Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Küçük hayvanlarda kalp uzunlamasına bir çalışma gibi gen ile ilgili konjenital kalp defektleri 1,2 gibi insan ilgili kardiyovasküler hastalıklar, çeşitli anlamak için katkıda bulunur. Geçmiş yıllarda, fare, 3,4, Xenopus 5,6 zebra balığı 7,8, kuş 9 ve Drosophila 10-16 gibi çeşitli hayvan modellerinde,, araştırma ile ilgili, insan kalp geliştirme çalışmaları için kullanılmıştır. Fare modeli yaygın normal ve anormal kalp gelişimi ve insan kalbi 3,4 ile benzerlikler nedeniyle kalp kusur fenotipleri incelemek için kullanılır olmuştur. Xenopus embriyo nedeniyle kolay kullanım ve kısmi şeffaflık 5,6 kalp gelişimi çalışmada özellikle yararlıdır. Embriyo ve zebra balığı model erken larva şeffaflık kalp gelişimi 7,8 kolay optik gözlem için izin verir. kuş modeli gelişimsel kalp çalışmalarının ortak bir konudur because Kalp kolayca yumurta kabuklarını ve insanlarda 9 kuş kalplerin morfolojik benzerliği çıkardıktan sonra ulaşılabilir. Drosophila modeli kalbin uzunlamasına çalışmalar yapmak için ideal hale bazı benzersiz özelliklere sahiptir. İlk olarak, Drosophila kalp tüpü kalbin optik erişim ve gözlem için kolaylık sağlar dorsal yüzeyinin altında ~ 200 mikron vardır. Ayrıca, birçok moleküler mekanizmaları ve genetik yollar Drosophila ve omurgalılar arasında muhafaza edilir. İnsan hastalık genlerinin 75 üzerinde% ortologlar yaygın transgenik çalışmalarda 11,13 kullanılan yapmış Drosophila, bulundu. Ayrıca, kısa bir ömrü ve düşük bakım maliyetleri vardır ve yaygın gelişimsel biyoloji araştırma 14-16 bir örnek model olarak kullanılmıştır.
Önceki raporlar o gibi Drosophila kalp fonksiyonlarını izlenmesi için protokol tarifArtbeat. Bununla birlikte, diseksiyon işlemleri 17,18 gerekmiştir. Optik görüntü nedeniyle non-invaziv doğası hayvanlarda kalp gelişimini görselleştirmek için etkili bir yol sağlar. Farklı optik görüntüleme yöntemleri gibi iki foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, hafif levha mikroskobu 22, ve optik koherens tomografi (OCT) 16,23-26 olarak, performans hayvan kalp çalışmada uygulanmıştır. Nispeten, Ekim görüntüleme canlı hayvanlar için önemli olan yüksek çözünürlük ve Ultrahigh görüntüleme hızı, tutarken, kontrast maddeleri kullanmadan küçük hayvan kalplerinde büyük bir görüntüleme derinliğini sağlama yeteneğine sahiptir. Ayrıca, bir Ekim sistemini geliştirme düşük maliyetli örneklerinin optik görüntüleme için bu tekniği yaygınlaştırmıştır. Ekim başarıyla Drosophila boyuna çalışma için kullanılır olmuştur. Ekim, kalp morfolojik ve fonksiyonel görüntüleme kalp yapıları incelemek için yapılmıştır kullanma, işlevtional genlerin rolleri ve kalp gelişimi sırasında mutant modellerde kardiyovasküler kusurların mekanizmaları. Örneğin, yaşa bağlı kardiyak fonksiyon düşüş OCT 27 Drosophila aşağı-regüle anjiotensin dönüştürücü enzim ilgili (ACER) geni ile teyit edilmiştir. Gen ile ilgili kardiyomiyopati fenotiplendirme OCT 28-33 kullanılarak Drosophila gösterilmiştir. Araştırma kullanarak Ekim de Drosophila 34 kalbinde insan SOX5 geninin fonksiyonel rolünü ortaya koymuştur. OCT ile karşılaştırıldığında, OCM daha enine çözünürlük sağlamak için daha yüksek bir sayısal diyafram ile objektif kullanır. Geçmişte, bir ortologu insan sirkadiyen geni dCry / dClock susturma kaynaklanan kalp fonksiyon bozukluğu, obezite kaynaklı insan anlamak için özel bir OCM sistemi 15,16 yanı sıra Drosophila kardiyomiyopatilerde yüksek yağlı-diyetin etkisini kullanarak çalışılmıştır kalp hastalıkları. 15
Burada, inciE deneysel protokol ikinci dönem (L2), üçüncü instar (L3), pupa gün 1 (PD1), pupa günde 2 (PD2), pupa gün 3 de Drosophila kalp morfolojik ve fonksiyonel değişikliklere boyuna çalışma için (PD3) özetlenmiştir , pupa gün 4 insan kaynaklı doğumsal kalp hastalıklarının çalışma kolaylaştırmak için OCM kullanarak (PD4), pupa gün 5 (PD5) ve yetişkin (Şekil 1). İK ve CAP olarak kardiyak fonksiyonel parametreler, kantitatif kalp gelişim özellikleri ortaya çıkarmak için farklı gelişim aşamalarında analiz edildi.
Larva ve ergin dönemlerinde 400 bpm civarında maksimum HR Drosophila hızlı kalp atışı, kalp diastoles ve systoles (tecrübelerine dayanarak en az 80 kare / sn) gidermek için yüksek görüntüleme hızı gerektirir. Nedeniyle küçük kalp odası büyüklüğü ve mikron ölçekli kalp duvar kalınlığına (5-10 um), yüksek uzamsal çözünürlük (2 um daha iyi) kalp tüpü yapılarının çözülmesi için gereklidir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü ve ultra hızlı OCM sistemi ızgara 6…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |