סוכרת.
- הכן פתרונות חיץ עם ערכי pH של 4.2-4.5 על ידי ערבוב 0.1 M חומצה ציטרית עם 0.1 M ציטרט ציטרט. ממיסים STZ (10 מ"ג / מ"ל) במאגר מוכן טרי לעקר את הפתרון על ידי passaging אותו באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: STZ הוא רגיש לאור ומאבד פעילות בתוך 10 דקות; תמיד להכין את הפתרון STZ טריים ממש לפני ההזרקה. - להזריק כל עכבר intraperitoneally עם STZ במינון של 140-150 מ"ג / ק"ג עבור כל עכבר C57BL / 6J.
הערה: המינון משתנה בהתאם לגיל ולמין של החיה. מומלץ לבצע מינון קטן בקנה מידה מינון teSt עבור המין נתון לפני תחילת הניסוי הרשמי. - לאסוף את הדם וריד זנב לפקח על רמת הסוכר בדם עם מטר גלוקוז על ימים 2, 3, ו 4 שלאחר הזרקה STZ.
הערה: כאשר בעלי החיים הם hyperglycemic (שאינו צום גלוקוז בדם) 16.7 מ"מ) על שני ימים רצופים, הם מוכנים להשתלת איון.
- השתלת איים לאתר EFP.
- להרדים את העכברים עם pentobarbital נמסר intraperitoneally (50 מ"ג / ק"ג). מניחים את העכבר במצב שכיבה על מגבת נייר, עם הזנב הצביע לעבר המפעיל. לגלח את הבטן בהרחבה כדי להסיר את הפרווה מסביבת החתך באתר. קלטת את ארבעת הגפיים ואת ספוגית העור לחלוטין עם אלכוהול לסירוגין מגבונים יודופור נע בצורה מעגלית לעקר את האתר החתך. גרור את העכבר עם וילון סטרילי, רק מאפשר גישה לאזור החתך. לעשות חתך 7 מ"מ דרך הקיר פריטוניאלי בקו האמצע, קרוב לאזור איברי המין.
הערה: כל המכשירים המשמשים במהלך הניתוח, כולל כפפות, צריכים להיות סטריליים. - בעדינות לתפוס ולהסיר את EFP מחלל הבטן באמצעות מלקחיים. מורחים את EFP על גזה סטרילי רטוב. מניחים את איים המכילים פיגום על EFP ולקפל את EFP לעטוף את ההשתלה. Secure את הקשר הישיר בין איים EFP ידי suturing EFP עם התפרים 6-0 absorbable. הרטב את פני השטח של EFP עם מלוחים סטרילית באמצעות ספוגית כותנה ספוגה כדי למנוע EFP מ ייבוש החוצה.
- בעדינות במקום EFP בחזרה חלל הבטן. סגור את החתך על ידי suturing הקיר הצפק clamping את שכבת העור עם קליפים הפצע.
- להזריק buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) תת עורית כמו משכך כאבים.
- להזריק 1 מ"ל של תת מלח תת עורית כדי למנוע התייבשות.
- מניחים את העכבר בכלוב על כרית חימום עד העכבר משחזרת מן ההרדמה.
- בדוק את הגלוקוז הלא צום leVels כעבור יומיים על ידי איסוף דם מן הווריד הזנב. אם לאחזר את השתל, לחזור על הליכי ההשתלה הנ"ל, בעדינות לשלוף את EFP, להשתמש תפר 3-0 לקשור את קצה כרית שומן צמוד לאפידידימיס, לכסות את כלי הדם, explant השתל EFP, ולשמור אותו עבור היסטולוגיה .
הערה: Explanting את האיים צריך להבהיר את עכברי הנמען hyperglycemic שוב תוך 3 ימים, המאשר את הפונקציה של השתל.
- להרדים את העכברים עם pentobarbital נמסר intraperitoneally (50 מ"ג / ק"ג). מניחים את העכבר במצב שכיבה על מגבת נייר, עם הזנב הצביע לעבר המפעיל. לגלח את הבטן בהרחבה כדי להסיר את הפרווה מסביבת החתך באתר. קלטת את ארבעת הגפיים ואת ספוגית העור לחלוטין עם אלכוהול לסירוגין מגבונים יודופור נע בצורה מעגלית לעקר את האתר החתך. גרור את העכבר עם וילון סטרילי, רק מאפשר גישה לאזור החתך. לעשות חתך 7 מ"מ דרך הקיר פריטוניאלי בקו האמצע, קרוב לאזור איברי המין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה שלנו clamping, המבוצעת באמצעות מהדק הרדמה מיקרוסקופיים, הוא פשוט וחוסך זמן לעומת טכניקה קשירת תפר. זה לקח בערך 4 שעות כדי לבודד ולטהר כ 1,200 איים מ 6 עכברים. איים מבודדים טרי בדרך כלל היה פריפריה מחוספס תחת מיקרוסקופ אופטי ( איור 3 א ). לאחר שהאיילים התאוששו מתהליך הבידוד, הם נראו בהירים ודוקים ורכשו משטח חלק. עם זאת, הבידוד מלחיץ עדיין יכול לגרום למוות התא, וכתוצאה מכך השתילה של תאים ממשטחי איון, איים בריא לעתים קרובות הכיל ליבה כרונית כהה ( איור 3 ב ). מדדנו את הקוטר של 945 איים מ 5 עכברים; קוטר מחושב איון קוטר היה 130.42 ± 41.75 מיקרומטר ( איור 3 ג ).
כדי למנוע את החיסון של הנמען דחייה, ביצענו השתלת syngeneic בעכברים C57BL / 6J. בדרך כלל, 500 איים DCS עמוסות הושתלו לאתר של EFP והפך את היפרגליקמיה בתוך 10 ימים, לעומת 30 ימים שנצפו בקבוצת איון חופשי. הנורמוגליקמיה נשמרה במשך כ -100 ימים, עד לאחזור ההשתלות ( איור 3 ). האיים הטעונים התפשטו באופן שווה ב- DCS וכיסו אותם על ידי EFP. DCS עמוס איון יכול גם להיות מטופלים בקלות באמצעות מלקחיים ( איור 3E ו 3F ). המחקר ההיסטולוגית הראה כי איים מבוזרים באופן שווה היו revascularized ומוקף הרקמה EFP ו DCS לאחר השתלת במשך 60 ימים ( איור 3G ). Immunostaining של האינסולין עוד אישר engraftment מוצלח של איים ( איור 3H ).
Xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 54995 / 54995fig3.jpg "/>
איור 3: השתלת איים נתמכים פיגומים לאתר EFP. ( א ) תמונה נציג של איים טריים מבודד מעכברים. ( ב ) איים מתורבת במשך 12 שעות, עם תאים מתים sloughing את משטח האיון. הבלעה: איים לא בריאים יש ליבה כהה, נמק. ( ג ) התפלגות גודל של 945 איים מ 5 עכברים. ( ד ) רמת הסוכר בדם שאינה צומחת של עכברי הסוכרת המושתלים באיים התומכים ב- DCS ובאיים חופשיים. החץ השחור מציין כי השתל נלקח בנקודת זמן זו. ( ה ) תצלום המראה את העברתו של איגום עמוס פיגום על פני השטח של רקמת EFP להפיץ. ( F ) נציג שלב בניגוד התמונה של DCS עמוס איון. הבלעה: תמונה אופטי של DCS, המוחזקים על ידי מלקחיים. ( G ) נציג היסטולוגית H & E תמונה שלאיים מושתלים, מוקף DCS ו- EFP, לאחר 60 ימים. ( H ) Immunostaining של איים נתמך DCS, explanted לאחר 60 ימים. סולם ברים = 150 מיקרומטר (A, B), 100 מיקרומטר (F), 500 מיקרומטר (G), ו 25 מיקרומטר (H). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לבלב הלבלב זמן העיכול הם שני פרמטרים מרכזיים המשפיעים על התשואה איון ואיכות. Moskalewski הראשון דיווח על שימוש בתערובת collagenase גולמי לעכל טחון הלבלב גינס 11 . Lacy et al. דיווחו על הזרקה של אנזימים למערכת צינורית כדי לבלבל את הלבלב, אשר הגדילו מאוד את התשואה איון 12 . זלוף צינורית של אנזים מאפשר חשיפה מקסימלית של שטח פני הלבלב לאנזים, וכתוצאה מכך עיכול הומוגני יותר שחרור גדול יותר של איים שלם לעומת לעיכול לבלב טחון 13 . מניסיוננו, הצינור המוצלח של צינור המרה והזיוף של הלבלב כולו היו תנאים מוקדמים לתפוקת איון גבוהה. הסיבה לכך היא הזנב הלבלב (האונה הטחול) למעשה מכיל את רוב האיים לעומת רקמת הלבלב קרוב התריסריון. ישנן שתי דרכים כדי cannulate הצינור המדווח בספרות: i) החדרת המחט קרוב לאתר הכבד תוך חסימת כניסת האנזים לתריסריון 13 , 14 ו -2) החדרת המחט קרוב לתריסריון תוך חסימת כניסת האנזים לתוך כבד 15 . כאן, אימצנו את הטכניקה האחרונה, אשר אינו מחייב כיפוף המחט או מיקומו מחדש של העכבר. חוקר מאומן היטב יכול לבצע את cannulation של 10 עכברים בתוך 40 דקות, כאשר בעקבות הפרוטוקול שלנו. זמן העיכול של הלבלב משתנה עם הגיל והמינים של העכברים. לבלב מעוכל יתר לייצר איים קטנים בלבלב תת מעוכל יש תאים acinar המצורפת איים. לכן חשוב לייעל את זמן העיכול כדי להשיג תשואות גבוהות של איים בריאים.
STZ הוא תרכובת אנטיביוטית אשר הורסת במיוחד תאי בטא וגורמת סוכרת בעכברים בתוך 3 ימיםSs = "xref"> 16. המינון משתנה עם זן העכבר הספציפי ואת צריכה להיות נקבעת על ידי טרום ניסויים. למיטב ידיעתנו, עכברי C57BL / 6J דורשים מינון נמוך יותר של STZ מאשר Balb / C עכברים. מנת יתר של STZ תגרום היפרגליקמיה חמורה להוביל למוות של בעלי החיים בתוך שבוע, בעוד מינון STZ לא מספיק מוריד את שיעור ההיארעות סוכרת.
EFPs הם רקמות וסקולריות מאוד נגיש בנוחות לניתוח באמצעות פרוצדורות פולשניות מינימלי. השתלת איים EFP הוא בדרך כלל יותר קל ובטוח יותר לעומת הקפסולה בכליות, עוד דיווחו בדרך כלל אתר להשתלת איון מודלים העכבר. בפרט, הכליה היא איבר חיוני ועדין לטפל; השתלת איים עלול להיכשל או בעלי חיים לא יכול לשרוד את הניתוח 4 . EFPs בעכברים דומים גם את שקיק omental בבני אדם. המחקר להשתלות EFP לא יכול רק להקל על שלנוההבנה של הסביבה רקמה מראש עבור איון הישרדות / פונקציה, אלא גם להניח את הבסיס לפיתוח הליכי השתלה קלינית 17 .
DCS המשמש במחקר זה נגזר קרום הלב קרום היה בעיקר עשוי קולגן. חומרים decellularized לא יכול להראות immunogenicity ויכול רק לגרום לתגובות דלקתיות קלה in vivo 18 . כאשר איים זרעו בתוך הנקבוביות של DCS, הפיגום הציע הגנה מכנית ומנע את איים מלהתקבץ יחד, מה שעלול להוביל נמק של איים. פיגום DCS המכיל את איים יכול להיות מטופל ישירות באמצעות מלקחיים, המאפשר העברה פסיכית של ההשתלה. הטבעת הפיגומים בתוך EFP גם הקטינה את דליפת האיונים לתוך פריטוניום, בניגוד איים חופשי מושתלים ללא פיגום 8 . לכן, DCS מספק distincיתרונות עבור השתלת איון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ויי ג 'אנג מ Guanhao ביוטק למתן את הפיגומים decellularized. אנו מודים ל- Xiao-hong Peng על השיחות המועילות. מחקר זה נתמך מבחינה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (פרויקט מס '3212021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45x15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
