Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.
Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.
Langsgående studium av hjertet i små dyr bidrar til å forstå en rekke humane relaterte kardiovaskulære sykdommer, slik som genet knyttet medfødt hjertefeil 1,2. I de siste tiårene, ulike dyremodeller, for eksempel mus 3,4, Xenopus 5,6, sebrafisk 7,8, avian 9, og Drosophila 10-16, har blitt brukt til å gjennomføre det menneskelige hjerte-utvikling relatert forskning. Musen Modellen har vært mye brukt til å studere normale og unormale hjerte utvikling og hjerte defekt fenotyper grunn av sine likheter med det menneskelige hjertet 3,4. Xenopus embryo er spesielt nyttig i studiet av hjerte utvikling på grunn av enkel håndtering og delvis gjennomsiktighet 5,6. Gjennomsiktigheten av embryoet og tidlig larve av sebrafisk-modellen gir enkel optisk observasjon av hjerte utvikling 7,8. Avian modellen er et felles tema for utviklingshjerte studier because hjertet kan være lett tilgjengelig etter fjerning av eggeskall og den morfologiske likheten av aviær hjerter for mennesker 9. Den Drosophila modellen har noen unike funksjoner som gjør den ideell for å utføre longitudinelle studier av hjertet. Først, i hjertet rør av Drosophila er ~ 200 mikrometer under den dorsale overflate, som gir enklere for optisk tilgang og overvåkning av hjertet. I tillegg er mange molekylære mekanismer og genetiske trasé konservert mellom Drosophila og virveldyr. De ortologer på over 75% av menneskelige sykdomsgener ble funnet i Drosophila, som har gjort det mye brukt i transgene studier 11,13. Videre har den en kort livssyklus og lave vedlikeholdskostnader, og har blitt brukt som et eksemplar modell for utviklingsbiologi forskning 14-16.
Tidligere rapporter beskrev protokoller for overvåking av Drosophila hjertefunksjoner slik som hanArtbeat. Men disseksjon prosedyrer var nødvendig 17,18. Optisk imaging gir en effektiv måte for å visualisere hjerte utvikling hos dyr på grunn av sin ikke-invasive karakter. Ulike optiske bildediagnostikk har blitt brukt til å utføre dyr hjertestudie, for eksempel to-foton mikroskopi 19, konfokalmikroskopi 20,21, lys ark mikroskopi 22, og optisk koherens tomografi (OCT) 16,23-26. Relativt, er oktober i stand til å gi god bildedybde i små dyrehjerter uten bruk av kontrastmidler, samtidig som en høy oppløsning og en ultrahøy bildehastighet, noe som er viktig for bildebehandling levende dyr. I tillegg har den lave kostnaden for å utvikle en oktober system popularisert denne teknikken for optisk avbildning av prøver. Oktober har blitt brukt for den langsgående studium av Drosophila. Bruk av oktober, hjerte morfologisk og funksjonell avbildning har blitt utført for å studere hjerte strukturer, den funcelle roller gener og mekanismer for kardiovaskulære defekter i mutant modeller under hjerte utvikling. For eksempel ble aldersavhengig hjertefunksjon nedgang bekreftet med nedregulert angiotensin-converting enzyme relaterte (ACER) genet i Drosophila med 27 oktober. Fenotyping av genet relatert kardiomyopati ble vist i Drosophila hjelp oktober 28-33. Forskning ved hjelp oktober avslørte også den funksjonelle rollen til det humane genet SOX5 i sentrum av Drosophila 34. Sammenlignet med oktober, bruker OCM et mål med en høyere numerisk apertur for å gi bedre tverrgående oppløsning. I det siste, har hjertet dysfunksjon forårsaket av stanse en ortolog menneskelige biologiske genet dCry / dClock blitt undersøkt ved hjelp av en tilpasset OCM system 15,16, samt effekten av høy-fett-diett på cardiomyopathies i Drosophila å forstå fedme indusert menneskelig hjertesykdommer. 15
Her the eksperimentelle protokollen er oppsummert for longitudinell studie av hjerte morfologiske og funksjonelle endringer i Drosophila på andre stadium (L2), tredje stadium (L3), puppe dag 1 (PD1), puppe dag 2 (PD2), puppe dag 3 (PD3) , puppe dag 4 (PD4), puppe dag 5 (PD5), og voksne (figur 1) ved hjelp OCM å legge til rette studiet av menneskelige relaterte medfødte hjertefeil. Hjerte funksjonelle parametre, som HR og CAP ble analysert kvantitativt på ulike utviklingsstadier for å avdekke hjerte utviklingstrekk.
Den raske hjerteslag Drosophila, med en maksimal HR rundt 400 bpm på larve og voksne stadier, krever høy bildehastighet for å løse hjerte diastoles og systoler (ikke mindre enn 80 bilder / sek basert på erfaringer). På grunn av den lille størrelse hjertekammeret og mikron skala hjerteveggtykkelse (5 – 10 um), en høy romlig oppløsning (bedre enn 2 um) er nødvendig for å løse de hjerte rør strukturer. I denne studien ble en høy oppløsning og ultrahøy hastighet OCM system som er utviklet, hvor et s…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.
Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
Cover glass | AmScope | 200PCS | |
Cotton Ball | RITE AID | ||
Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
Yeast | ActiveDry | ||
Microscope | SONY | WILD M420 | |
Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
Labview software | National Instruments | ||
Image J | National Institutes of Health | ||
Matlab | Mathworks | ||
Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M | Scotch | ||
Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |