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Biology

Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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Estudio longitudinal del corazón en animales pequeños contribuye a la comprensión de una variedad de enfermedades cardiovasculares relacionadas humanos, tales como defectos cardíacos congénitos relacionados con el gen 1,2. En las últimas décadas, diversos modelos animales, tales como 3,4 ratón, Xenopus 5,6, 7,8 pez cebra, aviar 9, y Drosophila 10-16, se han utilizado para llevar a cabo el corazón-desarrollo humano investigación relacionada. El modelo de ratón se ha utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo cardíaco normal y anormal y fenotipos defecto cardíaco debido a sus similitudes con el 3,4 corazón humano. El embrión de Xenopus es especialmente útil en el estudio del desarrollo del corazón debido a su fácil manejo y 5,6 transparencia parcial. La transparencia del embrión y la larva temprana del modelo de pez cebra permite la observación óptica fáciles de 7,8 desarrollo cardíaco. El modelo aviar es un tema común de los estudios del desarrollo del corazón because el corazón se puede acceder fácilmente después de la eliminación de las cáscaras de huevo y la similitud morfológica de los corazones de aves a los seres humanos 9. El modelo de Drosophila tiene algunas características únicas que la hacen ideal para la realización de estudios longitudinales del corazón. En primer lugar, el tubo de corazón de Drosophila es de ~ 200 micras debajo de la superficie dorsal, que proporciona la conveniencia para el acceso óptico y la observación del corazón. Además, muchos mecanismos moleculares y las vías genéticas se conservan entre Drosophila y vertebrados. Los ortólogos de más del 75% de los genes de enfermedades humanas fueron encontradas en Drosophila, que han hecho que sea ampliamente utilizado en estudios transgénicos 11,13. Además, tiene un ciclo de vida corto y bajos costes de mantenimiento, y se ha utilizado comúnmente como un modelo ejemplar para la investigación de la biología del desarrollo 14-16.

En informes anteriores se describen los protocolos para el control de las funciones cardíacas Drosophila como la queArtbeat. Sin embargo, se requieren procedimientos de disección 17,18. de formación de imágenes óptico proporciona una forma eficaz de visualizar el desarrollo cardiaco en animales debido a su naturaleza no invasiva. Las diferentes modalidades de imágenes ópticas se han aplicado en la realización del estudio cardiaco de animales, tales como la microscopía de dos fotones 19, microscopía confocal 20,21, microscopía de luz de hoja 22, y la tomografía de coherencia óptica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, la OCT es capaz de proporcionar una gran profundidad de imagen en pequeños corazones de animales sin el uso de agentes de contraste, mientras se mantiene una velocidad de filmación de una ultra alta resolución y, que son importantes para los animales vivos de imagen. Además, el bajo costo de desarrollar un sistema de La OCT ha popularizado esta técnica para la formación de imágenes ópticas de las muestras. Octubre ha sido utilizado con éxito para el estudio longitudinal de Drosophila. OCT, imágenes morfológicas y funcionales cardiaca se ha realizado el estudio de las estructuras del corazón, la funcpapeles cionales de genes, y los mecanismos de defectos cardiovasculares en los modelos de mutantes durante el desarrollo cardiaco. Por ejemplo, disminución de la función cardiaca dependiente de la edad se confirmó con genes regulados hacia abajo-convertidora de angiotensina relacionados con enzimas (ACER) en Drosophila mediante OCT de 27. Fenotipificación de miocardiopatía relacionado con el gen se demostró en Drosophila en OCT 28-33. Investigación en OCT también reveló el papel funcional del gen SOX5 humana en el corazón de Drosophila 34. En comparación con los PTU, OCM utiliza un objetivo con una apertura numérica más alta para proporcionar una mejor resolución transversal. En el pasado, la disfunción del corazón causada por el silenciamiento de genes circadianos un ortólogo humano dCry / dCLOCK se ha estudiado el uso de un sistema OCM personalizada 15,16, así como el efecto de alto contenido de grasa en la dieta-miocardiopatías en Drosophila para entender la obesidad inducida por el hombre enfermedades cardíacas. 15

Aquí, THe protocolo experimental se resume para el estudio longitudinal de los cambios morfológicos y funcionales cardíacos en Drosophila en segundo instar (L2), tercer estadio (L3), pupa día 1 (PD1), pupa día 2 (PD2), pupa día 3 (PD3) , pupa día 4 (PD4), el día 5 de pupa (PD5) y adulto (figura 1) el uso de OCM para facilitar el estudio de las enfermedades cardiacas congénitas relacionadas con el hombre. parámetros funcionales cardíacos, tales como recursos humanos y CAP se analizaron cuantitativamente en diferentes etapas de desarrollo para revelar las características de desarrollo cardiacos.

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Protocol

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1. Preparación del sistema OCM de Imagen Óptico de Drosophila 16

  1. Seleccionar un espectrómetro y una cámara de exploración de líneas de alta velocidad que proporciona una velocidad de al menos 80 cuadros / seg por lo que el sistema OCM será capaz de resolver el latido del corazón de Drosophila.
  2. Utilice una fuente de luz de banda ancha para garantizar una resolución axial de 2 micras para identificar la estructura del corazón de Drosophila.
  3. Utilice un objetivo de 10X para obtener una alta resolución transversal.
  4. Use un espejo de 45 ° varilla para reflejar el haz de luz del brazo de referencia y para generar un haz de luz anular brazo de muestra para extender la profundidad de foco en las muestras.
  5. Desarrollar un programa informático personalizado para controlar el sistema OCM y realizar mediciones.

2. Cultura Drosophila

  1. Estándar Fly Preparación de Alimentos
    1. Ponga ~ 5 ml instantánea fórmula Drosophila en un vial de poliestirenotubo con la ayuda de una bandeja de entrada.
    2. Verter ~ 8 ml de agua en la fórmula para saturar adecuadamente la comida.
    3. Añadir diferentes suplementos para la comida mosca estándar para diferentes experimentos. Cuando se prepara para todos- (ATR) de alimentos trans retinal para la estimulación optogenética experimento 35, utilizar una pipeta para extraer mM ATR 100 y disolverse en ~ 8 ml de agua para obtener la concentración de 1 mM ATR en los alimentos. Después de mezclar la solución de manera uniforme, verter la solución en la fórmula y se remueve suficientemente.
    4. Para preparar un alto contenido de grasa-dieta para el estudio de las disfunciones cardíacas relacionadas con la obesidad en Drosophila, 10,15 mezcla ~ 10 ml fórmula con 15 ml de agua en una taza y el calor durante 30 segundos en un horno de microondas. Ponga un poco de aceite de coco virgen extra ecológico en otra taza y se calienta durante 90 segundos en el microondas.
    5. Extraer 7,5 ml de aceite de coco y mezclar con la fórmula preparada lo suficiente como para hacer que la relación peso / volumen de aceite de coco a la alimentación ~ 30/100, y THen extracto de ~ 2 ml mezclados alimentos y ponerlo a la parte inferior de un tubo.
    6. Esperar durante 1 minuto hasta que el medio está completamente saturado. Compactar la comida cuidadosamente con una superficie plana para optimizar las condiciones de vida de la Drosophila. Añadir 6 - 8 granos de levadura a la fórmula preparada, y enchufe el tubo con un grupo de algodón.
  2. Mosca de la fruta Cruces y Cultura
    1. Tomar un tubo con comida mosca preinstalado de serie, y retirar el algodón enchufado. Transferir cuidadosamente las moscas adultas (masculino y femenino) en el tubo, y conecte el tubo con algodón inmediatamente. Compruebe el algodón para asegurarse de que no hay diferencia entre el algodón y la pared del tubo para evitar que las moscas se escape del tubo.
    2. Mantenga las moscas de la fruta en la incubadora a 25 ° C para la hibridación. La mayoría de los genes son activos y las proteínas celulares se sintetizan a 25 ° C 36-39.
    3. Tome el tubo de salida de la incubadora después de las 8 de transferencia de la mano de la unadult vuela fuera del tubo para obtener los huevos en edad similar para el control experimental.
    4. Continuar el cultivo de los huevos en la incubadora a 25 ° C, que es la temperatura estándar para el desarrollo de Drosophila con el período de desarrollo de 8,5 días 40,41.
      NOTA: La temperatura influye en el período de desarrollo (huevo a adulto) y el nivel de expresión de diversos genes.

3. Realización de imagen óptico con la OCM

  1. Monte larva de la mosca de imágenes ópticas
    NOTA: El huevo de las escotillas de Drosophila en 22 - 24 horas a 25 ° C para el primer estadio larvario (L1). El segundo estadio larvario surge tras otras 24 horas. La forma larvaria más grande es el tercer estadio larvario, que muda después de aproximadamente 24 horas. Características estructurales en larva se pueden utilizar para distinguir sus diferentes etapas de desarrollo. El tamaño de las partes de la boca entre el primero y el segundo instar instar es diferente. La bocaganchos del primer estadio larvario son muy pequeñas y se ven como dos pares de puntos negros diminutos, mientras que los ganchos de la boca del segundo estadio larvario son más grandes y la estructura es más clara. Los espiráculos se utilizan generalmente para identificar el segundo instar y el tercer instar. El segundo estadio larvario ha golpeado espiráculos anteriores, mientras que, para el tercer estadio, los espiráculos anteriores son ramificados. Un anillo de color naranja oscuro comenzará a aparecer en la punta de los espiráculos posteriores en el tercer estadio larvario.
    1. Aplicar un trozo de cinta de doble cara a un portaobjetos de vidrio de microscopio limpio. Expulsar las burbujas de aire debajo de la cinta para evitar los reflejos causados ​​por burbujas de aire durante la exploración.
    2. Tome uno de los tubos con las moscas cultivadas fuera de la incubadora en la etapa larval.
    3. Identificar la larva en los medios de comunicación, eliminarlo de los medios de comunicación con un cepillo suave y colocar en una toalla de papel limpia. Retire cualquier alimento pegado a la larva con un cepillo suave húmedo y secarlo sobre el tejido.
    4. Mueva el cleaned volar a un tejido debajo de la lente objetivo de un microscopio de campo amplio.
    5. Ajuste el enfoque del microscopio para encontrar una visión clara de la marcha. Identificar la etapa de desarrollo de la larva derecho por sus características estructurales con el microscopio.
    6. Posicionar al vuelo usando el cepillo suave. Asegúrese de que el cuerpo es recto con el lado dorsal hacia arriba para preparar para el montaje sobre el portaobjetos de vidrio por el lado dorsal. Realice este paso bajo el microscopio.
    7. Asegúrese de que la larva está completamente seca antes de montar en la cinta. De lo contrario, la larva no se adhiere a la cinta.
    8. Se adhieren el lado dorsal de la mosca de posicionado para la cinta de doble cara en el portaobjetos de vidrio con una presión moderada. Tenga en cuenta que el exceso de presión puede matar a la mosca y muy poca fuerza conducirá a volar movimiento durante la exploración.
  2. Imágenes ópticas de Drosophila en estadios larvales (L2 y L3) con OCM
    NOTA: Una amplia lumen del tubo de corazón puede ser found situada en los segmentos entre A5 a A8 en los estadios larvarios (Figura 1). Las imágenes OCM en modo M transversales (2D + tiempo) fueron adquiridas en el segmento del tubo A7 corazón por cada larva para facilitar la presión sistólica y diastólica análisis.
    1. Coloque la larva montado en la etapa de muestra ajustable del sistema OCM largo de la dirección transversal y-con el lado dorsal hacia arriba por debajo de la lente de objetivo. Un pequeño agujero en la etapa de la muestra es necesario para la colocación de la larva para evitar su contacto con el plano etapa.
    2. Ajuste la etapa de la muestra para mover el tubo de corazón de la mosca de la fruta con el plano focal del haz de formación de imágenes. Para encontrar fácilmente el segmento A7, encontrar la región posterior del tubo de corazón con la cruz en tiempo real imágenes OCM seccionales en el software de adquisición de imágenes. A continuación, pasar la etapa hacia adelante hasta que el segmento A7 es visible.
    3. Ajustar los parámetros del software de adquisición de imágenes a 100 A-scan por B-scan (marco), 100 B-scan y la scannetensión de r para cubrir ~ 0,28 mm en la dirección-x, transversal y 0 V en la dirección y-transversal. Haga clic en el botón "Inicio" en el software para adquirir los datos de ruido de fondo para la sustracción del fondo mediante el bloqueo de la trayectoria del haz de muestra con un paño oscuro.
      NOTA: 3 de los 100 marcos se pueden utilizar para la sustracción de fondo.
    4. Ajustar los parámetros del software de adquisición de datos de hasta 128 A-scan por B-scan, B-scan 4096, y la tensión de escáner para cubrir ~ 0,28 mm en la dirección transversal-x, y 0 V en la dirección y-transversal. Haga clic en el botón "Inicio" en el software para adquirir las imágenes transversales de modo M en todo el segmento del tubo A7 corazón de exclusión aérea sobre una región que cubre 0,28 x 0,57 mm 2 durante unos 30 segundos.
    5. Bloquear el haz de formación de imágenes usando un paño oscuro durante el proceso de almacenamiento de datos para evitar la exposición prolongada del corazón de la mosca de la luz de imagen.
    6. Repita la medición para 5 veces para obtener una medición fiable de la diversión del corazóncción.
    7. Ajustar los parámetros del software de adquisición de imágenes a 400 A-scan por B-scan, 800 B-scan, y el voltaje del escáner para cubrir ~ 1,7 mm en la dirección transversal-x, y ~ 4 mm en la dirección y-transversal. Mover la etapa en ambas direcciones para asegurar la totalidad de la mosca de la fruta se pueden obtener imágenes. Haga clic en el botón "Inicio" en el software de adquirir un conjunto de datos para obtener imágenes de la mosca de la fruta en 3 dimensiones. Nota: La estructura de la mosca 3D se puede representar usando el software Amira 3D
    8. Use un cepillo suave húmedo para humedecer la mosca medido y suavemente sacarlo de la placa de vidrio. Moverlo a un tubo separado para el desarrollo continuo. Etiquetar el tubo para el estudio longitudinal a través de las siguientes etapas de desarrollo.
  3. Imagen de Drosophila en pupa
    NOTA: Todas las moscas de la fruta fueron llevados a cabo para obtener imágenes de PD1 a PD5. Como se muestra en el esquema larva en la Figura 1b, una amplia lumen permanece en A5 a segmentos A8 de THtubo cardíaco e hasta que PD1. De PD2, una cámara cónica comienza a desarrollarse entre A1 a A4 segmentos. Para obtener imágenes coherentes y facilitar el análisis del corazón, imágenes en modo M transversales se obtuvieron del segmento A7 en PD1, y desde el segmento A1 después de PD2, como está marcado en la figura 1b.
    1. Imagen de Drosophila en PD1
      NOTA: Drosophila tendrá un pupario blanco para una ventana de tiempo corto (por 0 - 1 hr) durante PD1. Esta ventana de tiempo es ideal para la realización de imágenes ópticas de pupa antes de tiempo porque la alta transparencia conduce a una mayor penetración de la luz para la formación de imágenes OCM.
      1. A medida que las moscas de la fruta se encuentran en la pared del tubo cuando se convierten en pupa, retire la pupa de tubos individuales para la formación de imágenes en PD1 con un cepillo suave húmedo y limpiar la pupa con el cepillo si hay comida pegados al cuerpo.
      2. Montar la mosca de la fruta en una pequeña placa de vidrio directamente con el pincel mojado y mantener el lado dorsal hacia arriba (Figura 1a
      3. Eliminar el exceso de agua desde el lado del cuerpo de la mosca.
      4. Ponga la placa de vidrio en la etapa de la muestra del sistema OCM, manteniendo la mosca de la fruta en la parte superior. Encuentra imagen clara en tiempo real del segmento A7 del corazón mosca utilizando la misma estrategia descrita en la medición larva.
      5. Establecer los mismos parámetros del software de adquisición de datos como en la sección 3.2, y la imagen de los latidos del corazón en el segmento A7 para adquirir modo M transversal y las imágenes en 3D.
      6. Después de la impresión, utilice una pinza para colocar el portaobjetos de vidrio con pupa en el tubo de cultivo continuo.
    2. Imagen de Drosophila en PD2 a las etapas PD5
      NOTA: Como la muestra se vuelve más y más opaca durante las etapas de pupa, se reducirá la profundidad de penetración del sistema de imagen.
      1. Utilice unas pinzas para retirar con cuidado el vaso slide montado con la mosca en PD2 desde el tubo para la imagen. En PD2, la cáscara espécimen vuelve amarillenta y el cuerpo se vuelve menos transparente en comparación con PD1 (Figura 1).
      2. Ponga el cursor en la etapa de la muestra del sistema OCM.
      3. Ajuste la etapa de la muestra para mover la mosca en el plano focal del haz de formación de imágenes del sistema OCM. Encuentra el extremo anterior del tubo cardíaco imagen OCM de la sección transversal en tiempo real con. Mueva ~ 50 micras en la dirección posterior para encontrar el segmento A1 del tubo del corazón.
        NOTA: En este punto del desarrollo del corazón (PD2), la cámara cónica será muy pequeña y no se puede vencer.
      4. Recoger transversales modo M conjuntos de datos del segmento A1, así como datos en 3D utilizando el mismo método que las etapas de desarrollo anteriores.
      5. Ponga la corredera hacia atrás en el tubo cuidadosamente para cultivo continuo.
        NOTA: En PD3, el color de la muestra en la cáscara es más oscuro que en la etapa PD2. En la etapa PD4, rayas negras can ser observado dentro de la cáscara de los especímenes. Algunas moscas se convertirán en adultos a partir de esta etapa del día siguiente, mientras que otros van a evolucionar en PD5. En la etapa PD5, rayas negras son aún ven más claramente en las moscas de la fruta. Estas moscas se convertirán en adultos en el día siguiente.
  4. Imagen de Drosophila en la etapa adulta
    NOTA: En la etapa adulta, las moscas hembras y machos se distinguen por el tamaño del cuerpo y el color de la parte inferior del abdomen. Las hembras adultas tienen un mayor tamaño, mientras que los machos son más pequeños y en la parte inferior del abdomen de color oscuro.
    1. Tome el tubo de salida de la incubadora cuando la mosca de la fruta se convierte en un adulto, y transferir la mosca adulta a un ~ 45 ml vial vacío.
    2. Sumerja el extremo absorbente (~ 1 cm de longitud, ~ 3 mm de diámetro) de una varita en la anestesia, poner la varita en el vial, y conecte el tubo con un racimo de algodón para mantener el extremo anestésico justo por debajo del algodón enchufado ya Anesthetize la marcha durante 3 minutos. La duración de la anestesia depende del tamaño de la marcha, y puede variar entre 2.5 hasta 3.5 min (por ejemplo: hombre de 2,5 min, hembra de 3 o 3,5 min).
    3. Preparar un portaobjetos de vidrio con un trozo de cinta de doble cara.
    4. Mover la mosca anestesiadas en el portaobjetos de vidrio con el lado dorsal hacia arriba usando el cepillo suave.
    5. Se separan las alas utilizando unas pinzas y se adhieren las alas de la cinta bajo un microscopio para fijar la marcha y exponer la región del corazón para la imagen.
    6. La imagen de la mosca del segmento A1 de la mosca del corazón (Figura 1). Al final del experimento, la marcha puede ser sacrificado.

4. Análisis de imágenes 16

  1. Desarrollar programas de Matlab para convertir los archivos binarios en 2D y 3D recogidos con el software de adquisición de imágenes en archivos de imagen.
  2. ImageJ utilizar para identificar la región del tubo del corazón en las imágenes transversales de modo M y un algoritmo de varita mágica para conformarea máscara de la región del corazón de cada imagen en modo M transversal para. Segmento de la región enmascarada y utilizar un algoritmo de pico de investigación para identificar las ubicaciones sistólica y diastólica. Calcular los cambios de diámetro corazón dependientes del tiempo a partir de las imágenes transversales de modo M.
  3. Sobre la base de los diámetros del corazón dependientes del tiempo adquirido, el cálculo de los parámetros cardíacos tales como recursos humanos, período de actividad cardíaca (PAC), extremo de diámetro diástole (EDD), el diámetro final de sístole (ESD), extremo área de la diástole (EDA), y terminar área sístole ( ESA). Calcular la fracción de acortamiento (FS) con Ecuación 1
  4. ImageJ utilizar para analizar las imágenes 3D OCM para visualizar el desarrollo estructural del corazón mosca.

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Representative Results

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La imagen cardiaca longitudinal se llevó a cabo utilizando las moscas de la fruta con el 24B-GAL4 + cepa / a temperatura ambiente con OCM. Las mediciones se realizaron a L2, L3, y cada 8 hr de PD1 a PD4, y de día para adultos 1 (AD1) para realizar un seguimiento del proceso de la metamorfosis (Tabla 1). Larva, pupa temprana, pupa y adulto finales de moscas fueron montados en las placas de vidrio como se ve en la figura 1A. Las características del segmento del corazón para las moscas larvas y adultos se muestran en las representaciones esquemáticas de la figura 1B.

En este estudio de desarrollo, 4.096 cuadros fueron adquiridos en 32 segundos con nuestro sistema OCM personalizado para rastrear el latido del corazón de una mosca de la fruta. Para mejorar la precisión de la medición, se tomaron cinco mediciones repetidas para cada muestra en cada etapa de desarrollo. datos 3D se pueden obtener también a observar los cambios en la estructura del corazón durante la metamorfosis.

Transversal en modo M y las imágenes 3D se c reated con los programas y ImageJ Matlab personalizados. En imágenes de la cara y las secciones axiales también se construyen a partir de los datos adquiridos para visualizar el proceso de remodelación del corazón durante la metamorfosis Drosophila (Figura 2). Para cuantificar la función cardíaca de moscas de la fruta, la región del corazón fue segmentada de forma automática mediante un programa Matlab personalizado a partir de los 4096 marcos. La mosca de la frecuencia cardíaca (FC) se puede cuantificar a partir de las imágenes OCM transversal en modo M (Figura 3a). Durante las etapas de pupa, el corazón deja de latir Drosophila ocasionalmente 16. Hemos introducido un nuevo parámetro de la función cardíaca, período de actividad cardíaca (PAC) para cuantificar la relación entre el período de un latido del corazón con el tiempo total de imágenes (Figura 3b). EDD, EDS, EDA, ESA, y FS también se utiliza para cuantificar los cambios en las dimensiones de la cámara del corazón, tanto axiales y transversales durante el desarrollo de Drosophila. dieciséis

contenido "> En etapas larvales, el tubo del corazón empieza en el posterior A8 región abdominal con un lumen más amplios (A5 - A8 en la Figura 1B) y termina en el anterior A1 segmento dorsal con un diámetro más estrecho (T3 / A1 - A5 en la Figura 1B ). la cámara del corazón se encuentra medial y dorsal y se hizo más grande durante la L2 (Figura 2 a, b) y L3 (Figura 2 c, d). Después de entrar en PD1, se observó el tubo del corazón que funciona axialmente sobre la parte superior de un aire que se mueve burbuja (Figura 2 e, f) Alrededor de 10 -. 13 horas más tarde, la burbuja desapareció después de la formación pupario y las amplias lumen se convirtió evertido Puesto que el tubo del corazón anterior se encuentra ventralmente, todo el tubo de corazón era invisible excepto la región posterior en el. . imágenes OCM ~ 12 horas después de la formación pupario Más tarde, durante PD2, la cámara del corazón alineados gradualmente a lo largo del abdomen dorsal, y la parte posterior (A6 - A8) del corazón fue eliminado (Figura 2 g, h) 42,43. Una cámara cónica comenzó a desarrollar ~ A1 - A4 segmento durante PD2 y creció en tamaño hasta la etapa adulta (Figura 2 i - m).

Además de la observación de los cambios estructurales, se han encontrado muchos cambios funcionales, así durante la remodelación cardiaca. Las imágenes en modo M que se muestran en la Figura 3 demuestran que el latido del corazón se ralentizó significativamente de la fase larvaria a la fase de pupa, y luego aumentó sustancialmente de pupa a adulto. No se observaron cambios significativos de recursos humanos durante el ciclo de vida (Figura 4a). Además, se analizó el periodo de actividad cardíaca (CAP) para todas las muestras medidas a partir de L2 a AD1 (Figura 4b). Como se muestra en la Figura 4, HR se mantiene en ~ 277 latidos por min (bpm) para L2 y L3. Al entrar en las primeras etapas de pupa hay una marcada disminución de la FC y de la PAC. HR se reduce a 86 ± 11 bpm en el comienzo de PD1, y continúa disminuyendo a 26 ± 8 bpm por el correond de PD1, finalmente, llegar a una parada completa a principios de PD2. Un descubrimiento interesante es el largo período de inactividad cardiaca observada en torno etapa PD2 (~ 24 h - 48 h después de la formación pupario), se refirió a diastalsis desarrollo como cardiaca 16. Al final de PD2, lento latido intermitente reanuda (HR 17 lpm ± 6 con CAP 5 ± 2). A lo largo de PD3 y PD4, recursos humanos y aumento de la PAC hasta llegar a 392 ± 32 lpm y 95 ± 3% en el primer día de la etapa adulta (5 días después del inicio de la fase de pupa).

Figura 1
Figura 1. Montaje de Drosophila en diferentes etapas y Representación esquemática de la metamorfosis del corazón. (a) Montaje de la larva, pupa y adulto WT (24B-GAL4 / +) vuela sobre portaobjetos de vidrio. (b) Representación esquemática de la metamorfosis corazón. Las flechas rojas en larva y adulto schematic designar los lugares de formación de imágenes OCM modo M hasta PD1 24 horas y para los puntos de tiempo posteriores, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Cambios morfológicos de Drosophila corazón. En la cara y las imágenes OCM en sección axial de un Drosophila WT obtenido en (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 y (k, m) adulto etapas. Imágenes en modo M del corazón Drosophila se obtuvieron del segmento A7 hasta PD1 y de segmento A1 para las etapas posteriores. Las barras de escala en la cara y en axiales imágenes seccionales denotan 200 micras y 500 micras, respectively. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Cambios funcionales Drosophila corazón. (a) las imágenes en modo M en diferentes etapas de desarrollo de recursos humanos que muestran los cambios en todo el ciclo de vida. (b) Los ejemplos que demuestran período de actividad cardíaca (PAC) de cálculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Análisis cuantitativo del parámetro cardiaco funcionals en el documento WT vuela en diferentes etapas de desarrollo, incluyendo L2, L3, pupa a intervalos de 8 horas, y AD1. (a) de Recursos Humanos. (b) CAP. La barra de error de cada grupo representa la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El grado de desarrollo
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 hr 16 horas 24 hr 32 hr 40 hr 48 hr 56 hr 64 horas 72 hr 80 hr 88 hr
Número de muestras 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

Tabla 1. Número de WT moscas de la fruta, medidas en diferentes etapas de desarrollo en el estudio del desarrollo cardíaco.

video 1
Vídeo 1. Seguimiento del latido del corazón Junto Temporal Dimensión y el correspondiente cambio de diámetro Heart Chamber lo largo de la (dirección axial) z Dirección en un WT vuelan en L2. El corazón le latía con relativa rapidez a un ritmo constante. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.) p>

video 2
2. Seguimiento de vídeo de latido del corazón a lo largo de la dimensión temporal y el cambio correspondiente diámetro de la cámara a lo largo del Corazón (dirección axial) z Dirección en un WT vuelan a PD1. El HR comenzó a disminuir. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

video 3
Vídeo 3. Seguimiento del latido del corazón a lo largo de la dimensión temporal y el cambio correspondiente diámetro de la cámara del corazón a lo largo de la dirección Z (dirección axial) en un WT vuelan a PD2. El corazón dejó de latir por completo durante el tiempo. La oscilación de z de diámetro trazado era debido al ruido de imagen. target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

vídeo 4
Vídeo 4. Seguimiento del latido del corazón a lo largo de la dimensión temporal y el cambio correspondiente diámetro de la cámara del corazón a lo largo de la dirección Z (dirección axial) en un WT vuelan de PD4. Después de PD2, la AR y PAC comenzaron a aumentar. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Video 5
5. Seguimiento de vídeo del latido del corazón a lo largo de la dimensión temporal y el cambio correspondiente diámetro de la cámara del corazón a lo largo de la dirección Z (dirección axial) en un WT mosca en AD1. El HR fue el más alto entre todas las etapas y CAP fue de casi el 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

Video 6
Vídeo 6. Representación 3D estructural de una mosca larvas. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo. (Haga clic aquí para descargar.)

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El rápido latido del corazón de Drosophila, con una frecuencia cardíaca máxima alrededor de 400 latidos por minuto en las etapas de larvas y adultos, requiere una alta velocidad de imágenes para resolver los diástole del corazón y sístole (no menos de 80 cuadros / seg sobre la base de experiencias). Debido al pequeño tamaño de la cámara del corazón y micras espesor de la incrustación pared del corazón (5-10 micras), una alta resolución espacial (mejor que 2 micras) se requiere para la resolución de las estructuras de tubo corazón. En este estudio, se ha desarrollado un sistema OCM velocidad ultra alta resolución y, cuando se utilizaron un espectrómetro de transmisión con 600 líneas / mm rejilla y una cámara de líneas 2.048 píxeles. Una tasa de A-scan de 20 kHz es proporcionada por la cámara de líneas. La velocidad de fotogramas de 128 cuadros / seg es lo suficientemente rápido para capturar el latido del corazón de Drosophila en múltiples etapas de desarrollo, incluyendo L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 y adulto. La fuente de luz era una fuente de luz supercontinuo amplio ancho de banda con una longitud de onda central y ancho de banda de ~ 800 nm y ~220 nm, respectivamente, y obtiene una resolución axial de ~ 1,3 micras en el tejido. Un objetivo de 10X se utilizó en el brazo de muestra para realizar una resolución transversal de ~ 3,9 micras. Puesto que el tubo corazón de Drosophila es de alrededor de 200 micras debajo de la superficie dorsal, se requiere una profundidad de imagen de cientos de metros micras. Un espejo varilla 45 ° puede ser utilizado para generar un haz de muestra anular y extender la profundidad de foco en el espécimen 44. La sensibilidad y 3 dB de roll-off se determinó que 96 dB y 600 micras, respectivamente, con el poder del brazo muestra de ~ 9 mW. Se utilizó un programa de ordenador a medida para controlar el sistema OCM y llevar a cabo las mediciones. Las imágenes cardíacas estructurales y parámetros funcionales obtenidos demuestran la viabilidad del uso de OCM para caracterizar cuantitativamente la morfología y función del corazón de Drosophila durante todo su ciclo de vida.

Actualmente, varias otras técnicas también se utilizan para una imagen pequeñaanimales de la estructura del corazón o función, como la tomografía computarizada (TC), resonancia magnética (MRI) y ultrasonido. OCM proporciona resoluciones espaciales y temporales más altas que estas técnicas, que permite la visualización de las estructuras finas y dinámica rápida en corazones de animales. La microscopía confocal es otra técnica de imagen ampliamente utilizado, pero su penetración de imágenes de baja y requisición de agentes de contraste de imagen limita sus aplicaciones en animales vivos. Comparativamente, el OCM permite una alta velocidad y de imagen libre de etiquetas para visualizar la dinámica cardiaca rápida no invasiva en animales pequeños. Sin embargo, todavía hay limitaciones de OCM. Por ejemplo, la profundidad de formación de imágenes proporcionado por OCM se limita por dispersión de luz de varios cientos de micras a aproximadamente 1 mm en el tejido mientras que el ultrasonido tiene profundidades de penetración de hasta 10 cm. En comparación con la microscopía confocal, OCM tiene una velocidad más alta y una mejor profundidad de imagen, pero con menor resolución y contraste molecular pobres. Además, nuestro sistema OCM actual es based en los sistemas de detección de dominio espectral. La velocidad de exposición superior basado en código barrido OCM 45 puede proporcionar imágenes más distintas de las dinámicas rápidas como el latido del corazón.

Para realizar el estudio longitudinal de los latidos del corazón en Drosophila con OCM, hay varios pasos críticos en el protocolo. Las moscas se deben manejar con mucha delicadeza en todas las fases del experimento. La gestión de la larva debe ser especialmente suave, ya que es fácil dañar la larva, lo que podría afectar a la estructura y función del corazón en las siguientes etapas de desarrollo. Las moscas deben ser posicionados en el vidrio de cubierta y la etapa de formación de imágenes muy precisa. Moscas mal posicionado harán que sea difícil adquirir imágenes de calidad y puede causar valores de los parámetros estructurales y funcionales del corazón sesgadas. Además, la transferencia de las moscas adultas de un tubo a otro y de conectar la bola de algodón debe ser muy rápido para evitar su escape desde el tubo.

Diferentes estudios sobreEl desarrollo del corazón Drosophila se puede realizar mediante la modificación del protocolo. La temperatura a la que las moscas son cultivadas puede ser aumentado o disminuido de 25 ° C para alterar el nivel de expresión de genes cardiacos y cambiar el período de desarrollo de la mosca. Mediante la adición de algunos ingredientes, tales como aceite de coco o ATR a la comida estándar, el desarrollo del corazón puede ser alterado. Estudios específicos pueden llevar a cabo en el tipo salvaje o moscas transgénicas. Al estudiar el desarrollo del corazón mosca de la fruta en sentido longitudinal, diferentes intervalos de tiempo pueden ser utilizados para realizar las mediciones OCM, por ejemplo, un intervalo de 8 horas podría ser utilizado durante las etapas de pupa. Debido a la limitada sensibilidad de nuestro sistema OCM, un montón de ruido de moteado uniforme se encuentra en las imágenes transversales de modo M, que pueden hacer que sea difícil identificar correctamente las señales de contracción del corazón con los programas Matlab y disminuir la eficacia del análisis de datos. La sensibilidad puede ser aumentada mediante la mejora de la alineación del sistema OCM. algoritmos de filtrado optimizadosse recomiendan para eliminar una parte de las motas.

El protocolo descrito se ha aplicado para estudiar el silencio de ortólogos circadianos humanos, dCry y dCLOCK defectos cardíacos inducidos en Drosophila. Se observaron los CRI disminuido en las diferentes etapas del desarrollo, incluyendo la larva, pupa y adulto 15,16. El papel de los genes circadianos en el desarrollo del corazón fue revelado, lo que puede explicar la asociación entre los trastornos cardiovasculares y los patrones de actividad relacionados con el ritmo circadiano. Alto contenido de grasa-dieta (HFD) Trastornos cardíacos inducidos también fueron estudiados mediante el análisis de los cambios funcionales del corazón de moscas de la fruta alimentados con HFD 15. Estos estudios demostraron no sólo Drosophila como una poderosa herramienta en el estudio del desarrollo de la estructura y función del corazón, pero también el significado de estudio longitudinal cardiaca en la comprensión de enfermedades humanas congénitas y postnatales. La plataforma OCM permitirá una amplia gama de estudios futuros in gen relacionado con la enfermedad cardiaca humana.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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<em>Drosophila</em> Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca <em>in vivo</em> utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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