Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Langzeitstudie des Herzens bei Kleintieren trägt eine Vielzahl von menschlichen verwandte kardiovaskuläre Erkrankungen zu verstehen, wie Gen – 1,2 angeborener Herzfehler bezogen. In den vergangenen Jahrzehnten von verschiedenen Tiermodellen, wie Maus 3,4, Xenopus 5,6, Zebrabärbling 7,8, Vogel- 9 und Drosophila 10-16, wurden verwendet , das menschliche Herz-Entwicklung im Zusammenhang mit Forschung zu betreiben. Das Maus – Modell wurde in großem Umfang mit dem menschlichen Herzen 3,4 studieren normalen und abnormalen Herzentwicklung und Herzfehler Phänotypen aufgrund ihrer Ähnlichkeiten verwendet. Der Embryo Xenopus ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Herzentwicklung aufgrund seiner einfachen Handhabung und Teiltransparenz 5,6. Die Transparenz des Embryos und der frühen Larve des Zebrabärbling – Modell ermöglicht eine einfache optische Beobachtung der Herzentwicklung 7,8. Das aviäre Modell ist ein gemeinsames Thema Entwicklungsherz Studien because kann das Herz leicht , nachdem sie die Eischalen Entfernen zugegriffen werden und die morphologische Ähnlichkeit der aviären Herzen auf den Menschen 9. Das Drosophila – Modell hat einige einzigartige Eigenschaften , die es ideal für die Durchführung Längsschnittstudien des Herzens zu machen. Erstens ist das Herz Rohr Drosophila ~ 200 & mgr; m unterhalb der dorsalen Oberfläche, die Bequemlichkeit für den optischen Zugang und die Beobachtung des Herzens liefert. Zusätzlich sind viele molekulare Mechanismen und genetischen Pfade zwischen Drosophila und Wirbeltieren konserviert. Die Orthologe von über 75% der menschlichen Krankheitsgene wurden in Drosophila gefunden , die es weithin 11,13 in transgenen Studien gemacht. Darüber hinaus hat sie eine kurze Lebensdauer und geringe Wartungskosten und 14-16 für Entwicklungsbiologie Forschung häufig verwendet als Mustermodell wurde.
In früheren Berichten beschrieben , die Protokolle zur Überwachung Drosophila Herzfunktionen wie erArtbeat. Jedoch wurden Verfahren Dissektion erforderlich 17,18. Optisches Abbildungs bietet einen effektiven Weg Herzentwicklung bei Tieren aufgrund seiner nicht-invasive Natur zu visualisieren. Unterschiedliche optische Bildgebungsverfahren wurden bei der Durchführung von Tierherzstudie, wie Zwei-Photonen – Mikroskopie 19, konfokale Mikroskopie 20,21, Lichtbogenmikroskopie 22 und die optische Kohärenztomographie (OCT) 16,23-26 angewendet. Vergleichsweise ist Oktober der Lage große Bildtiefe in Kleintierherzen Bereitstellung ohne Kontrastmittel verwendet werden, während eine hohe Auflösung und das einen extrem hohen Bildgebungsgeschwindigkeit zu halten, die für die Bildgebung wichtig sind lebende Tiere. Darüber hinaus hat die niedrige Kosten ein OCT-System für die Entwicklung dieser Technik zur optischen Abbildung von Proben populär. Oktober wurde für die Langzeitstudie von Drosophila erfolgreich eingesetzt. Unter Verwendung Oktober hat Herz-morphologische und funktionelle Bildgebung der Herzstrukturen zu studieren, die Func ausgeführt worden isttionale Rollen von Genen, und die Mechanismen kardiovaskulärer Defekte in mutant Modelle während der Herzentwicklung. Zum Beispiel altersabhängige Abnahme der Herzfunktion wurde mit herunterreguliert Angiotensin-Converting – Enzym-bezogenen (ACER) Gen in Drosophila mit 27. Oktober bestätigt. Phänotypisierung von Gen im Zusammenhang mit Kardiomyopathie wurde in Drosophila mit Oktober 28-33 demonstriert. Forschung unter Verwendung von Oktober zeigte auch die funktionelle Rolle des menschlichen SOX5 Gen im Herzen von Drosophila 34. Im Vergleich zu Oktober verwendet OCM ein Objektiv mit einer höheren numerischen Apertur bessere Quer Auflösung bereitzustellen. In der Vergangenheit führte die Fehlfunktion des Herzens durch ein Ortholog menschlichen zirkadianen Gen dCry / dclock Silencing wurde mit einem benutzerdefinierten OCM – System 15,16 studierte, sowie den Effekt der fett-Diät auf Kardiomyopathien in Drosophila Fettleibigkeit induzierten Mensch zu verstehen Herzerkrankungen. 15
Hier the experimentelle Protokoll wird auf den zweiten Häutungsstadium (L2), dritten Häutungsstadium (L3), puppen Tag 1 (PD1), puppen Tag 2 (PD2), puppen Tag 3 (PD3) für Langzeitstudie der Herz morphologische und funktionelle Veränderungen in Drosophila zusammengefasst , Puppe Tag 4 (PD4), Puppe Tag 5 (PD5) und Erwachsenen (Abbildung 1) mit OCM Untersuchung der menschlichen bezogenen kongenitalen Herzerkrankungen zu erleichtern. Herzfunktionsparameter, wie HR und GAP wurden in verschiedenen Entwicklungsstadien quantitativ analysiert, um die Herzentwicklung Merkmale offenbaren.
Die schnellen Herzschlag von Drosophila, mit einem Maximum HR rund 400 bpm bei Larven und adulte Stadien, erfordert eine hohe Abbildungsgeschwindigkeit der Herz Diastolen und Extrasystolen (nicht weniger als 80 Bilder / s auf den Erfahrungen basiert) zu lösen. Aufgrund der geringen Größe und Herzkammer micron Skala Herzwanddicke (von 5 bis 10 & mgr; m), eine hohe räumliche Auflösung (besser als 2 & mgr; m) wird zur Lösung der Herzrohrstrukturen erforderlich. In dieser Studie wurde eine hohe Auflö…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |