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Biology

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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작은 동물의 마음의 종단 연구는 유전자와 관련된 선천성 심장 결함 1,2 인간 관련 심혈관 질환의 다양한 이해에 기여한다. 지난 수십 년 동안, 이러한 마우스 3,4-, 5,6- 제노, 제브라 7,8 조류 9초파리 10-16와 같은 다양한 동물 모델에서의 연구와 관련된 인간의 심장 개발을 수행하는데 사용되어왔다. 마우스 모델 널리 정상 및 비정상 심장 개발 및 인간 심장 3,4과의 유사성으로 인해 심장 결함 표현형을 연구하기 위해 사용되었다. Xenopus의 배아 때문에 쉬운 취급 및 부분 투명 5,6에 심장 개발의 연구에서 특히 유용합니다. 배아와 제브라 피쉬 모델의 초기 유충의 투명성 심장 개발 7,8 쉽게 광학 관찰 할 수 있습니다. 조류 모델은 발달 심장 연구의 일반적인 될 수 있습니다 becaus전자 심장 쉽게 알 껍질과 인간 9 조류 마음의 형태 학적 유사성을 제거한 후 액세스 할 수 있습니다. 초파리 모델은 마음의 종 방향 연구를 수행하기에 이상적 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 초파리의 심장 관은 심장의 광 액세스 및 관찰 편의를 제공하는 등의 표면 아래 ~ 200 μm의이다. 또한, 많은 분자 메커니즘 및 유전 경로는 초파리와 척추 동물 사이에 보존되어있다. 인간의 질환 유전자의 75 % 이상의 orthologs은 널리 유전자 연구에 사용 11,13 만든 초파리에서 밝혀졌다. 또한, 짧은 수명과 낮은 유지 보수 비용을 가지며, 일반적으로 발생 생물학 연구 14-16 검체 모델로 사용되고있다.

이전 보고서는 그 예로서 초파리 심장 기능을 모니터링하기위한 프로토콜을 묘사artbeat. 그러나, 해부 절차는 17, 18를 요구했다. 광학 이미징 인해 비 침습 자연 동물에서 심장 개발을 시각화 할 수있는 효과적인 방법을 제공합니다. 다른 광학 이미징 양식은 두 광자 현미경 (19), 공 초점 현미경 (20, 21), 빛 시트 현미경 (22), 및 빛 간섭 단층 촬영 16,23-26으로 수행 동물 심장 연구에 적용되었습니다. 비교적으로, 간섭 단층 촬영 살아있는 동물에 중요한 높은 해상도 및 초고 촬상 속도를 유지하면서, 조영제를 사용하지 않고, 작은 동물 하트 큰 촬상 깊이를 제공 할 수있다. 또한의 OCT 시스템 개발의 저비용 시험편 광학 이미징 기술이 대중화되었다. 간섭 단층 성공적 초파리의 길이 연구에 사용되었다. OCT를 심장 형태 학적 및 기능적 촬상 심장 구조를 연구하기 위해 수행 된 사용하여 FUNC적인 유전자의 역할 및 심장 개발하는 동안 돌연변이 모델에서 심장 혈관 결함의 메커니즘. 예를 들어, 연령에 따라 심장 기능의 감소는 OCT 27 초파리에서 다운 규제 안지오텐신 전환 효소 관련 (ACER) 유전자로 확인되었다. 유전자 관련 심근 병증의 표현형은 10월 28-33를 사용하여 초파리에서 입증되었다. 연구 사용 10월은 초파리 (34)의 중심에 인간의 SOX5 유전자의 기능적 역할을 것으로 보입니다. 간섭 단층 비해 OCM 더 가로 해상도를 제공하기 위해 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈를 사용한다. 과거에서, ortholog 인간 주기성 유전자 dCry / dClock 입을로 인한 심장 기능 장애는 비만 유도 인간 이해 맞춤 OCM 시스템 (15, 16),뿐만 아니라 초파리 심근증에 고 지방식이의 효과를 사용하여 연구되어왔다 심장 질환. (15)

여기에, 일전자 실험 프로토콜은 두 번째 령 (L2), 세 번째 령 (L3), 번데기 1 일 (PD1), 번데기 2 일 (PD2), 번데기 3 일에서 초파리의 심장 형태 학적 및 기능적 변화의 길이 방향 연구 (PD3)를 요약 , 번데기 4 일 인간과 관련된 선천성 심장 질환의 연구를 촉진하기 위해 OCM을 사용하여 (PD4), 번데기 5 일 (PD5), 성인 (그림 1). 이러한 HR 및 CAP 등 심장 기능 매개 변수를 정량적으로 심장 개발 기능을 나타 내기 위해 다른 발달 단계에서 분석 하였다.

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Protocol

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초파리 (16)의 광학 이미징에 대한 OCM 시스템의 1. 준비

  1. 분광기 및 OCM 시스템 초파리의 하트 비트를 해석 할 수 있도록 적어도 80 프레임 / 초의 프레임 속도를 제공하는 고속의 라인 스캔 카메라를 선택한다.
  2. 초파리의 핵심 구조를 식별하기 위해 2 ㎛, 축 해상도를 보장하는 광대역 광원을 사용한다.
  3. 높은 가로 해상도를 얻기 위해 10X 목표를 사용합니다.
  4. 기준 암부 광속을 반사하고, 시험편의 초점 심도를 확장하는 환형 샘플 아암 광빔을 생성하는 45 ° 막대 거울을 사용한다.
  5. OCM이 시스템을 제어하고 측정을 수행하는 사용자 컴퓨터 프로그램을 개발한다.

2. 초파리 문화

  1. 표준 비행 음식 준비
    1. 폴리스티렌 유리 병에 ~ 5 ml의 인스턴트 초파리 수식을 넣어종이 슈트의 도움 튜브.
    2. 제대로 음식을 포화 식으로 ~ 8 ml의 물을 붓고.
    3. 다른 실험에 대한 표준 비행 음식에 다른 보충제를 추가합니다. 실험 35 페이싱 optogenetic에 대한 모든 - 트랜스 레티 날 (ATR) 음식을 준비 할 때, 100 mM의 ATR를 추출하여 식품 1 ㎜의 ATR 농도를 얻을 수 ml의 8 ~에 물을 용해 할 수있는 피펫을 사용합니다. 균일 용액을 혼합 한 후, 화학식로 용액을 붓고 충분히 교반한다.
    4. 전자 레인지에 30 초 동안 컵과 열을 15 ml의 물과 함께 ~ 10, 15 믹스, 초파리에서 비만 관련 심장 기능 장애 연구 10 ml의 공식을 높은 지방 다이어트를 준비합니다. 다른 컵에 일부 유기농 엑스트라 버진 코코넛 오일을 넣고 전자 레인지에 90 초 정도 가열한다.
    5. 충분히 음식 ~ 30/100 및 제 코코넛 오일의 중량 / 부피 비율을 7.5 ml의 코코넛 오일을 추출하고, 제조 된 화학식 섞어음식을 혼합 추출물 ~ 2 ml의 욕실 튜브의 바닥에 넣어.
    6. 매체가 완전히 포화 될 때까지 1 분 동안 기다립니다. 초파리 대한 생활 조건을 최적화하기 위해 평평한 신중 음식을 압축. 준비된 공식 효모의 8 곡물, 면화의 클러스터와 튜브를 연결 - 6을 추가합니다.
  2. 과일 비행 십자가와 문화
    1. 준비된 표준 플라이 음식 튜브를 타고와 연결면을 제거합니다. 조심스럽게 튜브 (남성과 여성) 성인 파리를 전송하고 즉시면에 튜브를 연결합니다. 면 튜브로부터 빠져 나가는 파리 방지 튜브 벽 사이에 틈이 생기지 않도록하려면면을 확인한다.
    2. 교차 사육을 위해 25 ° C에서 인큐베이터에서 초파리를 유지합니다. 유전자의 대부분은 활성 및 세포 단백질은 25 ° C 36 ~ 39에서 합성된다.
    3. 8 손 전송 ㄱ 후 인큐베이터에서 튜브를 꺼내는 Dult 실험 제어를위한 비슷한 나이에 알을 얻기 위해 관 밖으로 날아갑니다.
    4. 8.5 40, 41 일의 개발 기간이 초파리 개발 표준 온도 25 ° C에서 인큐베이터에서 계란을 계속 배양.
      참고 : 온도가 발달 기간 (성인에 계란) 및 다양한 유전자의 발현에 영향을 미친다.

3. OCM와 광학 이미징을 수행

  1. 광학 이미징에 대한 마운트 플라이 유충
    참고 : 22 초파리 해치의 달걀 - 첫 번째 령 유충 (L1)에 25 ° C에서 24 시간. 두 번째 령 유충은 또 다른 24 시간 후에 나온다. 가장 큰 애벌레 형태는 약 24 시간 후 털갈이 세 번째 령 유충입니다. 유충의 구조적 특성들은 상이한 발달 단계를 구별하는데 사용될 수있다. 제 령 및 제 령의 입 부분의 크기는 다르다. 입첫 번째 령 유충의 후크가 매우 작고 두 번째 령 유충의 입 고리가 더 크고 구조가 명확하지만, 작은 검은 점 두 쌍처럼 보인다. spiracles 보통 초 령 및 제 령을 식별하는 데 사용된다. 세 번째 령를 들어, 전방 spiracles이 분기되며, 반면에 두 번째 령 유충은 앞쪽에 spiracles을 때리는했다. 어두운 오렌지 링은 세 번째 령 유충의 후부 spiracles의 끝에서 나타나기 시작합니다.
    1. 깨끗한 현미경 유리 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 적용합니다. 촬상시의 기포에 의한 반사를 방지하기 위해 테이프 하에서 기포를 배출.
    2. 애벌레 단계에서 인큐베이터 밖으로 배양 파리와 튜브 중 하나를 수행합니다.
    3. 미디어에 유충을 확인 깨끗한 조직에 부드러운 브러시와 장소 미디어에서 제거합니다. 젖은 부드러운 브러시로 유충에 붙어 음식을 제거하고 조직에 건조.
    4. 소독기 이동넓은 필드 현미경의 대물 렌즈에서 조직에 도착하는 거라고.
    5. 파리의 명확한 뷰를 찾기 위해 현미경의 초점을 조정합니다. 현미경과의 구조적 특성에 의해 유충의 오른쪽 발달 단계를 확인합니다.
    6. 부드러운 브러쉬를 사용하여 비행을 배치합니다. 몸이 똑바로 지느러미 옆 유리 슬라이드에 장착하기위한 준비를 위쪽으로 향하게 지느러미면이 있는지 확인하십시오. 현미경이 단계를 수행합니다.
    7. 유충이 테이프에 장착하기 전에 완전히 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 유충은 테이프에 부착되지 않습니다.
    8. 적당한 압력으로 유리 슬라이드에 양면 테이프에 위치 파리의 지느러미 측면 스틱. 촬영하는 동안 움직임을 비행 이어질 것 즉시 너무 작은 힘을 죽일 수 너무 많은 압력을합니다.
  2. OCM와 애벌레 스테이지 (L2 및 L3)에서 초파리의 광학 이미징
    참고 : 심장 튜브의 광범위한 루멘이 fo를 할 수 있습니다싶게 애벌레 단계에서 A8에 A5 사이의 세그먼트에 위치 (그림 1). 횡 OCM M 모드 화상 (2D + 시간) 수축기 및 확장기 분석을 용이하게하기 위해 각각의 유충 중심 관의 A7 세그먼트에서 획득 하였다.
    1. 대물 렌즈 아래에서 위로 향하게 지느러미 측면의 y 가로 방향의 OCM 시스템의 조정 샘플 무대에 탑재 된 애벌레를 놓습니다. 시료 대에 작은 구멍을 스테이지면과의 접촉을 피하도록 유충을 배치 할 필요가있다.
    2. 열매의 중심 관 이미징 빔의 초점면까지의 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 용이 A7 세그먼트를 찾기 위해, 실시간 화상 획득 소프트웨어 단면 OCM 이미지와 중심 관의 구치부를 찾는. A7 세그먼트가 볼 때까지 앞으로 단계를 이동합니다.
    3. 세트 B 스캔 100 A-스캔 (프레임) (100) B-스캔으로 화상 획득 소프트웨어 파라미터 및 scanneR 전압 ~ 0.28의 x 폭 방향 mm, 및 Y-가로 방향의 V 0을 포함한다. 어두운 천으로 샘플 빔 경로를 차단하여 배경 공제에 대한 배경 잡음 데이터를 수집하기 위해 소프트웨어의 "시작"버튼을 클릭합니다.
      주 : 백 프레임 (3)은 배경 차감을 위해 사용될 수있다.
    4. B 주사 당 128 A-스캔 4096 B-스캔 스캐너 전압 데이터 수집 소프트웨어의 집합 파라미터들은, Y 가로 방향은 X 가로 방향 ~ 0.28 mm, 0 V를 포함한다. 약 30 초 동안 0.28 X 0.57 mm (2)를 커버하는 영역에 즉시 심장 튜브의 A7 세그먼트에 걸쳐 가로 M 모드 이미지를 수집하기 위해 소프트웨어의 "시작"버튼을 클릭합니다.
    5. 촬상 광 플라이 심장의 긴 노출을 방지하기 위해, 데이터 저장 과정에서 어두운 천을 사용하여 이미징 빔을 차단.
    6. 심장 재미 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 5 회 측정을 반복ction.
    7. B 주사 당 400 A-스캔 800 B-스캔 스캐너 전압 화상 획득 소프트웨어 파라미터 설정은 X 가로 방향 ~ 1.7 mm를 커버하고, Y 가로 방향으로 4 ~ mm한다. 전체 과일 파리가 이미지화 할 수 있도록 양방향으로 무대를 이동합니다. 3 차원 초파리의 이미지를 얻기 위해 하나의 데이터 집합을 획득하기 위해 소프트웨어의 "시작"버튼을 클릭합니다. 주 : 3D 플라이 구조 아미라 3D 소프트웨어를 사용하여 표현 될 수있다
    8. 측정 된 파리를 묻혀 살짝 유리 슬라이드에서 제거 젖은 부드러운 브러시를 사용합니다. 지속적인 개발을위한 별도의 튜브로 이동합니다. 다음 발달 단계를 통해 종 연구를위한 튜브를 레이블.
  3. 번데기의 단계에서 이미지 초파리
    참고 : 모든 과일 파리는 PD1에서 PD5에 이미징 꺼냈다. 도 1b에 유충 회로도에 도시 된 바와 같이, 넓은 관강은 번째의 세그먼트 A8 A5 유지PD1까지 전자 심장 튜브. PD2에서 원추형 챔버는 A4 세그먼트에 A1 사이에서 발생하기 시작한다. 일관된 이미지를 수집하고 심장의 분석을 용이하게하기 위해, 횡 M 모드 이미지 PD1에서 A7 세그먼트로부터 수득하고,도 1B에 표시된 바와 같이, PD2 후 A1 세그먼트에서.
    1. PD1에서 이미지 초파리
      참고 : 초파리는 짧은 시간 창 흰색 puparium해야합니다 - PD1 동안 (0, 1 시간). 이 시간 창은 높은 투명성이 OCM 영상에 대한 높은 빛의 침투에 이르게하기 때문에 조기 번데기의 광학 이미징을 수행하기에 적합합니다.
      1. 그들은 번데기가 될 때 초파리는 튜브 벽에서 찾을 수있는 바와 같이, 젖은 부드러운 브러시로 PD1에서 이미지에 대한 개별 튜브에서 번데기를 제거하고 몸에 붙어있는 음식이있는 경우 브러시와 번데기를 청소합니다.
      2. 직접 젖은 브러시로 작은 유리 슬라이드에 초파리를 탑재하고 위로 향하게 지느러미 측면을 유지 (그림 1a
      3. 즉시 본체의 측면에서 과도한 물을 제거합니다.
      4. 상단에 초파리를 유지하면서 OCM 시스템의 샘플 무대에서 유리 슬라이드를 넣습니다. 유충 측정에 설명 된 것과 동일한 전략을 이용하여 비행 마음의 A7 세그먼트의 명확한 실시간으로 이미지를 찾을 수 있습니다.
      5. 섹션 3.2에서와 같이, 데이터 수집 소프트웨어의 동일한 매개 변수를 설정하고, 이미지 A7 세그먼트에서의 하트 비트 횡 M 모드 및 3D 이미지를 획득.
      6. 촬영 후, 다시 연속 배양 용 튜브에 번데기와 유리 슬라이드를 배치하기 위해 트위터를 사용합니다.
    2. PD5의 단계에 PD2에서 이미지 초파리
      주 : 시험편 더 불투명 번데기 단계 동안지기 때문에, 촬상 장치의 투과 깊이가 감소된다.
      1. 신중 유리 S를 제거하는 집게를 사용하여LIDE은 이미징을위한 튜브에서 PD2에서 비행 장착. PD2에서 시험편 쉘 황색이되고 본체 PD1 (도 1)에 비해 덜 투명해진다.
      2. OCM 시스템의 샘플 무대에 슬라이드를 넣습니다.
      3. OCM이 시스템의 이미징 빔의 초점면에 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 실시간 단면 OCM 이미지 심장 튜브의 앞쪽 끝을 찾을 수 있습니다. 심장 튜브의 A1 세그먼트를 찾기 위해 다시 후방 방향으로 ~ 50 μm의 이동합니다.
        참고 : 심장 개발 (PD2)의이 시점에서, 원추형 챔버는 매우 작은되며 박동되지 않을 수 있습니다.
      4. 이전 발달 단계와 동일한 방법을 이용하여 횡 A1 세그먼트로부터 M 모드 데이터 세트뿐만 아니라, 3 차원 데이터를 수집한다.
      5. 연속 배양주의 깊게 튜브로 다시 슬라이드를 넣습니다.
        주 : PD3에서, 쉘의 시험편의 색 PD2 단계에서보다 더 어둡다. PD4 단계에서, 검은 색 줄무늬가 캘리포니아n은 표본의 쉘 내부에 관찰 될 수있다. 다른 사람이 PD5로 진화하면서 일부 파리, 다음 날에이 단계에서 성인으로 개발할 것입니다. PD5 단계에서, 검은 색 줄무늬가 더욱 분명 초파리에서 볼 수 있습니다. 이 파리는 다음 날 성인이 될 것입니다.
  4. 성인 단계에서 이미지 초파리
    주 : 성인 단계에서 암수 파리 상기 본체의 크기 및 하복부의 컬러에 의해 구별 될 수있다. 남성은 작고 어두운 색의 하복부에있는 동안 여성 성인, 큰 크기를 가지고있다.
    1. 초파리가 성인으로 발전 할 때 인큐베이터에서 튜브를 꺼내, 그리고 성인이 ~ 45 ml의 빈 유리 병에 도착 전송합니다.
    2. , 마취에 지팡이의 흡수 끝 (~ 1cm 길이, 2 ~ 3 mm 직경)를 찍어 유리 병에 지팡이를 넣어 바로 연결면 아래와로 마취 끝을 유지하는면의 클러스터와 튜브를 연결 anes3 분 동안 비행을 thetize. 마취의 지속 시간은 비행의 크기에 따라 달라집니다 및 분 3.5-2.5 사이에 다를 수 있습니다 (예 : 분 3 여성, 최소 2.5 남성 또는 3.5).
    3. 양면 테이프의 조각 유리 슬라이드를 준비합니다.
    4. 등쪽면이 위를 향 부드러운 브러시를 사용하여 유리 슬라이드 상에 마취 비행 이동합니다.
    5. 트위터를 사용하여 날개를 분리하고 즉시 수정 및 이미징의 심장 영역을 노출하는 현미경 테이프의 날개 스틱.
    6. 이미지 플라이 마음의 A1 세그먼트에서 파리 (그림 1). 실험의 끝에, 플라이 희생 될 수있다.

4. 이미징 분석 (16)

  1. 화상 파일 화상 획득 소프트웨어에 수집 된 2D 및 3D 이진 파일을 변환 매트랩 프로그램을 개발한다.
  2. creat에하는 횡 M 모드 이미지에서 심장 튜브 영역과 마법의 지팡이 알고리즘을 식별 할 수 ImageJ에를 사용하여각 횡 M 모드 이미지의 심장 지역의 개 마스크입니다. 세그먼트 마스크 영역과 수축기 및 이완기의 위치를 ​​식별하는 피크 발견 알고리즘을 사용한다. 가로 M 모드 이미지의 시간 의존 심장 직경의 변화를 계산합니다.
  3. 상기 취득 시간 의존성 심장 직경에 기초하여, 예컨대 HR 심장 활동주기 (CAP), 말기 직경 (EDD), 단부 수축기 직경 (ESD), 말기 영역 (EDA)와 심장 파라미터를 계산하고 (수축기 면적 종료 ESA). 소수 단축 (FS)와 계산 식 (1)
  4. 플라이 심장의 구조 개발을 시각화하기 위해 3D OCM 이미지를 분석 ImageJ에 사용합니다.

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Representative Results

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길이 심장 이미징 OCM 실온에서 24B-GAL4 / + 균주와 초파리를 사용하여 수행 하였다. 측정 L2, L3에서 수행하고, PD4에 PD1에서 8 시간 간격으로, 성인 1 일 (AD1)는 변형 과정 (표 1)를 추적 할 수 있었다. 유충, 번데기 초, 늦은 번데기 및 성인 파리는 그림 1A에서 볼 수 있듯이 유리 슬라이드에 장착했다. 애벌레와 성인 파리의 심장의 세그먼트 기능은 그림 1B의 개략적 인 표현에 나타내었다.

이 발달 연구에서, 4096 프레임은 초파리의 심장 박동을 추적하는 우리의 사용자 정의 OCM 시스템으로 32 초에서 획득 하였다. 측정 정확도를 개선하기 위해 다섯 반복 측정은 각 발달 단계에서 각각의 시료에 대해 수행 하였다. 3D 데이터는 변형 동안 심장 구조 변화를 관찰하기 위해 얻어 질 수있다.

가로 M 모드 및 3D 이미지는 다했다 사용자의 MATLAB 프로그램과 ImageJ에 함께 reated. 얼굴 이미지 및 축 부분은 초파리의 변태 (그림 2) 동안 마음의 리모델링 과정을 시각화하기 위해 수집 된 데이터로 구성되었다 갖추고 있습니다. 초파리의 심장 기능을 정량화하기 위해 심장 영역이 자동으로 모든 4096 프레임에서 사용자 지정 matlab에 프로그램을 사용하여 분할 하였다. 플라이 심박수 (HR)를 가로 M 모드 OCM 이미지에서 정량화 할 수있다 (도 3a). 번데기 단계 동안, 초파리의 마음은 때때로 16 박동을 멈 춥니 다. 우리는 전체 촬상 시간에 하트 비트 기간의 비율을 정량하는 새로운 심장 기능 파라미터, 심장 활동주기 (CAP)를 도입 (도 3B). EDD는, ESD, EDA, ESA, 그리고 FS는 초파리 개발하는 동안 축 방향 및 횡 방향 모두 차원에서 심실의 변화를 정량화하기 위해 사용되었다. (16)

애벌레 단계에서 콘텐츠 ">, 심장 튜브는 넓은 루멘과 후방 복부의 A8에서 시작 (A5 - A8 그림 1B에서)과 좁은 직경 (T3 / A1과 전방 지느러미 세그먼트 A1에서 끝 - A5 그림 1B에서 ). 심장 챔버 내측과 등쪽에 위치하고 있으며 L2 (그림 2 A, B) 및 L3 (그림 2 C 동안 큰 성장했다, D). PD1를 입력 한 후, 심장 관은 움직이는 공기의 맨 위에 축 방향으로 실행이 관찰되었다 거품 (그림 2 E, F) 약 10 -. 13 시간 후, 거품 puparium 형성 한 후 사라 앞쪽에 심장 관이 복부에 위치 된 이후되었다가 everted 넓은 루멘은 전체 심장 관은의 후방 지역을 제외하고 눈에 보이지 않는이었다. OCM 이미지 ~ puparium 형성 후 12 시간이 나중에 PD2 동안, 심장 챔버는 점차 지느러미 복부 따라 정렬하고, 후방 부 (A6 - A8). 마음의 제거되었다 (그림 2 g, H) (4)2,43. 원추형 챔버는 ~ A1 개발하기 시작 - PD2 동안 A4 세그먼트를하고 성인 단계 (그림 2 전 - m)까지 크기로 성장했다.

구조적인 변화를 관찰 외에도 많은 기능 변경 심장 리모델링하는 동안뿐만 아니라 발견되었다. 그림 3의 M 모드 이미지는 하트 비트가 번데기에 애벌레 단계에서 크게 둔화하고 성인에 번데기에서 크게 증가 함을 입증. 중요한 HR의 변화는 라이프 사이클 (그림 4a) 동안 관찰되었다. 또한, 심장 활동 기간 (CAP)을 AD1 (도 4b)에 L2에서 측정 된 모든 시료에 대해 분석 하였다. 도 4에 도시 된 바와 같이, HR은 L2와 L3에 대한 분당 ~ 277 비트 (BPM)을 보유하고있다. 초기 번데기 단계를 입력하면 HR 및 CAP의 현저한 감소가있다. HR은 PD1의 시작 부분에 86 ± 11 BPM 감소하고, 전자가 26 ± 8 BPM로 계속 감소되고PD1의 차 마지막으로 초기 PD2에서 완전히 정지에오고. 한 가지 흥미로운 발견은 PD2 무대 주위에 관찰 심장 활동의 확장 기간 (~ 24 시간 - puparium 형성 후 48 시간)이 같은 심장 발달 diastalsis 16 참조. PD2의 끝에서, 느린 간헐적 인 구타는 (CAP 5 ± 2 6 ± HR 17 BPM)를 다시 시작합니다. PD3 및 PD4, HR 및 CAP 증가 성인 무대의 첫 날에 392 ± 32 BPM과 95 ± 3 %에 도달 할 때까지 (5 일 후에 번데기부터 시작)를 통하여.

그림 1
그림 다른 단계와 심장 변 태의 도식 표현에서 초파리 1. 실장. (가) 애벌레, 번데기의 장착, 성인 WT (24B-GAL4 / +)는 유리 슬라이드에 날아갑니다. (b)는 심장 변태의 도식 표현. 애벌레와 성인 schemati에 빨간색 화살표각각 PD1 24 시간까지 OCM M 모드의 촬상 위치를 나타내는 후속 시간 점 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
2. 초파리 심장 형태 학적 변화를 그림. 얼굴(a, b) L2에서 얻어진 WT 초파리의 축 단면 OCM 이미지 (c, d) L3 (E, F) PD1 (g, H) PD2 (I, L) PD4 및 (K, m) 성인 EN 단계. 초파리 마음의 M 모드 이미지는 PD1 때까지 이후 단계에 대한 A1 세그먼트에서 A7 세그먼트에서 얻었다. 얼굴과 축 단면 이미지를 200 μm의 500 μm의, 연구를 의미 욕실의 규모 바espectively. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
3. 초파리 심장 기능의 변화를 그림. (a)는 라이프 사이클에 걸쳐 HR의 변화를 나타내는 다른 발달 단계에서 M 모드 이미지. (b) 심장 활동 기간 (CAP)의 계산을 보여주는 실시 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
기능 심장 매개 변수 그림 4. 정량 분석WT에들 L2, L3, 8 시간 간격으로 번데기 단계, 및 AD1을 포함하는 다양한 발달 단계에서 파리. (a) HR. (b) CAP. 각 그룹의 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

개발 단계
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 시간 16 시간 24 시간 32 시간 40 시간 48 시간 56 시간 64 시간 72 시간 80 시간 88 시간
표본 수 (21) (17) (13) (19) (19) (19) (19) (19) (19) (18) (17) (18) 9 (25)

WT 과일 표 1. 번호는 심장 발달 연구에서 다양한 발달 단계에서 측정 날아갑니다.

비디오 1
WT에 시간적 차원을 따라 하트 비트의 비디오 1. 추적 및 z 방향 (축 방향)을 따라 대응 심장 챔버 직경의 변화는 L2에 비행. 심장은 정상 속도로 상대적으로 빠른 박동했다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.) P>

비디오 2
WT에 시간적 차원을 따라 하트 비트의 비디오 2. 추적 및 z 방향 (축 방향)을 따라 대응 심장 상공 회의소 직경 변경 PD1에서 비행. 인사는 감소하기 시작했다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 3
WT에 시간적 차원을 따라 하트 비트의 비디오 3. 추적 및 z 방향 (축 방향)을 따라 대응 심장 상공 회의소 직경 변경 PD2에서 비행. 핵심은 시간 동안 완전히 박동 정지. 플롯 (Z) 둘레의 진동이 촬상 잡음에 기인 하였다. 대상 = "_ 빈">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 4
WT에 시간적 차원을 따라 하트 비트의 비디오 4. 추적 및 z 방향 (축 방향)을 따라 대응 심장 상공 회의소 직경 변경 PD4에서 비행. PD2 후, HR 및 CAP가 증가하기 시작했다. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 5
AD1에서 WT 비행에 시간적 차원을 따라 하트 비트의 비디오 5. 추적 및 z 방향 (축 방향)을 따라 대응 심장 챔버 직경 변경합니다. 인사는 모든 단계 중 가장 높은이었고, CAP은 거의 100 %였다.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "대상 ="_ 빈 ">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

비디오 (6)
유생 파리의 비디오 6. 3D 구조 렌더링. 이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.)

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애벌레와 성인 단계에서 400 BPM 주위 최대 HR과 초파리의 빠른 심장 박동, 심장 diastoles 및 systoles (경험을 바탕으로 더 이상 80 프레임 / 초)를 해결하기 위해 높은 이미징 속도를 필요로한다. 작기 때문에 심실 크기 및 마이크론 스케일 심장 벽의 두께 (5-10 μm의) 높은 공간 분해능 (2 ㎛의보다 나은) 중심 관 구조를 해결하기위한 요구된다. 본 연구에서는, 고해상도 및 고속 초고 OCM 시스템 격자 600 라인 / mm의 변속기 분광기와 2048 픽셀 라인 스캔 카메라를 사용한 경우, 개발되었다. 20 kHz에서의 A-스캔 속도는 라인 스캔 카메라에 의해 제공된다. 128 프레임의 프레임 속도는 / 초 L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, 성인 등 다양한 발달 단계에서 초파리 하트 비트를 포착 할 수있을만큼 빠르다. 광원 ~ 800 nm에서의 중심 파장 및 대역폭을 갖는 넓은 대역폭 초 연속 광원이었다220 nm의 각각과 조직 ~ 1.3 μm의의 축 해상도를 얻을. 10 배의 대물 3.9 μm의 ~를 가로 해상도를 실현하기 위해 샘플 아암에 사용 하였다. 초파리의 심장 관은 약 200 μm의 지느러미 표면 아래이기 때문에, 마이크론 수백 미터의 이미징 깊이가 필요합니다. 45 ° 막대 거울은 환형 샘플 빔을 생성하고, 시험편 (44)에 초점 심도를 확장하는 데에 이용 될 수있다. 감도 및 3dB 롤 - 오프는 ~ 9 mW의의 샘플 팔의 힘으로 각각 96dB 600 μm의 수를 측정 하였다. 맞춤 컴퓨터 프로그램은 측정을 OCM 시스템을 제어하고 수행하는 데 사용되었다. 심장 구조 및 이미지 획득 기능 파라미터 정량의 전체 라이프 사이클에 걸쳐 초파리의 하트 형태와 기능을 특성화하기 위해 OCM를 사용하는 가능성을 입증한다.

현재, 몇 가지 다른 기술은 이미지 작은을하는 데 사용됩니다동물의 심장 구조 나 기능 등의 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI) 및 초음파 등. OCM은 미세 구조 및 동물의 마음에 빠른 역학의 시각화를 가능하게이 기술보다 더 높은 공간 및 시간 해상도를 제공합니다. 초점 현미경 다른 널리 이미징 기술이지만, 낮은 촬상 침투 이미징 조영제의 요청이 살아있는 동물에서 그 응용을 제한한다. 비교적, OCM은 높은 속도와 작은 동물에서 비 침습적 빠른 심장 역학을 시각화하는 라벨이없는 영상을 가능하게한다. 그러나 여전히 OCM의 제한 사항이 있습니다. 초음파는 최대 10cm의 침투 깊이를 갖는 예를 들어, OCM 의해 제공된 촬상 깊이 조직에서 약 1 mm로 수백 마이크론 광 산란에 의해 제한된다. 공 초점 현미경에 비해, OCM은 더 높은 속도와 더 나은 영상의 깊이,하지만 낮은 해상도와 가난한 분자 콘트라스트가 있습니다. 또한, 현재 OCM 시스템은 바있다스펙트럼 영역 검출 시스템 나오지. OCM 45 휩쓸 소스를 기반으로 높은 이미징 속도는 하트 비트 같은 신속한 역학의 더 뚜렷한 이미지를 제공 할 수있다.

OCM와 초파리의 심장 박동의 길이 방향의 연구를 수행하려면 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 파리는 실험의 모든 단계에서 매우 섬세하게 처리해야합니다. 그 다음 발달 단계에 심장 구조와 기능에 영향을 미칠 수있는 유충을 손상 용이하기 때문에 유충을 관리하는 것은 특히 부드러운해야한다. 초파리는 커버 유리를 매우 정확하게 이미징 스테이지 상에 위치되어야한다. 잘못 배치 파리 어려운 품질의 이미지를 획득하고, 비대칭 구조 및 기능 심장 파라미터 값을 발생할 수 있도록한다. 또한, 전송하는 성인은 다른 하나의 튜브에서 날아와 목화 공을 연결하는 튜브에서 자신의 탈출을 방지하기 위해 매우 빠른해야한다.

에 다른 연구초파리 심장 개발 프로토콜을 수정함으로써 수행 될 수있다. 파리가 배양되는 온도 증가 또는 심장 유전자 발현 수준을 변경하고 즉시 개발 기간을 변경하도록 25 ° C에서 감소 될 수있다. 코코넛 오일 또는 표준 식품 ATR 일부 성분을 첨가함으로써, 심장 개발은 변경 될 수있다. 구체적인 연구가 야생형 또는 형질 전환 된 초파리에서 수행 될 수있다. 종 과일 파리 심장 현상을 연구 할 때, 상이한 시간 간격, 예를 들어, OCM 측정을 수행하는 데 사용될 수 8 시간 간격 번데기 단계에서 사용될 수있다. 때문에 우리 OCM 시스템의 제한된 감도 균일 스펙 클 노이즈가 많이 어려운 올바르게 매트랩 프로그램 심장 수축 신호를 식별하고 데이터 분석의 효율성을 감소시킬 수 횡 M 모드 이미지에서 발견된다. 감도 OCM 시스템의 정렬을 개선하여 크게 할 수있다. 최적화 된 필터링 알고리즘얼룩의 일부를 제거하는 것이 좋습니다.

기술 된 프로토콜은 인간의 일 주기성 orthologs, 초파리에서 dCrydClock 유도 심장 결함의 침묵을 연구하기 위해 적용되었습니다. 감소 홈런은 유충, 번데기 및 성인 15, 16 등 다양한 발달 단계에서 관찰되었다. 심장 개발 주기성 유전자의 역할은 심장 혈관 질환과 관련된 활동 일주기 활동 패턴 사이의 관계를 설명 할 수있는 나타났다. 높은 지방 다이어트 (HFD)에 의한 심장 질환은 HFD (15)가 공급 초파리의 심장 기능의 변화를 분석하여 연구 하였다. 이 연구는 심장 구조와 기능의 발달 연구에 강력한 도구뿐만 아니라, 선천성 및 출생 후의 인간의 질병을 이해 심장 종 연구의 중요성으로뿐만 아니라 초파리를 보여 주었다. OCM이 플랫폼은 향후 연구 다양한있게 In 개의 유전자는 인간의 심장 질환 관련.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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References

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<em>초파리</em> 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 <em>생체 내에서</em> 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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