Summary
腹部臓器移植、膵臓移植は早期グラフトの損失に最終的につながる重症虚血再灌流傷害関連付けられているグラフト損傷を開発する傾向があります。このプロトコルでは、これらの初期、劇物の被害解析に最適な非縫合腱を用いたマウス膵移植のモデルについて説明します。
Abstract
マウス モデル移植研究では、取り扱いが容易、明確に定義された遺伝的系統の多様性と分子プローブ ・試薬を生体内と同様実行の広い範囲の可用性を含むいくつかの利点があります。体外研究。様々 なマウスの移植モデルと私たちの経験に基づき、重症虚血再灌流傷害関連付けられている早期グラフト損傷のメカニズムを分析する目的でマウスの異所性膵移植モデルを開発しました。以前とは対照的縫合技術を使用して記述されているテクニック本について述べる非縫合腱を用いた新しいプロシージャ。
近年、マウスの全体的な成功率の以上 300 の膵臓移植を行った > 90% 成功率に記載されない前にマウス膵移植。移植を血行再建術このカフ以外縫合技術のバックボーンは 2 つの主要な手順で構成されています: (I) ポリエチレン ・ ポリアミド カフ以上受信者の船を引っ張ると円周の合字と (II) の上にドナーの容器を置くそれを修正、落葉受け側容器および第 2 周の合字を使用して修正します。高い開存率少ない血栓病変で内皮層の結果の結果の継続性、そして高い成功率。
このモデルでは、動脈の吻合は受信者の動物のすぼまり総頸動脈をドナー移植の腹部大動脈を取り出すによって実現されます。グラフトの静脈還流は、受信者のすぼまりの外頚静脈をグラフトの門脈を引っ張ってによって実現されます。この原稿は、詳細と臓器の回復と研究室を使用して正常に移植を行う顕微鏡のスキルを持つ研究者を可能にする器官の注入の手順の重要なステップを提供します。
Introduction
同時に腎臓・膵臓移植 (SPK) は、糖尿病と終了段階の腎疾患を患っている患者のケアの現在の標準を表します。巧妙な移植の長期インシュリン独立安定化または糖尿病性微小血管障害とより良い生活の質1も回帰に関連付けられた結果します。ただし、腎臓や肝移植などの他の一般的な固形臓器移植とは対照的膵移植、虚血再灌流障害 (IRI) になりやすい。最大 35% の報告された発生率移植だけでなく生存2,3も患者を危険にさらします。
微小循環障害、酸化ストレス増加式プロ炎症性サイトカインや接着分子の結果最終的に内皮活性化との整合性の損失すべてに起因しているこの非同種移植片の損傷4. これまでのところ、IRI の正確な分子メカニズムはほとんど分かっていないと器官から臓器を異なる場合があります。
生体外モデルを利用した主要な進歩にもかかわらず動物モデルの開発は、膵臓移植グラフトの IRI 関連付けられている変化に関与する分子メカニズムの知識を深めるために重要です。齧歯動物5,6、いくつかの膵臓移植モデルが開発されているが、1 つだけはマウス7で報告します。この要求の高い顕微鏡プロシージャは低い生存率 46% のアキレス腱。ただし、さまざまな分子解析ツールはそれらに適用することができますので、マウス モデルは移植関係の研究では、最適なモデルを表します。我々 は、子宮頸部異所性膵の新しい、再現性の高い技術を開発異なる臓器移植8,9,10マウスの広範な顕微鏡の経験に基づき、マウスの移植 > 非縫合腱を用いた 90% の成功率。この手法は、吻合関連の合併症を最小限に削減し、縫合モデル11と比較して高い成功率を達成することができます。これまでのところ、劉ら12で 1 つだけのマウス モデルと同様の成功率が記載されています。ただし、これまでこのモデルを使用して公開された研究がないです。
Protocol
同種免疫反応を避けるために、虚血再灌流傷害関連のグラフト損傷を厳密に調査するため、同系のドナー-受信者ペアを使わなければなりません。このプロトコルは、男性 C57BL6 (H2b) 10-12 週齢では 26 に 28 グラムの重量を量るマウスがサイズ一致ドナー-受信者ペアとして使用されました。すべての動物はバリア病原体の無料施設で収容された送受信に従って、「校長の研究室動物ケア」医療総合」ガイドのためのケアと使用の実験動物」国民の社会によって定式化されたヒューマン ・ ケア全米科学アカデミーによる準備し、健康の国民の協会 (NIH 文書番号 86-23 1985 を改訂) 刊します。オーストリア教育・科学・文化省は、この原稿 (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011) に記載されている実験を承認しました。
1. 膵の調達
- 腹腔注入キシラジン (5 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) (G) にある、27 g の針を使用してドナー動物を麻酔します。
- 電気シェーバーを使用して腹部の毛を剃る、テープの鎖で仰臥位で術野にマウスを修正します。
- 3 回クロルヘキシジンに浸したガーゼで術野をスクラブします。
- はさみを使用して二国間弓下拡張子を持つ正中腹部切開を実行します。慎重に滅菌綿棒で左に内臓を外在、湿らせたガーゼに包んでください。次の手順で腹腔内の最大の露出を提供する蚊クランプと頭側、xyphoid を持ち上げます。
- 19 G の針を使用して、生殖の 400 μ L 下大静脈 (IVC) にヘパリン投与の 1:4 ヘパリン ナトリウム塩化物溶液を注入します。針を除去した後、動物を安楽死させるデスメタルが大動脈の transecting によって。
- 軽く湾曲した先端の鉗子を用いた線維組織を分離することにより腹部大動脈上腸間膜動脈の起源と右腎動脈の間を解剖します。大動脈を弱体化させるし、8/0 絹糸を結紮でそれを縛る。
- Postpyloric 十二指腸と肝門部、肝十二指腸間膜を識別します。幽門結紮後胆管嚢胞性の管の入り口の下を分割し優しく解剖し、門脈を受信者で吻合部を実行するための十分な長さにできるだけ遠位トランセクトします。
- 湾曲した先端の鉗子を使用して、以前の合字から腹部大動脈を解剖ぶっきらぼう (1.6 の手順を参照してください)。湾曲した先端の鉗子を用いた傍大動脈組織を弱体化させる、8/0 シルクの合字とそれを結ぶし、ハサミ トランセクトします。
- バイポーラ鉗子を使用すると、腰椎に枝を凝固、血管吻合のために十分な長さを提供するために、ダイヤフラムにできるだけ密接にハサミで大動脈をトランセクトします。最後に、既に結ばれた左腎動脈上大動脈を縦断面します。
- 門脈から来る明確な排水があるまでは、腹部大動脈を介して順行性の方法で 4 ° C ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸灌流液 5 mL で 19 G 注射器で膵臓を灌流します。浮腫の形成を避けるために低圧を適用します。
注: は、回復したグラフトの暖かい虚血性劣化による任意のバイアスを避けるために高速かつ標準化された方法で 1.9 手順 1.5 を実行します。 - 滅菌綿棒を使って腹腔内に内臓を交換してください。
- Treitz 靱帯に到達するまで postpyloric 十二指腸と前進から段階的な膵臓を別湾曲した先端の鉗子を使用します。これらの手順については、膵臓と十二指腸の壁の間の無血管である膠原病領域を識別します。
- 膵臓と十二指腸との間のブリッジの船を分離するために湾曲した先端の鉗子を使用してこれらの領域を解剖ぶっきらぼう。各分離血管構造の周りを 8/0 絹糸を結紮を渡すし、それを結ぶ。
- 最後に、十二指腸の壁に向かってハサミで血管構造を縦断面します。同じファッションで腸間膜, 横行結腸と胃から膵臓を分離するのに 8/0 シルク縫合糸を使用します。
注: この手順の間、開口膵管は結紮します。
- はさみで切ると頭側胃を持ち上げて、胃と短い胃枝、脾臓から実行している胃脾の靭帯を識別します。回復したグラフトに接続されている脾臓を残します。
注: 移植加温を最小限にするため、継続的に 19 G の針で 10 mL の注射器を使用して、氷の上保存されている冷たいヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸灌流液で膵臓を灌漑します。 - 最後に、鉗子、脾臓をつかんでドナーサイト (図 1 b) から膵臓を削除し、受信者に転送します。
- また、重症虚血再灌流障害を誘発するグラフト溶液中で保存滅菌、4 ° C 灌流 16 h の受信者の動物にそれを注入する前に。
2. 受信者の準備
- I. p. 注入キシラジン (5 mg/kg 体重) とケタミン (100 mg/kg 体重) 27 G の針を使用して受信者の動物を麻酔します。
- 右横ずれの頸部、電気シェーバーを使用してひげをそるし、仰臥位で術野上にマウスを置きます。テープの繊維を使用してマウスを修正します。呼吸を損なうことを避けるためにフロント手足を overstretching は避けてください。
- クロルヘキシジンに浸したガーゼを使用して 3 つの術野をスクラブします。
- 右傍、右下顎角に頸静脈切開からやや斜め皮膚切開を行います。
- 露骨に識別し、右外頚静脈の側枝を動員します。バイポーラ鉗子でそれらを凝固し、ハサミでそれらを縦断面。
- 頭側の顎下腺の唾液腺右葉を持ち上げて血管茎を識別し、バイポーラ鉗子を用いた焼灼します。焼灼の茎をハサミで transecting して、葉を削除します。
- 手順 2.5 にアナロジーで外頚静脈のすべての内側の枝を識別、バイポーラ鉗子でそれらを焼灼し、ハサミでそれらを縦断面。
3. 注入
- 場所頭で、ハンドルとして脾臓を使用して受信者の頸部に移植指向横方向に、内側、脾臓を含む尾と容器の切り株の頬骨尾。正しい位置に移植する使用綿棒。
- されて以前外反し、受信者動物の外頚静脈上膵移植の門脈を軽く引いて、適切なカフで固定 (手順 2.10 参照)。循環 8/0 絹糸を結紮でそれを修正します。
- 受信者の動物のすぼまり総頸動脈にグラフトの大動脈の断端を引き出します。円周 8/0 シルク合 (図 1) を持つには、それを修正します。
- 脾臓の肺門の近くに脾臓の血管を特定し、湾曲した先端の鉗子で彼らを弱体化させます。8/0 シルク合字でしばるし、脾臓を削除する脾臓の血管を縦断面。最後に、ネクタイを短きます。
- 静脈の袖口にクランプを最初に削除鉗子の適用クランプを使用して、します。動脈クランプを削除します。
注: 移植が成功した場合は、膵臓移植はすぐに均一のピンク色と表示される動脈の脈動 (図 1) を示すが reperfused されます。 - 常温食塩水で移植を湿らせます。
- ストレートの鉗子を用いた静脈カフのハンドルを削除します。
- 実行中の手術創を閉じる 6/0 縫合。
4. 術後のケア (エンドポイント)
- 皮下に 0.5 mL 生理食塩水入りを適用、手順に従って (サウスカロライナ) 19 G の針を使用して術中の流体損失の交換。
- 麻酔からの完全な回復まで加熱パッドで受信者の動物を維持します。
- 一度目を覚まし、受信者の動物に戻る住宅施設、それが持つことができる食品と水の自由。
- 術後の痛みを防ぐためには、管理操作 (1) Buprenorphin (0.1 mg/kg マリンスイーツ) 直後後 12 時間間隔の最初の 5 日間、(2) カルプロフェン 4 mg/kg マリンスイーツ 12 時間間隔の最初の週のサウスカロライナ。
- 適切な栄養摂取量を推定するために各受信者の動物の重量 (g) を毎日監視します。手術日、無関心、壊滅的な非常に曲がった背中だけでなく感染症手術側の重量と比較して 10-15% 以上の体重減少は、エンドポイントを表します。
- この場合と同様、臨床的エンドポイントに到達した後は、ターミナル イソフルラン吸入を使用して動物を犠牲します。
Representative Results
最後の 10 年間、300 以上の膵臓移植をマウスで実行されます。プロトコルを確立した後の全面的な存続があった > 90%。術後出血は、その後致命的な壊死移植膵炎移植片血栓症に続いての失敗の主な原因だった。両方のケースでエンドポイントが 24 h 以内、動物が犠牲になった。すべての神経疾患、嚥下障害、このシリーズの手術側の感染症などの症状はありませんでした。
移植の移植の内分泌機能を調査し、それ故にモデルの開存性を検証、高血糖は受信者マウス腹腔内応用ストレプトゾトシン (312.5 mg/kg 体重) の単回投与での前処理によって誘導された 4手術前に、の日。マウスは血糖血糖値ならと考えられていた > 300 mg/dL。図 2 aは、異なるグループの血ブドウ糖のレベルを示しています。16 時間の長時間冷たい虚血時間がなく移植を受けるマウスは移植、24 h 内 normogylcemia に達し、全体観察期間にわたってこの代謝状態を維持します。対照的に、非移植動物残った高血糖。以来、内分泌機能の虚血再灌流傷害関連付けられているグラフト損傷の影響で興味を持っていた、16 h 長期冷虚血時間 (CIT) と 45 分の阻血時間 (WIT) に移植された公開されている 3 番目のグループを追加しました。これらの移植を受けるマウスな場合に到達せず、このモデル13に致命的なことに示された重症膵炎の発達により 48 時間後犠牲にならなければならなかった。
このモデル、虚血再灌流傷害関連付けられている早期グラフト損傷の調査を目的とした様々 なプロジェクトに適しています。詳しい調査は、他の中で、2 h 次の移植を行う微小かく乱の定量化のための共焦点レーザー生体蛍光顕微鏡を含まれています。グラフトの微小血管のコントラストは、陰茎の静脈に 0.4% フルオレセイン イソチオ シアン酸標識デキストラン (150 000 MW) の 0.3 mL を注入することにより強化されました。図 2 bには定期的な毛細血管パターン素朴なマウス膵臓・移植膵移植、長期 CIT (図 2) に公開されていませんでしたが表示されます。対照的に、図 2 の Dが長期千葉工大に膵移植を公開の結果として微小循環の内訳します。
図 1: 術中写真。(A) 術中観血管吻合のために準備します。外頸静脈 (1) は、静脈ポリエチレン カフ上落葉し、循環 8/0 絹糸を結紮、固定されています。アナロジーで総頸動脈 (2) は落葉し、小さい動脈ポリアミド カフで固定されています。スケール バーの 1 mm. (B) 元場膵移植。門脈 (1) と (2) 血管吻合に必要な腹部大動脈の切り株。脾臓 (3) が膵臓とされ、ハンドルとして使用されます。脾臓は、移植片の再灌流前に削除されます。スケール 1 cm バー。 (C)術中吻合観。門脈 (1) は路肩にすぼまりの外頸静脈のカフ (2) と循環 8/0 シルク ネクタイで固定します。同様に、腹部大動脈 (3) 大動脈断端はすぼまりの総頸動脈 (4) の裾を引っ張られます。スケール 1 mm (D)術中表示次の 5 分再灌流灌流膵移植のバー: 動脈クランプに続いて、静脈を除去した後正常に移植膵移植表示均一なピンク色。再灌流前に脾臓が取り外された (1: 結紮脾血管)。スケール 1 cm バーこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2: 内分泌機能膵移植と共焦点生体内で蛍光顕微鏡。図 2 aは、CIT せず移植マウスの血糖値を折れ線グラフを示しています (n = 10、PTX は CIT、青線なし)、非移植マウス (n = 11、ない PTX 赤い線)、およびマウス移植 cit の長時間露出を受信 (PTX + 16 h CIT、n = 10、グリーン ライン)。すべての受信者は以前 312.5 mg/kg マリンスイーツ ストレプトゾトシン i. p. と高血糖にレンダリングしました。CIT せず移植のすべての受信者がそのまま内分泌機能と全体の観察期間 (50 日) を生き残ることができる、非移植マウスまま全体観察期間高血糖。受信 16 h CIT にさらされる移植マウスは高血糖から回復しなかったし、10-15% 以上の減量のための移植手術後、48 h を犠牲にならなければならなかった。50 1 つの最後の血糖測定を次の日には、マウス全体の観察期間が犠牲になった。生体共焦点レーザー蛍光顕微鏡 2 h 移植移植移植における微小循環動態を評価しました。素朴な膵臓はコントロールとして提供しています。図 2 bは、素朴な膵臓の規則的な毛細血管パターンを示しています。通常のキャピラリー メッシュは長期 CIT (図 2) を受けずに移植移植にも見られます。対照的に、微小循環の内訳は、長期にわたる CIT (図 2 D) にさらされる移植の移植で観察されます。スケール バー 100 μ m. データのグラフで ± 標準偏差として表されます。PTX: 膵臓移植CIT: 冷たい虚血時間;なし: なしこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
IRI のグラフト損傷は固形臓器移植に固有であり、微小循環の障害によって特徴づけられます。虚血性相と炎症カスケード反応性酸素および窒素酸化物、移植再灌流4の間に組織の損傷の結果によって主に仲介の開始時にいくつかの代謝産物の蓄積。このカスケードだけ短期ではない、しかし長期的な成功を危険にさらす可能性があります、したがって、患者生存14が大きく影響します。までに、結合された腎臓膵臓の移植は端の段階の腎臓病15糖尿病の 1 型の患者の選択の治療を表します。複合成功腎臓膵臓の移植のみ復元をしないと糖尿病レシピエントにおける腎臓移植の機能を保護するが、安定したまたはも逆転二次合併症、末梢神経障害を含む、いくつかの研究が示されているだけでなくマイクロ ・ macroangiopathy16,17,18。
動物研究の削減、交換、および絞り込み (3 R) の継続的な努力にもかかわらずは、IRI のような複雑な病態生理学的プロセスの再現が体外の設定でだけ可能。したがって、動物モデルまだトランスレーショナルリサーチ19,20のための理想的なツールをすると見なされます。ここで説明されているようにマウス モデル ラットや他の動物に比べていくつかの利点があるモデル。膨大な遺伝的明確に定義された近交系マウス系統 (系統のトランスジェニック、ノックアウトなど)、分子解析ツールの茄多と同様、簡単、格安21を処理の可用性が含まれます。説明モデルの主な利点は、非縫合カフ技術にあります。ここに紹介したテクニック、成功率を使用して、> 90% は達成、以前に比べて説明モデル22は劇的に良い。この非縫合テクニックを使用すると、12の吻合部狭窄、血栓症、乏血性ショックのような一般的な合併症を大幅削減しました。このメソッドのさらなる利点は、受信者の急速な術後の回復に関連付けられている移植の余分な腹部の位置で構成されます。また、子宮頸部の位置の場合、体内の解析では、任意の緊張22なし exterioration によって移植のライブ イメージングなどに最適になります。
このモデルの主な欠点は、臨床の現実、似ていない膵管の閉塞です。このモデルでは、膵外分泌排水開口膵管を結ぶことによって管理されます。長期的にこれは膵炎22を移植を付けずに著しい線維化および腺の萎縮で結果します。早く観測外分泌組織のこの劣化移植後 30 日我々 は長期観察にこのモデルは適していないと信じています。対照的に、健常者の内分泌機能受信者毎日移植13,23,24の機能評価のための簡単なツールの gylcemic コントロールになります。
これらの特性はこの早期グラフト損傷長い保存期間、または別の保存ソリューションと技術を分析するための理想的なモデルを作る。このモデルに最適な成功を達成するためにいくつかの重要なステップを考慮しなければなりません。膵臓自体は非常に操作しやすいです。したがって、臓器回復および注入中に綿の棒を使用して穏やかな処理は、機械的外傷を最小限にします。鉗子で腺の直接把握それ必然的に深刻なグラフト損傷でないなるので避けるべき。同じ理由で、脾臓は膵臓と共に回復、ハンドルとして使用されます。これも臨床に設立します。さらに落とし穴を含む冷たい血流、4 ° C ヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸灌流液による大動脈断端を介して灌流によって達成されます。以下のとおり、優しく移植を灌によって腺の過度の膨張を回避できます。臓器回復中の温度を低く保つために、移植を潤しの残りの灌流液を使用ください。
受信者の準備に関しては、外頚静脈と総頚動脈を細かくは、正常な血行再建術の基本を設定します。すべての支流だけでなく、周囲の脂肪組織を除去することによって静脈の特定、完全な露出、残りの脂肪質のティッシュによって外部圧縮と狭窄を避けるために必要です。適切なカフの直径の選択は重要です。25 に 28 g の間の重量を量るマウス用の共有経験に基づく動脈カフと 0.75 と静脈のカフの 0.8 mm の間 0.57 mm の内径が適切。正確には、きれいな袖口の端の切断の血管断端を引き裂くことを避けるために必須です。血管、特に動脈の拡張は最高罰金のヒント船 dilatators を使用して実現されます。親指のルールとして、容器はカフのルーメン 2 倍に拡大できる必要があります。上容器を裏返すことと袖口に修正の過程では、この重要なステップを容易にこれに皮弁の下でそれらを配置することによって血管クランプの安定化をお勧めします。
すでに述べたように、非縫合腱テクニックは血管吻合のための簡単な方法を表し、5 分内で実行することができます。ただし、受信者の頸部に移植の正しい位置は、正しい血行再建のため非常に重要です。以下のとおり、安全、ストレート、テンション フリー吻合静脈および動脈の両方を許可するために予想される、頸部に移植の最終的な正しい位置します。船が長すぎるがこれはよじれによる流出狭窄につながる可能性がありますので、避けるべきあります。同じ理由で、静脈の吻合にカフ ハンドルも再灌流後除去されるべき。膵移植からローカライズされた出血の場合、軽く綿棒を使って 5 分間出血側の圧縮によって成功した止血を実現できます。これは、このような合併症を管理する唯一の成功の方法です。熱傷、にもかかわらず高選択性壊死性膵炎によるのほとんどすべてのケースで移植損失をもたらした。
要約すると、・ microsurgically 可能な技術的に、優秀な成功率は、カフ以外縫合法を用いたマウスの膵臓移植の方法を開発しました。膵管閉塞のための progredient の線維化を考えると、このモデルは初期の移植損害に焦点を当て研究分野に最高に適しています。この原稿は、安全に彼らの研究所でこのモデルの確立を研究者を許可するものです。
Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、医療大学インスブルックの補助金 #2008-1-596 と # ユニ-0404/1956 年の「チロル Wissenschaftsfonds 州 (TWF)」(https://www.tirol.gv.at/en/)、"MUI スタート Förderungsprogramm"の補助金 #2013 042018 によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adventitia Scissors | S&T | S-00102 | Straight |
| Dumont # 7 Forceps | FST | 11271- 30 | Curved Tip 0.17 x 0.1 mm |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S&T | B1 00396 V | |
| Vessel dilatator | S&T | D-5a.2, 00125 | |
| Clip applier | S & T | CAF-4 00072 | for venous cuff |
| Clip applier | Aesculap | FE572K | for the arterial cuff |
| Polyethylene tube | Portex Ltd | Inner diameter 0.75 mm for venous cuff | |
| Polymide tubing | Vention Medical | 141-0051 | Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd) |
| Polymide tubing | Vention Medical | 141-0033 | Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff |
| Bipolar forceps | Micromed | 140-100-015 | |
| 8/0 silk ligatures | Catgut GmbH, Merkuramed | 17209008 | |
| Custodiol HTK solution | Dr. Franz Köhler Chemie | 59997 | |
| Ketamin Graeub | aniMedica GmbH | 32554 | |
| Xylasol Graeub | aniMedica GmbH | 50855 |
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