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Biology

Drosophila Preparación e Imagen longitudinal de la función cardiaca in vivo utilizando microscopía de coherencia óptica (OCM)

Published: December 12, 2016
doi:
10.3791/55002
, , , , , , , ,
1Bioengineering Program,Lehigh University, 2Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University, 3Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 4State Key Laboratory of Software Engineering,Wuhan University, 5Genetics and Aging Research Unit, Department of Neurology,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

Summary

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Abstract

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Introduction

Estudio longitudinal del corazón en animales pequeños contribuye a la comprensión de una variedad de enfermedades cardiovasculares relacionadas humanos, tales como defectos cardíacos congénitos relacionados con el gen 1,2. En las últimas décadas, diversos modelos animales, tales como 3,4 ratón, Xenopus 5,6, 7,8 pez cebra, aviar 9, y Drosophila 10-16, se han utilizado para llevar a cabo el corazón-desarrollo humano investigación relacionada. El modelo de ratón se ha utilizado ampliamente para estudiar el desarrollo cardíaco normal y anormal y fenotipos defecto cardíaco debido a sus similitudes con el 3,4 corazón humano. El embrión de Xenopus es especialmente útil en el estudio del desarrollo del corazón debido a su fácil manejo y 5,6 transparencia parcial. La transparencia del embrión y la larva temprana del modelo de pez cebra permite la observación óptica fáciles de 7,8 desarrollo cardíaco. El modelo aviar es un tema común de los estudios del desarrollo del corazón because el corazón se puede acceder fácilmente después de la eliminación de las cáscaras de huevo y la similitud morfológica de los corazones de aves a los seres humanos 9. El modelo de Drosophila tiene algunas características únicas que la hacen ideal para la realización de estudios longitudinales del corazón. En primer lugar, el tubo de corazón de Drosophila es de ~ 200 micras debajo de la superficie dorsal, que proporciona la conveniencia para el acceso óptico y la observación del corazón. Además, muchos mecanismos moleculares y las vías genéticas se conservan entre Drosophila y vertebrados. Los ortólogos de más del 75% de los genes de enfermedades humanas fueron encontradas en Drosophila, que han hecho que sea ampliamente utilizado en estudios transgénicos 11,13. Además, tiene un ciclo de vida corto y bajos costes de mantenimiento, y se ha utilizado comúnmente como un modelo ejemplar para la investigación de la biología del desarrollo 14-16.

En informes anteriores se describen los protocolos para el control de las funciones cardíacas Drosophila como la queArtbeat. Sin embargo, se requieren procedimientos de disección 17,18. de formación de imágenes óptico proporciona una forma eficaz de visualizar el desarrollo cardiaco en animales debido a su naturaleza no invasiva. Las diferentes modalidades de imágenes ópticas se han aplicado en la realización del estudio cardiaco de animales, tales como la microscopía de dos fotones 19, microscopía confocal 20,21, microscopía de luz de hoja 22, y la tomografía de coherencia óptica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, la OCT es capaz de proporcionar una gran profundidad de imagen en pequeños corazones de animales sin el uso de agentes de contraste, mientras se mantiene una velocidad de filmación de una ultra alta resolución y, que son importantes para los animales vivos de imagen. Además, el bajo costo de desarrollar un sistema de La OCT ha popularizado esta técnica para la formación de imágenes ópticas de las muestras. Octubre ha sido utilizado con éxito para el estudio longitudinal de Drosophila. OCT, imágenes morfológicas y funcionales cardiaca se ha realizado el estudio de las estructuras del corazón, la funcpapeles cionales de genes, y los mecanismos de defectos cardiovasculares en los modelos de mutantes durante el desarrollo cardiaco. Por ejemplo, disminución de la función cardiaca dependiente de la edad se confirmó con genes regulados hacia abajo-convertidora de angiotensina relacionados con enzimas (ACER) en Drosophila mediante OCT de 27. Fenotipificación de miocardiopatía relacionado con el gen se demostró en Drosophila en OCT 28-33. Investigación en OCT también reveló el papel funcional del gen SOX5 humana en el corazón de Drosophila 34. En comparación con los PTU, OCM utiliza un objetivo con una apertura numérica más alta para proporcionar una mejor resolución transversal. En el pasado, la disfunción del corazón causada por el silenciamiento de genes circadianos un ortólogo humano dCry / dCLOCK se ha estudiado el uso de un sistema OCM personalizada 15,16, así como el efecto de alto contenido de grasa en la dieta-miocardiopatías en Drosophila para entender la obesidad inducida por el hombre enfermedades cardíacas. 15

Aquí, THe protocolo experimental se resume para el estudio longitudinal de los cambios morfológicos y funcionales cardíacos en Drosophila en segundo instar (L2), tercer estadio (L3), pupa día 1 (PD1), pupa día 2 (PD2), pupa día 3 (PD3) , pupa día 4 (PD4), el día 5 de pupa (PD5) y adulto (figura 1) el uso de OCM para facilitar el estudio de las enfermedades cardiacas congénitas relacionadas con el hombre. parámetros funcionales cardíacos, tales como recursos humanos y CAP se analizaron cuantitativamente en diferentes etapas de desarrollo para revelar las características de desarrollo cardiacos.

Protocol

1. Preparación del sistema OCM de Imagen Óptico de Drosophila 16 Seleccionar un espectrómetro y una cámara de exploración de líneas de alta velocidad que proporciona una velocidad de al menos 80 cuadros / seg por lo que el sistema OCM será capaz de resolver el latido del corazón de Drosophila. Utilice una fuente de luz de banda ancha para garantizar una resolución axial de 2 micras para identificar la estructura del corazón de Drosophila. Uti…

Representative Results

La imagen cardiaca longitudinal se llevó a cabo utilizando las moscas de la fruta con el 24B-GAL4 + cepa / a temperatura ambiente con OCM. Las mediciones se realizaron a L2, L3, y cada 8 hr de PD1 a PD4, y de día para adultos 1 (AD1) para realizar un seguimiento del proceso de la metamorfosis (Tabla 1). Larva, pupa temprana, pupa y adulto finales de moscas fueron montados en las placas de vidrio como se ve en la figura 1A. Las características del segmento del corazón para las moscas…

Discussion

El rápido latido del corazón de Drosophila, con una frecuencia cardíaca máxima alrededor de 400 latidos por minuto en las etapas de larvas y adultos, requiere una alta velocidad de imágenes para resolver los diástole del corazón y sístole (no menos de 80 cuadros / seg sobre la base de experiencias). Debido al pequeño tamaño de la cámara del corazón y micras espesor de la incrustación pared del corazón (5-10 micras), una alta resolución espacial (mejor que 2 micras) se requiere para la resolución…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-Up Fund, the NIH (R00EB010071 to C.Z., R15EB019704 to C.Z. and A.L., R03AR063271 to A.L., and R01AG014713 and R01MH060009 to R.E.T.), the NSF (1455613 to C.Z. and A.L.), the Cure Alzheimer’s Fund (to R.E.T.), and the Massachusetts General Hospital (Executive Committee on Research Award to A.L.). M.C. and Y.M. was supported by the National Key Basic Research Program of China (973 Program) under Grant No. 2014CB340404.

Materials

Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
Image J National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500
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References

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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).
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