Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
מחקר אורך של הלב בחיות קטנות תורם להבנת מגוון רחב של מחלות לב וכלי דם אנושיות קשורות, כגון מומי לב מולד הקשורים גן 1,2. בעשורים האחרונים, במודלים של בעלי חיים שונים, כגון 3,4 עכבר, 5,6 Xenopus, 7,8 דג זברה, עופות 9, ו תסיסנית 10-16, שמש לנהל בלב-התפתחות האנושית הקשורים במחקר. מודל העכבר כבר בשימוש נרחב ללמוד התפתחות לב חריגה נורמליות פנוטיפים פגמו לב עקב הדמיון שלה עם 3,4 לב האנושי. עובר Xenopus שימושי במיוחד בחקר התפתחות לב עקב טיפולה הקל 5,6 שקיפות חלקית. השקיפות של עובר ואת הזחל המוקדם של מודל דג הזברה מאפשרת תצפית אופטית קלה של 7,8 פיתוח לב. מודל העופות הוא נושא משותף של מחקרי לב התפתחותי becausדואר בלב ניתן לגשת בקלות לאחר הסרת קליפות ביצים ואת הדמיון המורפולוגי של לבבות עופות לבני אדם 9. המודל תסיסנית יש מספר מאפיינים ייחודיים ההופכים אותו לאידיאלי עבור ביצוע מחקרים ארוכי טווח של הלב. ראשית, הצינור בלב תסיסנית הוא ~ 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח הגבה, אשר מספק נוחות עבור גישה אופטית ותצפית על הלב. בנוסף, מנגנונים מולקולריים רבים מסלולים גנטיים שמורים בין תסיסנית ובעלי החוליות. Orthologs של למעלה מ -75% מגני מחל אנושיות נמצאו תסיסנית, אשר הפכה אותו בשימוש נרחב במחקרים מהונדסים 11,13. יתר על כן, יש לו מחזור חיים קצר ועלויות תחזוקה נמוכות, ויש בו נעשה שימוש נפוץ כמודל דגימה למחקר בביולוגיה התפתחותית 14-16.
דיווחים קודמים תיאר את הפרוטוקולים לניטור תפקוד הלב תסיסנית כגון שהואArtBeat. עם זאת, תהליכים לנתיחה נדרשו 17,18. הדמיה אופטית מספקת דרך יעילה לחזות התפתחות לב בחיות בשל אופיו הלא-פולשנית. שיטות הדמיה אופטיות שונות יושמו במחקר לב חי ביצוע, כגון מיקרוסקופיה שני פוטונים 19, מיקרוסקופיה confocal 20,21, מיקרוסקופיה גיליון אור 22, ו טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית (אוקטובר) 16,23-26. יחסית, אוק הוא מסוגל לספק עומק הדמיה גדול בלבבות חיה קטנים ללא שימוש בחומרי ניגוד תוך שמירה על רזולוציה גבוהה מהירות הדמית ultrahigh, אשר חשובה לבעלי חי הדמיה לחיות. בנוסף, העלות הנמוכה של פיתוח מערכת אוקטובר יש לפופולרי בטכניקה זו דימות אופטית של דגימות. אוקטובר שימש בהצלחה עבור מחקר אורך של דרוזופילה. באמצעות אוקטובר, הדמיה מורפולוגית ופונקציונלית לב שבוצעה כדי ללמוד את מבנה הלב, funcתפקידים תזונתיים של גנים, ואת המנגנונים של מומים קרדיווסקולרים מודלי מוטציה במהלך התפתחות לב. לדוגמא, ירידה בתפקוד לב תלוי גיל קבלה אוששה הקשורות אנזים למטה מוסדר ההמרה-אנגיוטנסין (ACER) גנים תסיסנית עם אוקטובר 27. Phenotyping של קרדיומיופתיה גנים הקשורים הודגם תסיסנית באמצעות אוקטובר 28-33. המחקר באמצעות אוקטובר חשף גם את התפקיד הפונקציונלי של גן SOX5 אדם בלב תסיסנית 34. לעומת אוקטובר, OCM משתמשת אובייקטיבית עם צמצם מספרי גבוה כדי לספק רזולוציה רוחבית טוב יותר. בעבר, התפקוד לקוי הלב נגרם על ידי השתקת גני יממת אדם ortholog dCry / dClock נחקר באמצעות מערכת OCM מנהג 15,16, כמו גם את ההשפעה של דיאטה עתירה שומן על cardiomyopathies תסיסנית להבין אדם מושרה שמן מחלות לב. 15
הנה, הפרוטוקול דואר ניסוי מסוכם עבור מחקר אורך של שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים לב תסיסנית ב instar השני (L2), instar השלישי (L3), גולם יום 1 (PD1), גולם יום 2 (PD2), יום גולם 3 (PD3) גולם, יום 4 (PD4), גולם יום 5 (PD5), ומבוגרים (איור 1) באמצעות OCM להעמיק את הלימוד של מחלות לב מולדות אדם קשור. פרמטרים פונקציונלי לב, כגון משאבי אנוש CAP נותחו כמותית בשלבים התפתחותיים שונים כדי לחשוף את תכונות התפתחות הלב.
קצב פעימות לב המהיר של תסיסנית, עם HR מקסימום בסביבות 400 פעימות לדקה בשלבי זחל ובוגר, דורש מהירות גבוהה הדמיה כדי לפתור את הלב diastoles ו systoles (לא פחות מ -80 מסגרות / שנייה מבוסס על חוויות). בשל עובי דופן לב בקנה מידה קאמרי לב קטן בגודל מיקרון (5 – 10 מיקרומטר), ברזולוציה מרחב?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |