Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
دراسة طولية من القلب في الحيوانات الصغيرة تساهم في فهم مجموعة متنوعة من أمراض القلب والشرايين المتصلة بها الإنسان، مثل المتعلقة الجين عيوب القلب الخلقية 1،2. في العقود الماضية، نماذج حيوانية مختلفة، مثل 3،4 الماوس، القيطم 5،6، 7،8 الزرد، الطيور 9، وذبابة الفاكهة 10-16، وقد استخدمت لإجراء الإنسان القلب وتطوير الأبحاث ذات الصلة. وقد استخدم على نطاق واسع في نموذج الفأر لدراسة تطوير القلب العادية وغير العادية والظواهر عيب في القلب بسبب التشابه مع 3،4 قلب الإنسان. الجنين القيطم يكون مفيدا بشكل خاص في دراسة التنمية القلب نظرا لسهولة التعامل والجزئي 5،6 الشفافية. الشفافية في جنين واليرقة في وقت مبكر من طراز الزرد يسمح للمراقبة البصرية سهلة من 7،8 تطوير القلبية. نموذج الطيور هو موضوع مشترك للدراسات القلب التنموية becausالبريد قلب يمكن الوصول إليها بسهولة بعد إزالة قشر البيض والتشابه الصرفي من قلوب الطيور إلى البشر 9. نموذج ذبابة الفاكهة لديه بعض الميزات الفريدة التي تجعله مثاليا لإجراء دراسات طولية من القلب. أولا، وأنبوب القلب من ذبابة الفاكهة هو ~ 200 ميكرون تحت السطح الظهري، التي توفر الراحة للوصول البصرية ومراقبة القلب. بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها العديد من الآليات الجزيئية ومسارات الوراثية بين ذبابة الفاكهة والفقاريات. تم العثور على orthologs أكثر من 75٪ من جينات المرض الإنسان في ذبابة الفاكهة، والتي جعلت من استخدامها على نطاق واسع في الدراسات المعدلة وراثيا 11،13. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه دورة حياة قصيرة وانخفاض تكاليف الصيانة، وكان يشيع استخدامها كنموذج عينة للبحوث البيولوجيا التطورية 14-16.
ووصفت التقارير السابقة البروتوكولات لرصد وظائف القلب ذبابة الفاكهة مثل انهartbeat. ومع ذلك، كان مطلوبا إجراءات تشريح 17،18. يوفر التصوير الضوئي وسيلة فعالة لتصور تطور القلب في الحيوانات نظرا لطبيعتها غير الغازية. وقد تم تطبيق مختلف طرائق التصوير الضوئي في أداء الحيوان دراسة القلب، مثل ثنائي الفوتون المجهري 19، الفحص المجهري متحد البؤر 20،21، وعلى ضوء ورقة الفحص المجهري 22، والتصوير المقطعي التماسك البصري (أكتوبر) 16،23-26. نسبيا، أكتوبر قادرة على توفير عمق التصوير عظيم في قلوب الحيوانات الصغيرة دون استخدام عوامل التباين، مع الحفاظ على دقة عالية وسرعة التصوير عالية جدا، والتي هي مهمة لتصوير الحيوانات الحية. بالإضافة إلى ذلك، انخفاض تكلفة تطوير نظام أكتوبر وقد عمرت هذه التقنية للتصوير الضوئي من العينات. وقد استخدم أكتوبر بنجاح لدراسة طولية من ذبابة الفاكهة. باستخدام أكتوبر، وقد تم إجراء القلب التصوير المورفولوجية والوظيفية لدراسة هياكل القلب، وظائفهاالأدوار tional من الجينات، وآليات عيوب القلب والأوعية الدموية في نماذج متحولة خلال تطوير القلب. على سبيل المثال، تم تأكيد تعتمد على سن انخفاض وظيفة القلب مع (ACER) الجين التنظيم أسفل المحول للأنجيوتنسين المتعلقة الانزيم في ذبابة الفاكهة مع 27 أكتوبر. وقد تجلى Phenotyping من اعتلال عضلة القلب المتعلقة الجيني في ذبابة الفاكهة باستخدام أكتوبر 28-33. كما كشفت الأبحاث التي تستخدم أكتوبر دور وظيفي من الجينات SOX5 البشري في قلب ذبابة الفاكهة 34. مقارنة مع أكتوبر، يستخدم OCM هدفا مع الفتحة العددية أعلى لتوفير تحليل أفضل عرضية. في الماضي، وقد تمت دراسة الخلل القلب الناجم عن إسكات الجينات الساعة البيولوجية البشرية ortholog dCry / dClock باستخدام نظام OCM مخصصة 15،16، فضلا عن تأثير ارتفاع الدهون الحمية على بعضلة القلب في ذبابة الفاكهة لفهم السمنة التي يسببها الإنسان أمراض القلب. 15
هنا، التتلخص البريد بروتوكول تجريبي لدراسة طولية من التغيرات الشكلية والوظيفية القلب في ذبابة الفاكهة في الطور الثاني (L2)، الطور الثالث (L3)، يوم خادرة 1 (PD1)، يوم خادرة 2 (PD2)، خادرة يوم 3 (PD3) ، خادرة يوم 4 (PD4)، يوم خادرة 5 (PD5)، والكبار (الشكل 1) باستخدام OCM لتسهيل دراسة أمراض القلب الخلقية المتعلقة الإنسان. وقد تم تحليل المعلمات الوظيفية القلب، مثل الموارد البشرية وCAP كميا في مراحل النمو المختلفة للكشف عن ملامح التطوير في القلب.
وسرعة ضربات القلب من ذبابة الفاكهة، مع حد أقصى لHR حوالي 400 نبضة في الدقيقة في مراحل اليرقات والكبار، يتطلب عالية السرعة التصوير لحل الإنبساط القلب والإنقباضات (ما لا يقل عن 80 لقطة / ثانية استنادا إلى الخبرات). نظرا لصغر حجم الغرفة القلب وميكرون على نطاق وسمك جدار ?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |