Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Studio longitudinale del cuore nei piccoli animali contribuisce alla comprensione di una varietà di malattie cardiovascolari correlate umane, come ad esempio difetti cardiaci congeniti legati gene 1,2. Nei decenni passati, vari modelli animali, come ad esempio 3,4 mouse, Xenopus 5,6, 7,8 zebrafish, aviario 9, e Drosophila 10-16, sono stati utilizzati per condurre il cuore umano-sviluppo relativi ricerca. Il modello di topo è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco normale e anormale e fenotipi difetto cardiaco a causa della sua somiglianza con lo 3,4 cuore umano. L'embrione Xenopus è particolarmente utile nello studio di sviluppo del cuore per la sua maneggevolezza e trasparenza parziale 5,6. La trasparenza dell'embrione e larva precoce del modello zebrafish permette una facile l'osservazione ottica di 7,8 sviluppo cardiaco. Il modello di aviaria è un tema comune di studi di cuore di sviluppo because il cuore può essere facilmente accessibile dopo aver rimosso i gusci d'uovo e la somiglianza morfologica dei cuori aviaria per l'uomo 9. Il modello Drosophila ha alcune caratteristiche uniche che lo rendono ideale per l'esecuzione di studi longitudinali del cuore. In primo luogo, il tubo cuore di Drosophila è ~ 200 micron sotto la superficie dorsale, che fornisce la convenienza per l'accesso ottico e l'osservazione del cuore. Inoltre, molti meccanismi molecolari e percorsi genetici sono conservati tra Drosophila e vertebrati. I ortologhi di oltre il 75% dei geni delle malattie umane sono stati trovati in Drosophila, che hanno reso ampiamente usato negli studi di transgenici 11,13. Inoltre, si ha un breve ciclo di vita e bassi costi di manutenzione, ed è stato comunemente utilizzato come modello esemplare per la ricerca biologia dello sviluppo 14-16.
Studi precedenti hanno descritto i protocolli per il controllo delle funzioni cardiache Drosophila come l'haArtbeat. Tuttavia, le procedure di dissezione sono stati richiesti 17,18. L'imaging ottico fornisce un modo efficace per visualizzare sviluppo cardiaco negli animali a causa della sua natura non invasiva. Diverse modalità di imaging ottico sono stati applicati nello svolgimento di studio cardiaco animale, come microscopia a due fotoni 19, microscopia confocale 20,21, foglio di microscopia ottica 22, e tomografia a coerenza ottica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, OCT è in grado di fornire grande profondità di imaging in piccoli cuori animali senza utilizzare mezzi di contrasto, mantenendo un'alta risoluzione e una velocità di imaging altissima, che sono importanti per gli animali vivi di imaging. Inoltre, il basso costo di sviluppare un sistema PTOM gode popolare questa tecnica per imaging ottico di campioni. Ottobre è stato utilizzato con successo per lo studio longitudinale della Drosophila. Utilizzando Office, l'imaging cardiaco morfologica e funzionale, è stata eseguita per studiare le strutture del cuore, il funcruoli zionali di geni e dei meccanismi di difetti cardiovascolari nei modelli mutanti durante lo sviluppo cardiaco. Ad esempio, il declino della funzione cardiaca età-dipendente è stata confermata con l'enzima legati (ACER) gene down-regolato dell'enzima di conversione in Drosophila con 27 ott. Fenotipizzazione di cardiomiopatia correlata gene è stata dimostrata in Drosophila utilizzando ottobre 28-33. La ricerca che utilizza ottobre ha anche rivelato il ruolo funzionale del gene SOX5 umana nel cuore di Drosophila 34. Rispetto Office, OCM utilizza un obiettivo con un'apertura numerica più elevata prestazione migliore risoluzione trasversale. In passato, la disfunzione cardiaca causata da un silenziamento ortologo gene circadiano umano dCry / dClock è stato studiato utilizzando un sistema OCM personalizzata 15,16, così come l'effetto di alto contenuto di grassi-dieta su cardiomiopatie in Drosophila comprendere indotta obesità umana malattie cardiache. 15
Qui, thprotocollo sperimentale e viene riassunta per lo studio longitudinale dei cambiamenti morfologici e funzionali cardiaci in Drosophila in seconda instar (L2), terzo stadio (L3), giorno pupa 1 (PD1), giorno pupa 2 (PD2), pupa giorno 3 (PD3) , pupa giorno 4 (PD4), pupa giorno 5 (PD5) e adulti (Figura 1) utilizzando OCM per facilitare lo studio delle patologie cardiache congenite umane legate. parametri funzionali cardiaci, come risorse umane e CAP sono stati quantitativamente analizzati a diversi stadi di sviluppo per rivelare le caratteristiche di sviluppo cardiaci.
La tachicardia di Drosophila, con un HR massima intorno a 400 bpm nelle fasi larvali e adulte, richiede alta velocità di imaging per risolvere i diastole e sistole del cuore (non meno di 80 fotogrammi / sec sulla base di esperienze). Grazie allo spessore piccole dimensioni camera cardiaca e micron scala parete cardiaca (5 – 10 micron), una risoluzione spaziale elevata (migliore di 2 micron) è richiesto per risolvere le strutture tubo cuore. In questo studio, ad alta risoluzione e sistema OCM velocità altissi…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |