Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Musemodel for bugspytkirtel Transplantation ved hjælp af en modificeret manchet teknik

Published: December 16, 2017 doi: 10.3791/54998
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 1,3, 1, 1,4, 1
1Center of Operative Medicine, Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Medical University Innsbruck, 2Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Medical University Innsbruck, 4Department of Cardiac Surgery, Medical University Innsbruck, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Blandt abdominal solid organtransplantation er pancreas grafts tilbøjelige til at udvikle svær iskæmi reperfusion skade-associerede graft skader, fører i sidste ende til tidlig graft-tab. Denne protokol beskriver en model af murine bugspytkirtel transplantation ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik, velegnet til at analysere disse tidlige, ødelæggende skader.

Abstract

Musemodeller har flere fordele i transplantation forskning, herunder nem håndtering, en bred vifte af genetisk veldefinerede stammer og tilgængeligheden af det bredeste sortiment af molekylære sonder og reagenser til at udføre in vivo samt i vitro undersøgelser. Baseret på vores erfaring med forskellige murine transplantation modeller, udviklede vi en heterotopisk bugspytkirtel transplantation modellen i mus med hensigten at analysere mekanismerne bag svær iskæmi reperfusion skade-associerede tidlige graft skader. I modsætning til tidligere beskrive beskrevne teknikker ved hjælp af Sutur teknik, heri vi en ny procedure ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik.

I de seneste år, vi har udført mere end 300 bugspytkirtlen transplantationscentre i mus med en samlet succesraten for > 90%, en succesrate aldrig beskrevet før i mus bugspytkirtel transplantation. Rygraden i denne ikke-sutur manchet teknik for graft revaskularisering består af to hovedtrin: (I) trække modtagerfartøjets over en polyethylen/polyamid manchet og løse det med en omkredsen ligatur, og (II) placere donor fartøj over den everteret modtagerfartøjets og løse det med en anden omkredsen ligatur. Den resulterende kontinuitet i endothelial lag resultater i mindre trombogen læsioner med høj passage satser og endelig høj succesrate.

I denne model, er arterielle anastomose opnået ved at trække den abdominale aorta af donor graften over den everted fælles halspulsåren modtager dyret. Venøs dræning af graften opnås ved at trække portal venen af graften over den everted eksterne halsfedt af modtageren. Håndskriftet indeholder detaljer og afgørende skridt for det organ inddrivelse og orgel implantation procedurer, som giver forskere med microsurgical færdigheder til at udføre transplantation med succes i deres laboratorier.

Introduction

Samtidige nyre-bugspytkirtel transplantation (SPK) repræsenterer den nuværende standard for pleje til patienter med diabetes mellitus og ende fase nyresygdom. Vellykket transplantation resulterer i langvarig insulin uafhængighed forbundet med stabilisering eller endog regression af diabetisk microangiopathy og en bedre livskvalitet i1. Men i modsætning til andre fælles solid orgel transplantationscentre, ligesom nyre og lever transplantation, pancreas grafts er mere modtagelige for iskæmi reperfusion skade (IRI). Rapporterede forekomst af op til 35% bringe ikke kun graft, men selv patient, overlevelse2,3.

Oxidativ stress, microcirculatory lidelser, øget udtryk af pro-inflammatoriske cytokiner og adhæsionsmolekyler resulterer endelig i endothelial aktivering og tab af sin integritet, er alle blevet tilskrevet denne ikke-allogene graft skade 4. hidtil har de præcise molekylære mekanismer af IRI er stort set ukendte og kan variere fra orgel til orgel.

Trods store fremskridt udnytte in vitro- modeller, er udviklingen af dyremodeller afgørende at uddybe kendskabet til molekylære mekanismer involveret i IRI-associerede graft ændringer efter bugspytkirtel transplantation. Flere bugspytkirtlen transplantation modeller er blevet udviklet i gnavere5,6, men kun én er rapporteret i mus7. Akilleshælen for denne meget krævende microsurgical procedure er den lave overlevelsesrate på 46%. Dog repræsenterer musemodeller den bedste model for transplantation-relateret forskning, da den bredeste vifte af Molekylær analyseværktøjer kan anvendes hertil. Baseret på omfattende microsurgical erfaring i mus med forskellige orgel transplantationscentrene8,9,10, udviklet vi en ny, meget reproducerbare teknik for heterotopisk, cervikal bugspytkirtlen transplantation i mus med > 90% succesrate ved hjælp af en ikke-sutur manchet teknik. Med denne teknik, anastomoser-relaterede komplikationer er reduceret til et minimum, og en høj succesrate kan opnås i forhold til sutur model11. Hidtil har er kun en musemodel med lignende succes satser blevet beskrevet af Liu mfl12. Men der er ingen undersøgelser offentliggjort via denne model indtil videre.

Protocol

For at undgå alloimmune svar og nøje undersøge iskæmi reperfusion skade-relaterede graft skade bør en syngeneic donor-modtager par anvendes. I denne protokol, mandlige C57BL6 (H2b) 10-12-uge-forhenværende mus vejer 26-28 g blev brugt som størrelse-matchede donor-modtager par. Alle dyr har været opstaldet i en barriere patogen gratis facilitet og modtaget menneskelig omsorg i overensstemmelse med "Opdragsgivere af Laboratory Animal pleje" formuleret af the National Society for medicinalforskning og den "Guide til the pleje og anvendelse af forsøgsdyr" udarbejdet af National Academy of Sciences og udgivet af National Institutes of Health (NIH publikation nr. 86-23, revideret 1985). Den østrigske Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur godkendt eksperimenter beskrevet i dette manuskript (BMWF-66.011/0056-II/3b/2011).

1. bugspytkirtlen indkøb

  1. Bedøver donordyret med en intraperitoneal (i.p.) injektion af xylazin (5 mg/kg kropsvægt) og ketamin (100 mg/kg kropsvægt) ved hjælp af en 27-gauge (G) nål.
  2. Barber hår i maveregionen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, og fastsætte musen på det operative område i en liggende stilling med tråde af tape.
  3. Krat det operative område tre gange med klorhexidin-gennemblødt gauzes.
  4. Udføre en midterlinjen abdominal snit med en bilateral subcostal udvidelse ved hjælp af saks. Forsigtigt exteriorize indvolde til venstre med steril bomuld sticks, og pak dem ind i en fugtet gaze. Løft xyphoid cranially med en myg klemme til at give maksimal eksponering af bughulen for følgende trin.
  5. Ved hjælp af en 19 G kanyle indsprøjtes 400 µL af en steril 1:4 heparin-natrium klorid løsning for heparinisation til den ringere vena cava (IVC). Efter at fjerne nålen, aflive dyret af exsanguination transecting af aorta.
  6. Dissekere den abdominale aorta mellem oprindelsen af den overlegne mesenteriallymfeknuderne arterie og højre nyrearteriestenose ved forsigtigt at adskille fibrøst væv ved hjælp af buet spids pincet. Underminere aorta og binde det med en 8/0 silke ligatur.
  7. Identificere hepatoduodenal ligament, der løber mellem postpyloric duodenum og leveren hilum. Opdele galdegang under indgangen til cystisk kanalen efter distale ligatur, og forsigtigt dissekere og Transekttællinger portal vene så distalt som muligt for at have nok længde til at udføre anastomose i modtageren.
  8. Bruger buet spids pincet, ligefremt dissekere den abdominale aorta begynder fra den tidligere ligatur (Se trin 1,6). Underminere periaortic væv ved hjælp af buet spids pincet, binde det med en 8/0 silke ligatur, og Transekttællinger det med en saks.
    1. Ved hjælp af bipolar pincet, koagulerer alle sine lumbal grene og Transekttællinger aorta med saks så tæt som muligt til mellemgulvet, for at give nok længde til fartøj anastomose. Omsider, Transekttællinger allerede bundet aorta ovenfor venstre nyrearteriestenose.
  9. Perfuse bugspytkirtlen med en 19 G sprøjte med 5 mL af 4 ° C histidin-tryptophan-ketoglutarat perfusion løsning i en antegrad mode via den abdominale aorta, indtil der er en klar spildevand fra portalen vene. Anvende lavt tryk til at undgå væskeansamling.
    Bemærk: Udføre trin 1,5 til 1,9 på en hurtig og standardiseret måde at undgå enhver form for partiskhed af varm iskæmisk forringelse af det gendannede graft.
  10. Erstatte organerne i bughulen bruger sterile bomuld pinde.
  11. Bruger buet spids pincet, adskille bugspytkirtlen trinvis begyndende fra postpyloric duodenum, og bevæger sig fremad indtil nå ledbånd i Treitz. Disse trin, identificere avascular bindevæv områder mellem bugspytkirtlen og duodenal væggen.
    1. Ligeud dissekere disse områder ved hjælp af buet spids pincet for at isolere bro fartøjer mellem bugspytkirtlen og tolvfingertarmen. Passere en 8/0 silke ligatur omkring hver isolerede vaskulære struktur og binde det.
    2. Endelig Transekttællinger den vaskulære struktur med en saks i duodenal væggen. På samme måde, skal du bruge en 8/0 silke sutur for at adskille bugspytkirtlen fra mesenteriet, den tværgående tyktarm og maven.
      Bemærk: Under denne procedure, choledocho-pancreas kanalen er forbundet.
  12. Identificere gastrosplenic ledbånd kører fra milten til maven, og de korte gastrisk grene, ved at løfte maven cranially og skære det med en saks. Forlade milten knyttet til den gendannede graft.
    Bemærk: For at minimere graft rewarming, overrisle bugspytkirtlen løbende bruger en 10 mL sprøjte med en 19 G kanyle med den kolde histidin-tryptophan-ketoglutarat perfusion løsning opbevares på is.
  13. Endelig, fjerne bugspytkirtlen fra donor site (figur 1B) af grådige milten med pincet, og overføre det til modtageren.
    1. Alternativt, du kan udløse svær iskæmi reperfusion skade, gemme graften i sterile, 4 ° C perfusion løsning til 16 h før implanterer det i modtagerens dyret.

2. modtagende forberedelse

  1. Bedøver modtager dyret med en i.p. indsprøjtning af xylazin (5 mg/kg kropsvægt) og ketamin (100 mg/kg kropsvægt) ved hjælp af en 27 G nål.
  2. Barbere den højre laterale cervikal region ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, og Placer musen på det operative område i en liggende stilling. Fix musen ved hjælp af strenge af tape. Undgå overstretching forlemmerne for at undgå at kompromittere respiration.
  3. Krat det operative område, tre gange ved hjælp af klorhexidin-gennemblødt gauzes.
  4. Foretage en højre paramedian, lidt skrå hud indsnit fra den jugularis indsnit til den rigtige mandiblen vinkel.
  5. Ligeud identificere og mobilisere de laterale grene af den lige eksterne halsfedt. Koagulere dem med bipolar pincet og Transekttællinger dem med en saks.
  6. Løft højre lap af submandibulære spytkirtel cranially og identificere de vaskulære pedicle ætse den ved hjælp af bipolar pincet. Fjerne lap af transecting cauterized pedicle med saks.
  7. I analogi med trin 2.5, identificere alle mediale grene af den eksterne halsfedt, ætse dem med bipolar pincet og Transekttællinger dem med en saks.
Underminere den eksterne halsfedt med buet spids pincet som cranially som muligt, og ligate det med to 8/0 silke ligaturer, forlader nok plads mellem ligaturer.
  • Transekttællinger den eksterne halsfedt mellem de to tidligere indsatte ligaturer med en lige saks.
  • Passerer den proksimale ende af den eksterne halsfedt gennem polyethylen manchet (indvendig diameter 0,75 mm, ydre diameter på 0,94 mm), og fastgør håndtaget af manchetten med en venøs microhemostat klemme.
  • Fjerne slips i slutningen af fartøjet stub og evert fartøjet over manchetten. Lave den everted vene på manchetten med en cirkulær 8/0 - silke ligatur (figur 1A).
  • Proksimalt og distalt ætse den overfladiske del af højre sternocleidomastoideus musklen, Transekttællinger det med en saks, og fjerne den.
  • Forsigtigt mobilisere den fælles halspulsåren, underminere det nedenfor tvedeling, og ligate det to gange, og sørg for ikke at binde den carotis tvedeling. Skære fartøj mellem båndene.
  • Lignende til at træde 2.9, passere den proksimale ende af den fælles halspulsåren gennem polyamid manchet (indre diameter af 0.57 mm udvendig diameter af 0,6 mm), og lave det med en arteriel mikrovaskulære klemme.
  • Fjerne ligatur i slutningen af det vaskulære stub, og forsigtigt udvide lumen ved hjælp af fartøjets dilatators. Evert fartøjet over arteriel manchetten, og ordne det med en 8/0 silke ligatur (figur 1A).

    • 3. implantation

    1. Sted graft i modtagerens halsregionen ved hjælp af milten som et håndtag, med hovedet orienterede sideværts, halen herunder milten medialt, og fartøjet stubbe ventro caudally. Brug bomuld pinde til at placere graften korrekt.
    2. Træk forsigtigt portåren af pancreas graften over modtagende dyret eksterne halsfedt, der har været tidligere everteret, og fast på den passende cuff (Se trin 2.10). Fix det med en cirkulær 8/0 silke ligatur.
    3. Trække stumpen af den abdominale aorta af graften over den everted fælles halspulsåren modtager dyret. Fix det med en omkredsen 8/0 silke ligatur (figur 1 c).
    4. Identificere de milt fartøjer tæt på hilum af milten, og underminere dem med buet spids pincet. Binde dem med 8/0 silke ligaturer og Transekttællinger de milt fartøjer for at fjerne milten. Endelig vil forkorte båndene.
    5. Bruge en klemme, anvende pincet, fjerne klemmen på den venøse manchet først. Fjern derefter den arterielle klemme.
      Bemærk: Hvis transplantation var vellykket, pancreas graften vil være reperfused umiddelbart viser en homogen rosa farve og synlige arteriel pulsering (fig. 1 d).
    6. Fugte graften med normothermic saltopløsning.
    7. Fjern håndtaget af venøse manchetten ved hjælp af lige pincet.
    8. Luk den kirurgiske sår med en kørende 6/0 sutur.

    4. postoperative pleje (slutpunktet)

    1. Efter proceduren, anvende op til 0,5 mL af normale saltvand subkutant (s.c.) for udskiftning af intraoperativ væsketab ved hjælp af en 19 G nål.
    2. Holde modtager dyret på en varmepude indtil fuldstændig genopretning fra anæstesi.
    3. Når vågen, returnere de modtager dyret til bolig facilitet, hvor det kan have mad og vand ad libitum.
    4. For at forhindre postoperative smerter, administrere lige efter operationen (1) Buprenorphin (0,1 mg/kg b.w.) hver 12 timer for de første 5 dage og (2) carprofen 4 mg/kg b.w. hver 12 h s.c. i den første uge.
    5. For at vurdere korrekt ernæringsmæssige indtag, overvåge vægt (g) i hver modtager dyr hver dag. Et vægttab på mere end 10-15% i forhold til vægt på kirurgi dag, apati, lammende, en meget bøjet ryg, samt kirurgisk side infektioner repræsenterer slutpunkter.
      1. I dette tilfælde, som efter at have nået kliniske slutpunkt, ofre dyret ved hjælp af terminal isofluran indånding.

    Representative Results

    I det sidste årti udført vi mere end 300 bugspytkirtlen transplantationscentre i mus. Efter etablering af protokollen, der var en samlet overlevelse af > 90%. Postoperativ blødning var den væsentligste årsag til svigt, efterfulgt af transplantat trombose med efterfølgende dødbringende nekrotisk graft pancreatitis. I begge tilfælde slutpunkter blev nået inden for 24 timer og dyr blev ofret. Der var ikke nogen neurologiske symptomer såsom dysfagi, og kirurgisk side infektioner i denne serie.

    For at undersøge de endokrine funktion af de transplanteret grafts, og dermed godkende passage af modellen, hyperglykæmi er fremkaldt i modtagerens mus ved forbehandling med en enkelt dosis af intraperitoneal anvendt streptozotocin (312.5 mg/kg kropsvægt) 4 dage før operationen. Mus blev anset for hyperglykæmisk Hvis blod glucose niveauer blev > 300 mg/dL. Figur 2A viser blod glucose niveauer i forskellige grupper. Mus modtage grafts uden en langvarig kolde iskæmi tid på 16 timer nåede normogylcemia inden for 24 timer efter transplantation, og fastholdt denne metabolisk tilstand over hele observationsperioden. Derimod forblev ikke transplanteret dyr hyperglykæmisk. Da vi var interesserede i virkningen af iskæmi reperfusion skade-associerede graft skader på endokrine funktion, tilføjet vi en tredje gruppe hvor grafts blev udsat til 16 h forlænget kolde iskæmi tid (CIT) og 45 min varme iskæmi tid (vid). Mus modtage disse grafts nåede ikke normoglycemia og var nødt til at blive ofret efter 48 timer som følge af udviklingen af svær pancreatitis, som viste sig at være dødbringende i denne model13.

    Denne model er nyttige til forskellige projekter sigter mod at undersøge iskæmi reperfusion skade-associerede tidlige graft skader. Yderligere undersøgelser inkluderede blandt andre, Konfokal intravital Fluorescens mikroskopi til kvantificering af microcirculatory derangements udført 2 h efter transplantation. Kontrast af podninger microvessels blev forbedret ved at indsprøjte 0,3 mL af en 0,4% fluorescein isothiocyanat-mærkede dextran (MW. 150.000) i penis vene. Figur 2B viser en regelmæssig kapillær mønster af en naiv murine bugspytkirtlen og en transplanteret i bugspytkirtlen graft, som ikke var udsat for langvarig CIT (figur 2 c). Derimod viser figur 2D fordelingen af mikrocirkulationen som følge af udsætter i bugspytkirtlen graften til langvarig CIT.

    Figure 1
    Figur 1 : Intraoperativ billeder. (A) intraoperativ visning af de modtagende fartøjer forberedt til anastomose. Den eksterne halsfedt (1) har været everteret over venøs polyethylen manchet og fast med en cirkulær 8/0 silke ligatur. I analogi, den fælles halspulsåren (2) everteret og fast over mindre arteriel polyamid manchetten. Skalere bar 1 mm. (B) i bugspytkirtlen graft ex situ. Vena (1) og stumpen af den abdominale aorta (2) brug for vaskulære anastomose. Milt (3) hentes sammen med bugspytkirtlen og bruges som et håndtag. Milten fjernes før reperfusion af graften. Skalere bar 1 cm. (C) intraoperativ opfattelse af anastomoser. Vena (1) er trukket over manchetten af everted eksterne halsfedt (2) og fast med en cirkulær 8/0 silke slips. Ligeledes, den aorta stump af den abdominale aorta (3) er trukket over manchetten af everted fælles halspulsåren (4). Skala bar 1 mm. (D) intraoperativ visning af perfused i bugspytkirtlen graften efter 5 min reperfusion: efter fjernelse af vene, efterfulgt af den arterielle klemme, en vellykket transplanterede pancreas graft viser en homogen rosa farve. Milten er fjernet før reperfusion (1: sammenskrevne milt fartøj). Skalere bar 1 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Figure 2
    Figur 2 : Endokrin funktion af pancreas graften og konfokal i vivo Fluorescens mikroskopi. Figur 2A viser et kurvediagram med blod glucose niveauer af transplanterede mus uden CIT (n = 10, PTX w/o CIT, blå linje), ikke-transplanteret mus (n = 11, ingen PTX, rød linje), og mus modtage grafts udsættes for langvarig CIT (PTX + 16 h CIT, n = 10, grønne linje). Alle modtagere blev tidligere gjort hyperglykæmisk med 312.5 mg/kg b.w. streptozotocin i.p. Mens alle modtagere af grafts uden CIT var i stand til at overleve den hele observationsperiode (50 dage) med intakt endokrine funktion, forblev ikke-transplanteret mus hyperglykæmisk over hele observationsperioden. Mus modtage grafts udsat til 16 h CIT gjorde ikke gendanne fra hyperglykæmi og måtte ofres 48 h efter hårtransplantation kirurgi, på grund af vægttab på mere end 10-15%. Mus overlevende hele observationsperioden blev ofret på dag 50 efter én sidste glykæmi måling. Mikrocirkulationen i transplanteret grafts blev vurderet af Konfokal intravital Fluorescens mikroskopi 2 h efter transplantation. Naive bugspytkirtlen fungerede som kontrol. Figur 2B viser en regelmæssig kapillær mønster i den naive bugspytkirtlen. En regelmæssig kapillær mesh ses også i transplanteret grafts ikke udsættes for langvarig CIT (figur 2 c). I modsætning hertil er er en opdeling af mikrocirkulationen observeret i transplanteret grafts udsættes for langvarig CIT (figur 2D). Skala bar 100 µm. Data i grafen er udtrykt som ± standardafvigelse. PTX: bugspytkirtel transplantation; CIT: kolde iskæmi tid; w/o: uden venligst klik her for at se en større version af dette tal.

    Discussion

    IRI-associerede graft skader er uløseligt forbundet med solid organtransplantation, og det er kendetegnet ved en forstyrrelser i mikrocirkulationen. Akkumulation af flere metabolitter i løbet af iskæmisk fase, og indledningen af inflammatoriske cascades medieret hovedsagelig af reaktive oxygen og nitrogen arter, resulterer i vævsskader under graft reperfusion4. Denne kaskade kan bringe ikke kun kortsigtede, men også langsigtet succes og dermed væsentligt påvirker patienter overlevelse14. Til dato, repræsenterer kombineret nyre bugspytkirtel transplantation behandling af valg for patienter med type 1 diabetes med end stage renal disease15. Flere undersøgelser har vist, at en vellykket kombineret nyre bugspytkirtel transplantation ikke kun genoprette og beskytte nyre graft funktion i diabetisk modtagere, men også stabiliserer eller selv vender sekundære komplikationer, herunder neuropati samt mikro- og nyresygdom16,17,18.

    Trods vedvarende bestræbelser i reduktion, udskiftning og raffinement (3 R's) i dyreforsøg er reproduktion af komplekse patofysiologiske processer som IRI blot umuligt i in vitro- indstillinger. Derfor er dyremodeller stadig anses for at være det ideelle værktøj for Translationel forskning19,20. Musemodeller som beskrevet her har flere fordele i forhold til rotten eller andre dyre modeller. Disse omfatter tilgængeligheden af et stort antal genetisk veldefinerede indavlede mus stammer (f.eks. stammer, transgene og knock-out), et væld af molekylære analyseværktøjer, samt en let og billig håndtering af21. En stor fordel ved den beskrevne model ligger i den ikke-sutur manchet teknik. Ved hjælp af den heri præsenteres teknik, succes satser for > 90% er opnåelig, hvilket er dramatisk bedre i forhold til tidligere beskrevne modeller22. Brug af denne ikke-sutur teknik reduceret vi betydeligt fælles komplikationer gerne Hypovolæmiske chok og trombose stenose af anastomoser12. En yderligere fordel ved denne metode består af ekstra abdominal placeringen af graft, der er forbundet med hurtig postoperative genopretning af modtageren. Derudover gør den cervikale placering det perfekt egnet til i vivo analyser, såsom live imaging af graften af exterioration uden nogen spænding22.

    Den største ulempe ved denne model er okklusion af pancreas kanalen, som ikke ligner kliniske virkelighed. I denne model administreres eksokrine dræning ved at binde choledocho-pancreas kanalen. På lang sigt resulterer dette i en markant fibrose og atrofi af kirtel uden fører at pode pancreatitis22. På grund af denne forringelse af de eksokrine væv, som vi observerede så tidligt som i dag 30 efter transplantation, mener vi, at denne model ikke er egnet til lang sigt observation. I modsætning hertil gør den fejlfri endokrine funktion gylcemic kontrol af modtageren et nemt værktøj til daglig vurdering af funktionen af transplantat13,23,24.

    Disse egenskaber gør det en ideel model til at analysere tidlige graft skader forbundet med lange bevarelse perioder eller med forskellige bevarelse løsninger og teknikker. For at opnå optimal succes med denne model, flere afgørende skridt skal tages i betragtning. Bugspytkirtlen selv er meget modtagelige for manipulation. Derfor minimerer skånsom håndtering ved hjælp af bomuld pinde under orgel opsving og under implantation mekanisk traume. Direkte fatte af kirtel med pincet bør undgås, da det vil uundgåeligt medføre alvorlige graft skader. Af samme grund, milten er et rentetillæg bugspytkirtlen, og bruges som et håndtag. Dette er også fastslået i klinisk praksis. En yderligere faldgrube indebærer kolde perfusion, som opnås ved perfusion via aorta stumpen ved hjælp af 4 ° C histidin-tryptophan-ketoglutarat perfusion løsning. Herved, kan en overdreven hævelse af kirtel undgås ved forsigtigt perfusing graften. De resterende perfusion løsning bør anvendes til fugtning graft, for at holde dens temperatur lav under organ inddrivelse.

    Med hensyn til modtagerens forberedelse sætter en omhyggelig dissektion af både den eksterne halsfedt samt den fælles halspulsåren base for vellykket revascularisation. I særlige, komplet eksponering af vene ved at fjerne alle bifloder, men også de omkringliggende fedtvæv, er nødvendig for at undgå ekstern kompression og stenose af resterende fedtvæv. Udvælgelse af passende manchet diametre er afgørende. Baseret på fælles erfaring, for mus vejer mellem 25-28 g, er en indre diameter på 0.57 mm for arteriel manchet og mellem 0,75 og 0,8 mm for venøs manchet, passende. Præcise, ren opskæring af kanterne af manchetter er obligatorisk at undgå rive fartøj stump. Dilatation af fartøjer, især af arterie, opnås bedst ved hjælp af fartøjet dilatators med fine tips. Som en tommelfingerregel bør fartøjet kunne udvide til dobbelt lumen af manchetten. I løbet af processen af everting skibet og løse det på manchetten, anbefaler vi stabilisere vaskulære klemmer ved at placere dem under en hud flap, da dette letter dette afgørende skridt.

    Som allerede nævnt, ikke sutur cuff-teknik repræsenterer en nem metode til vaskulær anastomose og kan udføres i 5 min. Korrekt positionering af graften i modtagerens halsregionen er imidlertid af allerstørste betydning for korrekte revaskularisering. Herved, må de endelige korrekt placering af graften i halsregionen forventes for at muliggøre en sikker, lige og spændingsfri anastomose af både venen og arterie. Fartøjer, der er for lange skal undgås, da dette kan medføre udstrømning obstruktion på grund af kinke. Af samme grund bør cuff-håndtag på den venøse anastomose også fjernes efter reperfusion. I tilfælde af lokaliserede blødninger fra pancreas graften, kan succesfuld hæmostase opnås ved forsigtigt komprimere den blødende side i 5 min ved hjælp af bomuld pinde. Dette er den kun succesfulde måde at håndtere denne form for komplikation.Ætsninger, selv om meget selektiv, resulterede i graft tab i næsten alle tilfælde, på grund af nekrotisk pancreatitis.

    I Resumé udviklede vi en metode for bugspytkirtel transplantation i mus ved hjælp af en teknik, ikke-sutur manchet, som er teknisk og microsurgically muligt og har fremragende succesrate. I betragtning af progredient fibrose i bugspytkirtlen på grund af gaffatape okklusion, er denne model velegnet bedst til forskningsområder med fokus på tidlig graft skader. Dette manuskript er bestemt at lade forskere at sikkert fastslå denne model i deres laboratorier.

    Disclosures

    Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af tilskud #2008-1-596 og #UNI-0404/1956 af "Tiroler Wissenschaftsfonds (TWF)" (https://www.tirol.gv.at/en/), og grant #2013-042018 af "MUI-Start Förderungsprogramm" af det medicinske universitet Innsbruck.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Adventitia Scissors S&T S-00102 Straight
    Dumont # 7 Forceps FST  11271- 30 Curved Tip 0.17 x 0.1 mm
    Yasargil Clip Mini Permanent 7mm Aesculap FE720K
    Micro vessel clip S&T B1 00396 V
    Vessel dilatator S&T D-5a.2, 00125
    Clip applier S & T CAF-4 00072 for venous cuff
    Clip applier Aesculap FE572K  for the arterial cuff
    Polyethylene tube Portex Ltd Inner diameter 0.75 mm for venous cuff
    Polymide tubing Vention Medical  141-0051 Inner diameter 0.8 mm (Alternative for polyethylene tube from Portex Ltd)
    Polymide tubing Vention Medical 141-0033 Inner diameter 0.57 mm for arteriail cuff
    Bipolar forceps Micromed 140-100-015
    8/0 silk ligatures Catgut GmbH, Merkuramed 17209008
    Custodiol HTK solution Dr. Franz Köhler Chemie 59997
    Ketamin Graeub aniMedica GmbH 32554
    Xylasol Graeub aniMedica GmbH 50855

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gruessner, A. C. 2011 update on pancreas transplantation: comprehensive trend analysis of 25,000 cases followed up over the course of twenty-four years at the International Pancreas Transplant Registry (IPTR). Rev Diabet Stud. 8 (1), 6-16 (2011).
    2. Troppmann, C. Complications after pancreas transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (1), 112-118 (2010).
    3. Fernández-Cruz, L., et al. Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation. Br J Surg. 80 (11), 1429-1432 (1993).
    4. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
    5. Konigsrainer, A., Habringer, C., Krausler, R., Margreiter, R. A technique of pancreas transplantation in the rat securing pancreatic juice for monitoring. Transpl. Int. 3 (3), 181-182 (1990).
    6. Lee, S., Tung, K., Koopmans, H., Chandler, J., Orloff, M. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation. 13 (4), 421-425 (1972).
    7. Tori, M., Ito, T., Matsuda, H., Shirakura, R., Nozawa, M. Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation. Microsurgery. 19 (2), 61-65 (1999).
    8. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. (92), e50753 (2014).
    9. Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81 (4), 583-589 (2006).
    10. Zou, Y., Brandacher, G., Margreiter, R., Steurer, W. Cervical heterotopic arterialized liver transplantation in the mouse. J Surg Res. 93 (1), 97-100 (2000).
    11. Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8 (3), 245-249 (2010).
    12. Liu, X. Y., Xue, L., Zheng, X., Yan, S., Zheng, S. S. Pancreas transplantation in the mouse. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9 (3), 254-258 (2010).
    13. Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10 (10), 2231-2240 (2010).
    14. Drognitz, O., Obermaier, R., von Dobschuetz, E., Pisarski, P., Neeff, H. Pancreas transplantation and ischemia-reperfusion injury: current considerations. Pancreas. 38 (2), 226-227 (2009).
    15. White, S., Shaw, J., Sutherland, D. Pancreas transplantation. Lancet. 373 (9677), 1808-1817 (2009).
    16. Morath, C., et al. Simultaneous pancreas-kidney transplantation in type 1 diabetes. Clin Transplant. 23 (Suppl 21), 115-120 (2009).
    17. Perseghin, G., et al. Cross-sectional assessment of the effect of kidney and kidney-pancreas transplantation on resting left ventricular energy metabolism in type 1 diabetic-uremic patients: a phosphorous-31 magnetic resonance spectroscopy study. J Am Coll Cardiol. 46 (6), 1085-1092 (2005).
    18. Secchi, A., Caldara, R., La Rocca, E., Fiorina, P., Di Carlo, V. Cardiovascular disease and neoplasms after pancreas transplantation. Lancet. 352 (9121), 65 (1998).
    19. Kirk, A. D. Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research. Immunol Rev. 196, 176-196 (2003).
    20. de Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. J Nucl Med. 51 (4), 501-504 (2010).
    21. Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123-1128 (2001).
    22. Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141 (5), 682-689 (2007).
    23. Cardini, B., et al. Crucial role for neuronal nitric oxide synthase in early microcirculatory derangement and recipient survival following murine pancreas transplantation. PLoS One. 9 (11), e112570 (2014).
    24. Maglione, M., et al. Prevention of lethal murine pancreas ischemia reperfusion injury is specific for tetrahydrobiopterin. Transpl Int. 25 (10), 1084-1095 (2012).

    Tags

    Medicin emnet 130 Transplantation mikrokirurgi mus bugspytkirtlen iskæmi Reperfusion skade manchet teknik
    Musemodel for bugspytkirtel Transplantation ved hjælp af en modificeret manchet teknik
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Cardini, B., Oberhuber, R., Hein, S. … More

    Cardini, B., Oberhuber, R., Hein, S. R., Eiter, R., Hermann, M., Kofler, M., Schneeberger, S., Brandacher, G., Maglione, M. Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique. J. Vis. Exp. (130), e54998, doi:10.3791/54998 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter